法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-12-02
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N11/14 专利号:ZL2016111671051 申请日:20161214 授权公告日:20190628
专利权的终止
2019-06-28
授权
授权
2017-04-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N11/14 申请日:20161214
实质审查的生效
2017-03-15
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球制备方法,属于固定化酶的杂化微球技术领域。
背景技术
明胶微球是一种常用的固定化酶载体,其优点在于包埋条件温和,生物相容性好,有利于维持酶的结构完整性,进而提高酶的活性维持率。明胶微球固定化酶通常存在的问题是载体的孔径较大,酶分子容易泄露。微球易溶胀,机械强度差,循环使用稳定性和储存稳定性不高。解决问题的方法通常是在明胶微球中填充无机组分、或者在明胶微球外表面构造无机壳层,制备有机-无机杂化微球,以提高微球的机械性能,同时抑制酶分子的泄露,提高酶对温度、pH 变化的耐受性,同时提高储存和循环使用稳定性。
二氧化硅是有机-无机杂化材料中常见的无机组分,可用于制备杂化微球。Materials Science and Engineering C 62 (2016) 678–685公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法,其过程包括:将明胶溶解于乙醇/水混合体系中,并加入交联剂3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷,得到明胶溶液;将正硅酸乙酯、氯化钙和磷酸三乙酯混合,得到硅前驱体溶液;将明胶溶液与硅前驱体溶液混合,并倒入植物油中进行搅拌乳化,得到w/o型乳液;将乳液在-70℃下冷冻固化成型,并依次利用乙醇和丙酮进行洗涤,得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球的中位粒径D50值在124-276微米范围内。
仿生硅化为二氧化硅材料的制备提供了一条新途径,仿生硅化避免了酸碱催化的使用,制备简单,所用原料均具有很好的生物相容性,适用范围广。Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 35 (2004) 53–58公布了一种制备明胶-二氧化硅杂化微球的方法,其过程包括:将明胶固体溶解于pH5.0的去离子水中,得到明胶质量分数0.5-30%的明胶溶液;将硅酸钠固体溶解于去离子水中,得到硅酸钠质量分数为0.1-1.0%的硅酸钠溶液;在37℃下将明胶溶液与硅酸钠溶液混合,搅拌1小时,在20℃水浴中静置一天,得到明胶-二氧化硅杂化微球。此法所得的杂化微球粒径在50-350纳米范围内。
利用明胶仿生硅化过程制备明胶-二氧化硅杂化载体用于固定化酶具有良好的应用前景。发明专利CN201310425486.9公开了一种包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶及制备方法。该包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶,粒径为 3-4mm,在明胶核上包覆有氧化硅壳层。其制备方法过程包括:配制明胶及含有醇脱氢酶混合溶液;配制硅酸钠及戊二醛溶液前驱体混合溶液;将明胶及醇脱氢酶的混合溶液逐滴加入到 0~4℃ 的去离子水中,生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒,再经搅拌孵化得到包埋醇脱氢酶的明胶-二氧化硅杂化凝胶。
发明内容
本发明的目的在于通过将仿生矿化过程与膜乳化过程结合,提供一种以微孔膜渗透乳化制备固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法。以该方法所制得的明胶-二氧化硅杂化微球粒度均一、大小可控,用于固定过氧化氢酶,过氧化氢酶的泄漏率低,且耐酸碱环境能力强,储存稳定性好。
本发明是通过以下技术方案加以实现的,一种固定过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球的方法,该方法采用包括微孔膜组件的装置,以微孔膜渗透乳化过程为主加以实现的,其特征在于包括以下步骤:
1)在容器中,于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中,配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液,再向其中加入溶解过氧化氢酶,使过氧化氢酶浓度保持为0.1-2毫克/升,制得水相明胶/过氧化氢酶溶液;
2)在容器中,于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中,配制成含有司班-80质量浓度为0.25-4.0% 的液体石蜡油,称为油相;
3)按步骤1)制的水相明胶/过氧化氢酶溶液与步骤2)制的油相液体石蜡油的体积比为1:(2~15),在温度40℃-70℃及200-1200rpm速度下搅拌下,将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中,得到粗乳液;
4)将步骤3)制的粗乳液加入装配有膜孔径为3.5-10.2微米的微孔膜的膜乳化装置内,以20kPa-50kPa压力使粗乳液通过微孔膜腔,进入收集器后,再回加入膜乳化器中,如此循环2-10次,得到多级乳化的W/O型乳液;
5)以正硅酸乙酯与去离子水按摩尔比为1:(0.05-0.4)混合,并向该混合中,按催化剂盐酸与正硅酸乙酯摩尔比为(0.005-0.02):1加入盐酸,然后在室温下超声振荡直至得到澄清透明的溶液,再用去离子水稀释溶液至浓度20-150mM,并且用NaOH将稀释溶液的pH值调至6.0-8.0,得到正硅酸乙酯水解液;
6)在400rpm速度搅拌下,以步骤5)制得的正硅酸乙酯水解液与步骤4)制得的多级乳化W/O型乳液按体积比为1:(1.0-4.0),将多级乳化W/O型乳液加入正硅酸乙酯水解液中,加毕后在温度0℃-8℃冰水浴中,交联固化0.5-4小时后,再分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至去除油相为止,然后在空气中自然干燥得到用于固定化酶的明胶-二氧化硅杂化微球。
本发明提出的制备方法的优点在于:制备条件温和,制备工艺简单易行,明胶微球粒度均一,二氧化硅含量及壳层厚度可控,并且所得明胶-二氧化硅杂化微球对过氧化氢酶具有很好的固定能力,固定化过氧化氢酶的对酸碱耐受性能强,储存稳定性好。
附图说明
图1为实施例1制得的明胶微球的扫描电镜(SEM)照片。
图2为对比例1制备的明胶微球的扫描电镜(SEM)照片。
图3为实施例1制备的明胶-二氧化硅杂化微球与对比例1制备的明胶微球的热重分析曲线图。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是为了帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
膜乳化法制备固定化过氧化氢酶的明胶二氧化硅杂化微球:
向200转/分钟磁力搅拌、55℃的2毫升水中加入0.2克明胶干粉,维持此速度下磁力搅拌0.5小时,至明胶干粉完全溶解于水中,溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶0.2毫克,溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂0.3g司班-80加入到12毫升的液体石蜡中,以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟,至司班-80完全溶解,并将上述溶液加热至60℃作为油相。
将3毫升正硅酸乙酯与0.7毫升去离子水混合。加入0.2毫升0.1摩尔/升的盐酸为催化剂,然后用超声波清洗器在室温下超声直至得到澄清透明的溶液,然后用去离子水将上述溶液稀释至50mM,并且用0.5摩尔/升的NaOH溶液将pH值调至7.0,从而得到正硅酸乙酯水解液。
预乳化过程:按水相明胶/过氧化氢酶溶液与油相液体石蜡油的体积比为1:6,在温度550℃下,将水相明胶/过氧化氢酶溶液加入油相中,1600rpm速度下磁力搅拌得到粗乳液。
膜乳化过程:采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜(SPG微孔膜)。膜管直径为1厘米,长度为2厘米,膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至55℃的液体石蜡中30分钟,然后将微孔膜装入膜乳化装置中,膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的粗乳液加入膜乳化装置,通入氮气,在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器。将收集容器中过膜一次的乳液再次加入膜乳化器中,在50kPa压力下使粗乳液通过微孔膜进入收集容器。重复上述过程,直至过膜三次,得到多级乳化的W/O型乳液。
仿生矿化过程:将多级乳化的W/O型乳液,逐滴加入到18mL、浓度为50mM的正硅酸乙酯水解液中,期间保持磁力搅拌速度为400转/分钟,全部滴加完后,迅速置于4℃冰水浴中,交联固化2小时。结束后,分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除,然后在空气中自然干燥得到固定化酶的明胶微球。微球的平均粒径采用激光粒度仪进行测量,二氧化硅含量采用热重分析仪进行测量,二氧化硅壳层厚度采用透射电镜进行分析。明胶-二氧化硅杂化微球粒径、分布、二氧化硅含量见表1。
对上述过程制得的明胶-二氧化硅杂化微球固定过氧化氢酶在不同pH下的相对酶活力进行测定:
将30%过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释,配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液,加入对本对比例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球,在25℃,搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应,用紫外-可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量,计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力,并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值,将最适pH值下相对酶活力定义为100%。
将其他pH值下的酶活力与最适pH值下的酶活力对比,得到最适pH值为6.0,pH6.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比,pH3.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为60.6%;pH4.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为64.6%;pH5.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为67.7%;pH7.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为70.2%; pH8.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为76.7%;pH9.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为79.4%;pH10.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为55.9%。
对上述过程制得的明胶-二氧化硅杂化微球固定过氧化氢酶的储存稳定性进行测定:
将30%过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释,配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液,加入本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球,在25℃,搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应,用紫外-可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量,计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力,并以此酶活力为初始相对酶活力,定义为100%。
将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球存放一天后,重复上述反应过程,得到固定化过过氧化氢酶的酶活力,与初始活力相比,此时的相对酶活力为95.4%。将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球存放存放三天,六天,十天,十五天,二十一天,二十八天后重复上述反应过程,得到储存三天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为89.7%;储存六天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为87.0%;储存十天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为68.8%;储存十五天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为56.8%;储存二十一天的固定化过氧化氢酶的相对酶活力为51.7%。
实施例2
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:将采用的膜孔径为3.5微米的微孔膜改用膜孔径为10.2微米的微孔膜,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例3
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在制备过程中的温度由55℃改为40℃,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例4
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在制备过程中的温度由55℃改为70℃,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例5
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在膜乳化过程中将采用的50kPa的操作压力改变为20kPa的操作压力,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例6
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为20mM,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例7
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为90mM,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
实施例8
本实施例制备过程与实施例1相同,不同之处在于:在仿生矿化过程中将正硅酸乙酯水解液的浓度由50mM改变为150mM,制得明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小、分布及二氧化硅含量见表1。
对比例1
按照中国发明专利CN201510209087.8中实施例1所述方法,通过膜乳化法制备固定化过氧化氢酶的明胶微球:
向200转/分钟磁力搅拌、55℃的10毫升水中加入1克明胶干粉,维持此速度下磁力搅拌0.5小时,至明胶干粉完全溶解于水中,溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入过氧化氢酶1毫克,溶解后过氧化氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述过氧化氢酶/明胶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂1.5g司班-80加入到60毫升的液体石蜡中,以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟,至司班-80完全溶解,并将上述溶液加热至60℃作为油相。
膜乳化过程:采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜(SPG微孔膜)。膜管直径为1厘米,长度为2厘米,膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至60℃的液体石蜡中30分钟,然后将微孔膜装入膜乳化装置中,膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的水相明胶/过氧化氢酶溶液加入膜乳化装置,通入氮气,在5kPa压力下使水相溶液通过微孔膜进入磁力搅拌的60℃油相中,得到液滴均匀的W/O型乳液,搅拌速度为400转/分钟。将所得乳液继续在400转/分钟下磁力搅拌15分钟后,迅速置于4℃冰水浴中,加入交联剂戊二醛1mL,交联固化2小时。结束后,分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除,然后在空气中自然干燥得到固定化酶的明胶微球。
对上述过程制得的明胶微球固定过氧化氢酶在不同pH下的相对酶活力进行测定:
将30%过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释,配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液,加入对本对比例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球,在25℃,搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应,用紫外-可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量,计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力,并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值,将最适pH值下相对酶活力定义为100%。
将其他pH值下的酶活力与最适pH值下的酶活力对比,得到最适pH值为7.0,pH7.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比, pH4.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为12.3%;pH5.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为67.7%;pH6.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为95.8%; pH8.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为90.8%;pH9.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为26.1%;pH10.0时明胶微球固定化过氧化氢酶的相对酶活力为0。
将30%过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释,配成过氧化氢浓度为0.09mol/L的底物溶液,加入本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶-二氧化硅杂化微球,在25℃,搅拌的条件下进行催化过氧化氢分解反应,用紫外-可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量,计算得到固定化过氧化氢酶的酶活力,并以此酶活力为初始相对酶活力,定义为100%。
将本实施例制备的固定化过氧化氢酶的明胶微球存放一天后,重复上述反应过程,得到固定化过过氧化氢酶的酶活力,与初始活力相比,此时的相对酶活力为85.3%。将新鲜的游离过氧化氢酶溶液存放三天,六天,十天,十五天,二十一天,二十八天后重复上述反应过程,得到储存三天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为69.0%;储存六天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为40.5%;储存十天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为24.3%;储存十五天的游离过氧化氢酶的相对酶活力为3.5%;储存二十一天及二十八天的游离过氧化氢酶的相对酶活力完全丧失,为0%。
表1所示为实施例1-8测定的明胶-二氧化硅杂化微球粒径大小及分布、二氧化硅含量的对比结果。
机译: /制备纳米纤维明胶/二氧化硅杂化微球的方法和由此制备的纳米纤维微球
机译: /制备纳米纤维明胶/二氧化硅杂化微球的方法和由此制备的纳米纤维微球
机译: 生物杂化磁性微球的制备方法及生物杂化微球