小麦粒重主效基因位点QGw.nau‑4B的分子标记引物及其应用

摘要

本发明公开了小麦粒重主效基因位点QGw.nau‐4B的分子标记引物及其应用。小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记引物，分子标记引物WGRC1334‐F序列如SEQ ID NO.1所示，WGRC1334‐R序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记引物WGRC1083‐F序列如SEQ ID NO.3所示，WGRC1083‐R序列如SEQ ID NO.4所示。用标记WGRC1334和WGRC1083的引物检测QGw.nau‐4B基因，可以确定QGw.nau‐4B的存在与否以及存在状态，并预测小麦的粒重特性，进而快速筛选携有QGw.nau‐4B的植株并用于小麦品种的改良。

说明书

技术领域

本发明属于作物育种学领域，涉及小麦粒重主效基因位点QGw.nau-4B的分子标记引物及其应用。

技术背景

小麦是最早被人类驯化的粮食作物之一，提供全球人口五分之一的能量摄入。提高小麦产量一直是小麦育种的最主要目标。小麦产量最终是由亩穗数、单穗粒数以及粒重决定。在高产栽培条件下，由于穗数和单穗粒数收到限制时，粒重是影响产量的主要因素，增加粒重成为提高小麦产量潜力的关键。在过去的一个世纪中，不管是在中国还是其他国家，在新培育的品种中粒重都得到了显著的增加。高粒重品种的选育和应用是提高小麦产量的有效方法。粒重基因的发掘是高产育种的前提和基础，而开发与粒重基因紧密连锁的分子标记更是应用粒重基因的关键。

目前小麦对粒重的研究主要集中在QTL定位及精细定位阶段。利用重组自交系、双单倍体及回交群体等不同定位群体，在小麦21染色体上已经监测到超过110个控制粒重的QTL。其中位于4B染色体上的粒重QTL存在于许多种质中，效应较强，并且在多个环境下表现较稳定(McCartney et al 2005；Wang et al 2011；Peleg et al 2011；Jia et al 2013；Xie et al 2015)。此外，Guo et al(2015)通过关联分析在自然群体中也检测到了4B染色体上的粒重QTL。

小麦粒重性状属于数量性状，在产量构成要素中受遗传特性的影响最大，其遗传主要受加性效应基因控制，广义遗传率高达59％-80％，因而对粒重可以进行比较有效的遗传选择。尽管粒重遗传力最高，所受环境影响相对于其它二者较小，但在实际生产中，即使是同一品种，在不同年份、不同环境条件下，千粒重也会出现较大差异。分子标记辅助选择育种与传统育种相比，可以通过目标基因型进行选择，不受基因表达及环境条件的影响，能够提高选择的准确性，从而加快育种进程(Collard and Mackill 2008)。连锁累赘影响目标基因在育种中的选择，因此有必要开发与目标基因更紧密连锁的分子标记，减少选择时的连锁累赘，提高对粒重基因的应用效率。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供与小麦粒重主效基因位点QGw.nau‐4B更加紧密连锁的分子标记方法及分子标记引物。

本发明的另一个目的是提供该小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记引物的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记，用标记引物WGRC1334‐F：SEQ IDNO.1，WGRC1334‐R：SEQ ID NO.2扩增小麦品种基因组DNA，获得的扩增片段为220bp，即为小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B连锁的的分子标记WGRC1334，该标记为共显性标记，与QGw.nau‐4B紧密连锁；

用标记引物WGRC1083‐F：SEQ ID NO.5，WGRC1083‐R：SEQ ID NO.6扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为265bp，即为小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B连锁的分子标记WGRC1083，该标记为共显性分子标记，与QGw.nau‐4B紧密连锁。

小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记方法，分别用上述的两对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能够扩增出220bp的扩增片段，同时用分子标记WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R能够扩增出265bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在粒重主效基因QGw.nau‐4B。

小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记引物，分子标记引物WGRC1334‐F序列如SEQ ID NO.1所示，WGRC1334‐R序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记引物WGRC1083‐F序列如SEQ ID NO.3所示，WGRC1083‐R序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的分子标记引物在小麦种质资源中粒重主效基因QGw.nau‐4B的鉴定中的应用。

本发明所述的分子标记引物在筛选高千粒重小麦中的应用。

本发明所述的应用优选：利用所述的分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能够扩增出220bp的扩增片段，并且用分子标记WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R扩增出265bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在粒重主效基因QGw.nau‐4B的具有高千粒重潜力的小麦。

有益效果：

本发明提供了与QGw.nau‐4B紧密连锁的分子标记WGRC1334和WGRC1083的引物，可以加速粒重主效基因QGw.nau‐4B在小麦高产育种中的应用。

本发明获得了与QGw.nau‐4B紧密连锁的分子标记WGRC1334和WGRC1083。标记定位于QGw.nau‐4B两侧，遗传距离为1.3cM，物理距离53.6Mb，能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其它产量相关基因聚合。

2、鉴定方便。这两个分子标记都为共显性标记，其引物具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记WGRC1334和WGRC1083的引物检测QGw.nau‐4B基因，可以确定QGw.nau‐4B的存在与否以及存在状态，并预测小麦的千粒重特性，进而快速筛选携有QGw.nau‐4B的植株并用于小麦品种的改良。

3、提高品种改良的选择鉴定效率，节约成本。在传统的品种改良过程中，需要将不同品种或品系进行一系列杂交，在后代群体中选择稳定单株进行表型鉴定，需要多年多点的表型鉴定；并且粒重表型鉴定易受环境的影响，鉴定结果有一定的误差。因此品种的改良不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测与抗粒重主效基因QGw.nau‐4B紧密连锁的分子标记，可以将表型鉴定的工作大大减少，并且在苗期就可鉴定出携有粒重主效基因基因QGw.nau‐4B的单株，从而淘汰非目标植株。因此，利用通过检测与粒重主效基因QGw.nau‐4B紧密连锁的分子标记WGRC1334和WGRC1083，不仅节约育种成本，而且大大提高品种改良的选择效率。

4、减少连锁累赘。由于小麦的粒重性状往往和一些不良的其他农艺性状有一定的相关。在分子标记辅助育种中，由于QTL初步定位的区间比较大，致使选择导入的区间比较大，会造成连锁累赘。利用与粒重主效基因QGw.nau‐4B紧密连锁的分子标记可以减少选择时的连锁累赘，提高选择效率。

附图说明

图1 WGRC1334和WGRC1083与小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的遗传连锁图，右边为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离。

图2 WGRC1083扩增带型。M为PUC19/MspI，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为南大2419，2为温麦6号，3为QGw.nau‐4B近等基因系，4为不含QGw.nau‐4B近等基因系对照。箭头所指为特异扩增条带。

图3 WGRC1334扩增带型。M为PUC19/MspI，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为南大2419，2为温麦6号，3为QGw.nau‐4B近等基因系，4为不含QGw.nau‐4B近等基因系对照。箭头所指为特异扩增条带。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

小麦粒重主效基因QGw.nau‐4B的分子标记通过以下方法获得：

根据QGw.nau‐4B的边界标记Xgwm495和Xgwm149(Jia et al 2013)，利用公布的小麦基因组序列位于QGw.nau‐4B区段(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)和望水白BAC克隆序列开发的SSR分子标记对南大2419、温麦6号和望水白进行多态性筛选，最终得到2个在亲本间有多态的标记，即WGRC1334和WGRC1083这两个分子标记。

PCR反应体系为12.5μl，其中10×buffer 1.25μl，25mM MgCl₂>

PCR扩增程序为94℃预变性3min后，94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸8min；在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。

利用在亲本间有多态的分子标记WGRC1334和WGRC1083分析温麦6号背景的纯合重组体、近等基因系及其轮回亲本。结果表明WGRC1334和WGRC1083在遗传上分别与Xgwm495和Xgwm149共分离，物理距离为53.6Mb，分别位于Xgwm495和Xgwm149区间的内侧。

实施例2分子标记辅助QGw.nau‐4B区段转育提高小麦粒重

以温麦6号背景的纯合近等基因系基因组DNA作为模板，以两对分子标记引物PCR扩增并检测扩增产物，用分子标记WGRC1334的引物WGRC1334‐F和WGRC1334‐R能够扩增出220bp的扩增片段，并且用分子标记WGRC1083的引物WGRC1083‐F和WGRC1083‐R扩增出265bp的扩增片段，说明在近等基因系DNA中检测到QGw.nau‐4B区段。分子标记引物扩增带型见图2和图3。根据基因型，鉴定近等基因系及其受体亲本的粒重表型。结果表明，以温麦6号为对照，近等基因系百粒重得到显著提高(表1)。

表1含QGw.nau‐4B近等基因系和温麦6号在QGw.nau‐4B区段的基因型和表型

N代表南大2419基因型，W代表温麦6号基因型，CK代表对照温麦6号。^＊＊代表在P＝0.01水平上与对照温麦6号的百粒重表型差异显著。