五种根际促生菌在改善植物的农艺性状方面的应用

摘要

本发明提供了五种根际促生菌在改善植物的农艺性状方面的应用。具体地，本发明公开了一种根际促生菌的用途，用于制备农用制剂，所述农用制剂用于改善植物的农艺性状，其中所述的根际促生菌选自下组：黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合。本发明所述的五种菌及其组合分别能够(i)促进种子萌发；(ii)提高株高；(iii)促进根系发育(iv)增加叶面积；(v)增加分蘖数；(vi)提高产量，因此极具应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和育种领域，具体地，本发明涉及根际促生菌(黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas))在改善植物的农艺性状方面的应用。

背景技术

化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用。但是随着化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。农药和化肥的残留，向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源和食品。对人类分离及生存环境构成了极大威胁，要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。因此，开发利用替代化学肥料的新肥源，以适应发展绿色农业和绿色食品的已是当务之急。而微生物肥料可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途径，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一类能高密度定殖在植物根际的微生物，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用。作为生物肥料和生物农药的重要资源库，PGPR的研究和应用已经到了举足轻重的作用。然而，大部分的植物根际促生菌促进植物生长发育的效果并不明显，难以得到消费者认可；还有一些根际促生菌仅对一种或者几种植物才具有促生作用，从而难以得到推广应用。。

因此，本领域迫切需要开发植物根际促生菌，它不仅能够明显促进广谱植物的生长发育，还可以制备相应的农用制剂，广泛用于微生物肥料领域。

发明内容

本发明的目的就是提供五种植物根际促生菌，它们不仅能够明显促进植物生长发育，还可以作为农用制剂，广泛用于微生物肥料领域。

本发明第一方面提供了一种根际促生菌的用途，用于制备农用制剂，所述农用制剂用于改善植物的农艺性状，其中所述的根际促生菌选自下组：黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括黄色土源菌(Flavisolibacter)。

在另一优选例中，所述黄色土源菌(Flavisolibacter)选自下组：人参土黄色土源菌(Flavisolibacter ginsengisoli)、人参地黄色土源菌(Flavisolibacter ginsengiterrae)、Flavisolibacter rigui、Flavisolibacter sediminifilum、或其组合。

在另一优选例中，所述黄色土源菌(Flavisolibacter)选自下组：F.ginsengisoli GS643、F.ginsengiterrae GS492、F.rigui 02SUJ3、F.sediminifilum HU1-JC5、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括Ferruginibacter。

在另一优选例中，所述Ferruginibacter菌选自下组：Ferruginibacter alkalilentus、Ferruginibacter lapsinanis、Ferruginibacter yonginensis、Ferruginibacter paludis、Ferruginibacter profundus、或其组合。

在另一优选例中，所述Ferruginibacter菌选自下组：F.alkalilentus HU1-GD23、F.alkalilentus HU1-GB11、F.alkalilentus HU1-ID41、F.lapsinanis HU1-HG42、F.yonginensis HME8442、F.paludis HME8881、F.profundus DS48-5-3、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括伦茨氏菌(Lentzea)。

在另一优选例中，所述伦茨氏菌(Lentzea)选自下组：微白伦茨氏菌(Lentzea albida)、白丝伦茨氏菌(Lentzea albidocapillata)、加利福尼亚伦茨氏菌(Lentzea californiensis)、黄疣伦茨氏菌(Lentzea flaviverrucosa)、江西伦茨氏菌(Lentzea jiangxiensis)、肯塔基伦茨氏菌(Lentzea kentuckyensis)、紫色伦茨氏菌(Lentzea violacea)、威威达湖伦茨氏菌(Lentzea waywayandensis)、或其组合。

在另一优选例中，所述伦茨氏菌(Lentzea)选自下组：L.albida NA 944235、L.albida R10069、L.albidocapillata IMMIB D-958、L.albidocapillata 4.215、L.californiensis IMRU 550、L.flaviverrucosa 5-125、L.flaviverrucosa 174513、L.flaviverrucosa 6-4-7T、L.jiangxiensis FXJ1.034、L.kentuckyensis LDDC 2876-05、L.violacea LM 036、L.violacea CAS 5-124、L.violacea 173536、L.waywayandensis LL-37Z-15、L.waywayandensis 173919、L.waywayandensis173629、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)。

在另一优选例中，所述土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)选自下组：Solirubrobacter ginsenosidimutans、保尔氏土壤红色杆形菌(Solirubrobacter pauli)、Solirubrobacter phytolaccae、土壤土壤红色杆形菌(Solirubrobacter soli)、Solirubrobacter taibaiensis、或其组合。

在另一优选例中，所述土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)选自下组：S.ginsenosidimutans BXN5-15、S.pauli B33D1、S.phytolaccae GTGR-8、S.soli Gsoil 355、S.taibaiensis GTJR-20、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括土生单胞菌(Terrimonas)。

在另一优选例中，所述土生单胞菌(Terrimonas)选自下组：Terrimonas aquatica、Terrimonas arctica、绣色土生单胞菌(Terrimonas ferruginea)、藤黄色土生单胞菌(Terrimonas lutea)、Terrimonas pekingensis、Terrimonas rubra、或其组合。

在另一优选例中，所述土生单胞菌(Terrimonas)选自下组：T.aquatica RIB1-6、T.arctica R9-86、T.ferruginea 3576、T.lutea DY、T.pekingensis QH、T.rubra M-8、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括选自表6中的一种或多种。

在另一优选例中，所述的根际促生菌选自表6，且来自相同或不同的属。

在另一优选例中，所述改善植物的农艺性状包括：(i)促进种子萌发；(ii)提高株高；(iii)促进根系发育；(iv)增加叶面积；(v)增加分蘖数；(vi)提高产量。

在另一优选例中，所述提高产量包括提高植株的鲜重和/或干重。

在另一优选例中，所述的植物包括：禾本科、香蒲科、蕨科、菊科、唇形科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、伞形科、十字花科、报春花科、蓼科、藜科、石竹科、柳叶菜科、荨麻科、车前草科、杨梅科、桑科、大麻科、虎耳草科、蔷薇科、豆科、蕨科、堇菜科、银齿莴苣科、苋科、壳斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、葫芦科、大风子科、罗汉松科、桦木科、胡桃科、胡椒科、木兰科、齿菌科、木耳科、口蘑科、伞菌科、红菇科、杜鹃花科、蔷薇科、猕猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、凤梨科、白花菜科、银杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、毛茛科、竹桃科、小檗科、 芸香科、茄科、罂粟科、马鞭草科、鹿蹄草科、鸭跖草科、瑞香科、桑寄生科、萝藦科、三白草科、景天科、林橡科、马齿苋科、泽泻科、锦葵科、玄参科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌科、无患子科、柏科、苦木科、大戟科、楝科、使君子科、忍冬科、柽柳科、列当科、灯心草科、金缕梅科、龙胆科、椴树科、菖蒲科、冬青科、车前科、漆树科、五味子科、五加科、木棉科、马兜铃科、木犀科、棕榈科、睡莲科、檀香科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述植物为生菜、水稻、小麦、玉米、花生、高粱、大豆、马铃薯、荞麦、藜、蓟、胡椒、八角、茴香、桃、杏、梨、苹果、香蕉、猴头、木耳、山药、山楂、人参、当归、番茄、辣椒、茄子、胡萝卜、甘蓝、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、菠菜、芥菜、豌豆、南瓜、黄瓜、西瓜、甜瓜、石刁柏、洋葱、或其组合。

本发明第二方面提供了一种用于改善植物农艺性状的农用制剂，所述农用制剂包括安全有效量的(a)根际促生菌；和(b)助剂或农学上可接受的载体；其中，所述根际促生菌选自下组：黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括黄色土源菌(Flavisolibacter)。

在另一优选例中，所述黄色土源菌(Flavisolibacter)选自下组：人参土黄色土源菌(Flavisolibacter ginsengisoli)、人参地黄色土源菌(Flavisolibacter ginsengiterrae)、Flavisolibacter rigui、Flavisolibacter sediminifilum、或其组合。

在另一优选例中，所述黄色土源菌(Flavisolibacter)选自下组：F.ginsengisoli GS643、F.ginsengiterrae GS492、F.rigui 02SUJ3、F.sediminifilum HU1-JC5、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括Ferruginibacter。

在另一优选例中，所述Ferruginibacter菌选自下组：Ferruginibacter alkalilentus、Ferruginibacter lapsinanis、Ferruginibacter yonginensis、Ferruginibacter paludis、Ferruginibacter profundus、或其组合。

在另一优选例中，所述Ferruginibacter菌选自下组：F.alkalilentus HU1-GD23、F.alkalilentus HU1-GB11、F.alkalilentus HU1-ID41、F.lapsinanis HU1-HG42、F.yonginensis HME8442、F.paludis HME8881、F.profundus DS48-5-3、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括伦茨氏菌(Lentzea)。

在另一优选例中，所述伦茨氏菌(Lentzea)选自下组：微白伦茨氏菌(Lentzea albida)、白丝伦茨氏菌(Lentzea albidocapillata)、加利福尼亚伦茨氏菌(Lentzea californiensis)、黄疣伦茨氏菌(Lentzea flaviverrucosa)、江西伦茨氏菌(Lentzea jiangxiensis)、肯塔基伦茨氏菌(Lentzea kentuckyensis)、紫色伦茨氏菌(Lentzea violacea)、威威达湖伦茨氏菌(Lentzea waywayandensis)、或其组合。

在另一优选例中，所述伦茨氏菌(Lentzea)选自下组：L.albida NA 944235、L.albida R10069、L.albidocapillata IMMIB D-958、L.albidocapillata 4.215、L.californiensis IMRU 550、L.flaviverrucosa 5-125、L.flaviverrucosa 174513、L.flaviverrucosa 6-4-7T、L.jiangxiensis FXJ1.034、L.kentuckyensis LDDC 2876-05、L.violacea LM 036、L.violacea CAS 5-124、L.violacea 173536、L.waywayandensis LL-37Z-15、L.waywayandensis 173919、L.waywayandensis 173629、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)。

在另一优选例中，所述土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)选自下组：Solirubrobacter ginsenosidimutans、保尔氏土壤红色杆形菌(Solirubrobacter pauli)、Solirubrobacter phytolaccae、土壤土壤红色杆形菌(Solirubrobacter soli)、Solirubrobacter taibaiensis、或其组合。

在另一优选例中，所述土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)选自下组：S.ginsenosidimutans BXN5-15、S.pauli B33D1、S.phytolaccae GTGR-8、S.soli Gsoil 355、S.taibaiensis GTJR-20、或其组合。

在另一优选例中，所述的根际促生菌包括土生单胞菌(Terrimonas)。

在另一优选例中，所述土生单胞菌(Terrimonas)选自下组：Terrimonas aquatica、Terrimonas arctica、绣色土生单胞菌(Terrimonas ferruginea)、藤黄色土生单胞菌(Terrimonas lutea)、Terrimonas pekingensis、Terrimonas rubra、或其组合。

在另一优选例中，所述土生单胞菌(Terrimonas)选自下组：T.aquatica RIB1-6、T.arctica R9-86、T.ferruginea 3576、T.lutea DY、T.pekingensis QH、T.rubra M-8、或其组合。

在另一优选例中，所述助剂或农学上可接受的载体包括添加剂、粘结剂和/或 保护剂。

在另一优选例中，所述添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉、或其组合。

在另一优选例中，所述粘结剂为膨润土、水溶性微生物多糖、或其组合。

在另一优选例中，所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖、或其组合。

在另一优选例中，所述农用制剂含有1×10-1×10²⁰cfu/mL或1×10-1×10²⁰cfu/g根际促生菌，较佳地1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL或cfu/g根际促生菌，按所述农用制剂的总体积或总重量计。

在另一优选例中，所述的农用制剂中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％所述的根际促生菌，以所述农用制剂的总重量计。

在另一优选例中，所述农用制剂还包括肥料，所述肥料选自下组：氮肥、磷肥、钾肥、复合肥、或其组合。

在另一优选例中，所述农用制剂还包括其他植物生长调节剂，所述植物生长调节剂选自下组：腐植酸、矮壮素、增产素、萘乙酸、或其组合。

在另一优选例中，所述农用制剂的剂型选自下组：可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、水乳剂、颗粒剂、种衣剂、或其组合。

本发明第三方面提供了一种促进植物生长发育的方法，所述方法包括步骤：在植物根部施用本发明第二方面所述的农用制剂。

在另一优选例中，所述施用方法包括：拌种、浸种、灌根、穴施、冲施、滴灌、粘根、撒施。

本发明第四方面提供了本发明第二方面所述农用制剂的制法，所述方法包括步骤：将(a)所述根际促生菌与(b)助剂或农学上可接受的载体混合，从而形成本发明第二方面所述的农用制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示了实验室条件下黄色土源菌对谷子萌发的影响。

图2显示了实验室条件下Ferruginibacter菌对谷子萌发的影响。

图3显示了实验室条件下伦茨氏菌对谷子萌发的影响。

图4显示了实验室条件下土壤红色杆形菌对谷子萌发的影响。

图5显示了实验室条件下土生单胞菌对谷子萌发的影响。

图6显示了实验室条件下菌株组合对谷子萌发的影响。

图7显示了盆栽条件下黄色土源菌对谷子促生作用的影响。

图8显示了盆栽条件下Ferruginibacter菌对谷子促生作用的影响。

图9显示了盆栽条件下伦茨氏菌对谷子促生作用的影响。

图10显示了盆栽条件下土壤红色杆形菌对谷子促生作用的影响。

图11显示了盆栽条件下土生单胞菌对谷子促生作用的影响。

图12显示了盆栽条件下菌株组合对谷子促生作用的影响。

图13显示了盆栽条件下黄色土源菌对玉米促生作用的影响。

图14显示了盆栽条件下Ferruginibacter菌对玉米促生作用的影响。

图15显示了盆栽条件下伦茨氏菌对玉米促生作用的影响。

图16显示了盆栽条件下土壤红色杆形菌对玉米促生作用的影响。

图17显示了盆栽条件下土生单胞菌对玉米促生作用的影响。

图18显示了盆栽条件下菌株组合对玉米促生作用的影响。

图19显示了盆栽条件下黄色土源菌对小麦促生作用的影响。

图20显示了盆栽条件下Ferruginibacter菌对小麦促生作用的影响。

图21显示了盆栽条件下伦茨氏菌对小麦促生作用的影响。

图22显示了盆栽条件下土壤红色杆形菌对小麦促生作用的影响。

图23显示了盆栽条件下土生单胞菌对小麦促生作用的影响。

图24显示了盆栽条件下菌株组合对小麦促生作用的影响。

图25显示了田间条件下黄色土源菌对谷子促生作用的影响。

图26显示了田间条件下Ferruginibacter菌对谷子促生作用的影响。

图27显示了田间条件下伦茨氏菌对谷子促生作用的影响。

图28显示了田间条件下土壤红色杆形菌对谷子促生作用的影响。

图29显示了田间条件下土生单胞菌对谷子促生作用的影响。

图30显示了田间条件下菌株组合对谷子促生作用的影响。

图31显示了田间条件下黄色土源菌对番茄促生作用的影响。

图32显示了田间条件下Ferruginibacter菌对番茄促生作用的影响。

图33显示了田间条件下伦茨氏菌对番茄促生作用的影响。

图34显示了田间条件下土壤红色杆形菌对番茄促生作用的影响。

图35显示了田间条件下土生单胞菌对番茄促生作用的影响。

图36显示了田间条件下菌株组合对番茄促生作用的影响。

其中，误差棒上不同的字母表示差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过宏基因组分析进行初步筛选，经过实验验证，意外地发现，黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)能够显著改善植物的农艺性状，具体表现为：(i)促进种子萌发；(ii)提高株高；(iii)促进根系发育(iv)增加叶面积；(v)增加分蘖数；(vi)提高产量。因此上述五种根际促生菌在促进植物生长发育方面有广泛的前景，可以用作农用制剂。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明的根际促生菌及其应用

如本文所用，所述“本发明的根际促生菌”指黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌和土生单胞菌五种菌属的一个或多个菌属的混合或每个菌属中多个菌的一个或多个混合。

其中，所述黄色土源菌为革兰氏阳性菌，不产生孢子，具有黄色色素。

所述Ferruginibacter菌为杆状菌，革兰氏阳性菌，形成菌落呈锈色，可产二氧化氢酶和氧化酶。

所述伦茨氏菌是一种嗜中温放线菌，可形成大量的气生菌丝。

所述土壤红色杆形菌为革兰氏阳性菌，不产生孢子，杆状。

所述土生单胞菌同样属于Chitinophagaceae科的一个属，严格需氧菌，革兰氏染色呈阳性，杆状，可产氧化酶和微弱二氧化氢酶。

所述五种根际促生菌能够显著改善植物的农艺性状，具体表现为：(i)促进种子萌发；(ii)提高株高；(iii)促进根系发育(iv)增加叶面积；(v)增加分蘖数；(vi)提高产量。

农用制剂

可将本发明的活性物质(黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。

这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性物质与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。

用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。

就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。

固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。

非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。

在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。

可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。

在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有黄色 土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、和/或土生单胞菌(Terrimonas)作为促进植物生长发育的活性成分；以及农业上可接受的载体。

如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、和/或土生单胞菌(Terrimonas)传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。

本发明的农用制剂可与其他植物生长调节剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的植物生长调节剂包括(并不限于)：腐植酸、矮壮素、增产素、萘乙酸、或其组合。

此外，本发明的农用制剂也可与肥料制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些肥料选自下组；氮肥、磷肥、钾肥、复合肥、或其组合。

本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂、溶液制剂、或颗粒剂。

本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.001-99.99wt％，优选0.01-99.9wt％，更优选0.05-90wt％的本发明化合物。商品制剂或使用剂型中的本发明化合物的浓度可在广阔的范围内变动。使用剂型中的本发明化合物的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与1％(g/v)之间。

本发明的主要优点：

(1)本发明首次发现黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合能够显著改善植物的农艺性状，如促进种子萌发、提高株高、促进根系发育(如增加根长、提高根长的密度)、增加叶面积、增加分蘖数、提高产量等。

(2)本发明首次将黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合作为农用制剂的主要活性成分，与其他植物生长调节剂联用或作为微生物肥料使用，实验证明，含 有黄色土源菌的农用制剂或微生物肥料能够显著促进植物(如谷子、番茄、小麦、玉米等)的生长发育。

(3)本发明采用根际促生菌作为促进植物生长发育的农用制剂，可以避免化学肥料带来的一系列问题，因而有利于植物(如农作物)的无公害生产，种植者可以不用化肥或减少化肥用量，这不仅可以节省开支，而且有利于植物果实等的出口。

实施例1确定促进植物生长发育的有益菌

土壤样品分别采自陕西杨凌农业高新产业示范园区(34°16′18″N/108°4′59″E)谷子试验田中。在谷子收获时，每个品系谷子随机选取3株，采用Bulgarelli等(2012)(Bulgarelli,D.,Rott,M.,Schlaeppi,K.,van Themaat,E.V.L.,Ahmadinejad,N.,Assenza,F.,...&Schulze-Lefert,P.(2012).Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota.Nature,488(7409),91-95.)描述的方法收集根际土壤。同时，在未种植地块中采取10份土壤。将取好的土壤样品放入灭菌后的收集管，用干冰冷冻运送深圳华大基因研究院，置于在-20℃低温冰箱中保存备用。

每份样品取0.2g进行基因组DNA的提取，利用针对土壤的SPIN试剂盒((MP Biomedicals,Santa Ana,CA)，参照生产厂商提供的说明书进行。

采用16S rRNA基因V4-V5高变区特异引物进行扩增。引物序列如下：

PCR反应条件为：94℃预变性4min；然后在94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次；72℃终延伸10min。得到的PCR产物利用AxyPrep^TM>

利用SizeSelect^TM>TM以及Ion>TM>TM>

测序结果利用PGM软件去除低质量序列和多克隆序列，利用Mothur软件进行质量控制(Schloss,P.D.,Westcott,S.L.,Ryabin,T.,Hall,J.R.,Hartmann,M.,Hollister,E.B.,...&Weber,C.F.(2009).Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial com)。将得到的高质量序列进行聚类得到OUT。将OTU与谷子产量进行关联分析，发现OTU255、OTU5352、OTU1892、OTU414和OTU2200与谷子高产关联性较强，经注释分别为黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)和土生单胞菌(Terrimonas)。

实施例2选取菌株、制备农用制剂

2.1菌株来源

根据本发明实施例1得到的菌属信息，发明人将多株黄色土源菌的16S rRNA基因序列与OUT255进行BLAST比对，比对结果如表1；将多株Ferruginibacter菌的16S rRNA基因序列与OTU5352进行BLAST比对，比对结果如表2；将多株伦茨氏菌的16S rRNA基因序列与OTU1892进行BLAST比对，比对结果如表3；将多株土壤红色杆形菌的16S rRNA基因序列与OTU414进行BLAST比对，比对结果如表4；将多株土生单胞菌的16S rRNA基因序列与OTU2200进行BLAST比对，比对结果如表5。

表1 OTU255序列与4株黄色土源菌16S rRNA基因部分序列BLAST比对结果

表2 OTU5352序列与7株Ferruginibacter菌16S rRNA基因部分序列BLAST比对结果

表3 OTU1892序列与8株伦茨氏菌模式株16S rRNA基因部分序列BLAST比对结果

表4 OTU414序列与5株土壤红色杆形菌土生单胞菌16S rRNA基因部分序列BLAST比对结果

表5 OTU2200序列与6株土生单胞菌16S rRNA基因部分序列BLAST比对结果

发明人从保藏机构获得4株黄色土源菌、7株Ferruginibacter菌、16株伦茨氏菌、5株土壤红色杆形菌和6株土生单胞菌，并保存于深圳华大基因研究院。同时，选取已有促生菌Bacillus pumilus INR7(Raj SN,Chaluvaraju G,Amruthesh KN et al.Induction of Growth Promotion and Resistance Against Downy Mildew on Pearl Millet(Pennisetum glaucum)by Rhizobacteria.Plant Disease 2003；87:380-384.)作为对照。

其中，上述菌株及对照菌株(INR7)的来源信息如表6所示。

表6 菌株来源信息

*Culture Collection of the Department of Entomology and Plant Pathology,Auburn University(AU),Alabama(AL),United States(US)(Raj SN,Chaluvaraju G,Amruthesh KN et al.Induction of Growth Promotion and Resistance Against Downy Mildew on Pearl Millet(Pennisetum glaucum)by Rhizobacteria.PlantDisease 2003；87:380-384.)

2.2菌悬液和菌粉的制备

将各菌株活化后接种，接入NB培养基中，28±2℃、180r/min振荡培养得到菌株发酵液。发酵液经4200r/min离心15min，将上清液移弃。将得到的菌体悬浮于无菌生理盐水(NSS)中，采用血球计数板镜检计数菌悬液的浓度，调整到5×10⁸个/ml备用；或将得到的菌体于低温负压条件下干燥，得到相应菌粉。

2.3农用制剂的制备

农用制剂的配方如下：

配方1-4中的菌组分为单细菌组分，分别含有F.ginsengisoli GS643、F.ginsengiterrae GS492、F.rigui 02SUJ3、F.sediminifilum HU1-JC5。

配方5的菌组分为上述4菌的混合物(重量比为1:1:1:1)。

配方6的菌组分为F.ginsengisoli GS643、F.ginsengiterrae GS492的1:1(wt)的混合物；

配方7的菌组分为两个菌属的菌的等比例混合物：如，黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea).土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)中任意两种菌属之间进行组合。

配方8的菌组分为5个菌属的菌的等比例混合物：黄色土源菌(Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)和土生单胞菌(Terrimonas)的混合物。

配方9-15中的菌组分为单细菌组分，分别含有：F.alkalilentus HU1-GD23、F.alkalilentus HU1-GB11、F.alkalilentus HU1-ID41、F.lapsinanis HU1-HG42、F.yonginensis HME8442、F.paludis HME8881、F.profundus DS48-5-3。

配方16的菌组分为上述7菌的混合物(重量比为1:1:1:1:1:1:1)。

配方17的菌组分为F.alkalilentus HU1-GD23、F.alkalilentus HU1-GB11的1:1(wt)的混合物；

配方18－33中的菌组分为单细菌组分，分别含有：L.albida NA 944235、L.albida R10069、L.albidocapillata IMMIB D-958、L.albidocapillata 4.215、L.californiensis IMRU 550、L.flaviverrucosa 5-125、L.flaviverrucosa 174513、L.flaviverrucosa 6-4-7T、L.jiangxiensis FXJ1.034、L.kentuckyensis LDDC 2876-05、L.violacea LM 036、L.violacea CAS 5-124、L.violacea 173536、L.waywayandensis LL-37Z-15、L.waywayandensis 173919、L.waywayandensis 173629。

配方34的菌组分为L.albida NA 944235、L.albida R10069的1:1(wt)的混合物；

配方35－39中的菌组分为单细菌组分，分别含有：S.ginsenosidimutans BXN5-15、S.pauli B33D1、S.phytolaccae GTGR-8、S.soli Gsoil 355、S.taibaiensis GTJR-20。

配方40的菌组分为S.ginsenosidimutans BXN5-15、S.pauli B33D1的1:1(wt)的混合物；

配方41－46中的菌组分为单细菌组分，分别含有：T.aquatica RIB1-6、T.arctica R9-86、T.ferruginea 3576、T.lutea DY、T.pekingensis QH、T.rubra M-8。

配方47为的菌组分为T.aquatica RIB1-6、T.arctica R9-86的1:1(wt)的混合物。

所述添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉和秸秆粉的混合物。

所述粘结剂为膨润土和水溶性微生物多糖，重量比为1:1。

所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠和壳聚糖的混合物。

实施例3实验室条件下五种根际促生菌对谷子萌发的影响

实验方法：

3.1种子处理

用1％次氯酸钠对谷子种子进行表面消毒5分钟，并用无菌蒸馏水冲洗5遍。利用1％羧甲基纤维素作为粘着剂包上种衣，种衣成份分别为黄色土源菌 (Flavisolibacter)、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌(Lentzea)、土壤红色杆形菌(Solirubrobacter)、土生单胞菌(Terrimonas)、或其组合和泥炭(Biocare Technology Pvt.,Australia)混合物(细菌含量为10⁸-10⁹CFU/g泥炭)，之后置于空气中干燥。每粒种子含菌10⁶-10⁷CFU。对照种子用不含菌的泥炭包裹。

3.2离体促生试验

细菌处理过的种子和对照种子播种到纸巾上。将纸巾浸泡在蒸馏水中，每张纸巾均匀地放置50种子。然后用另一个湿纸巾覆盖在上面，以使种子固定。将纸巾“三明治”卷起来，置于自封袋中防止干燥。7天后，取出纸巾，展开后数发芽种子的个数。同时，利用Abdul Baki和Anderson(1973)(Abdul-Baki,A.A.,&Anderson,J.D.(1973).Vigor determination in soybean seed by multiple criteria.Crop science,13(6),630-633.)描述的方法分析幼苗活力，测量每个幼苗的根长和芽长来计算幼苗活力指数(vigor index)，计算公式如下：

活力指数＝(平均根长+平均芽长)×发芽率(％)

每个处理4个平行样，每个平行样用100粒种子。三次重复，利用Tukey进行多重检验(p<0.05)。

实验结果：

表7 实验室条件下黄色土源菌对谷子萌发的促进作用

注：数据为平均值±SD；每列数字后面不同的字母表示差异显著(p<0.05)，后面的表与此相同。

表8 实验室条件下Ferruginibacter菌对谷子萌发的促进作用

表9 实验室条件下伦茨氏菌对谷子萌发的促进作用

表10 实验室条件下土壤红色杆形菌对谷子萌发的促进作用

表11 实验室条件下土生单胞菌对谷子萌发的促进作用

表12 实验室条件下菌株组合对谷子萌发的促进作用

结果如表7-12和图1-6所示。结果表明，分别经黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合处理谷子种子，可以不同程序促进种子萌发，且能显著增加幼苗芽长及根长，发芽率也明显增加。并且，所有黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合促进谷子种子萌发效果均优于已知促生菌INR7，幼苗活力指数均明显高于INR7及空白对照。

实施例4盆栽条件下五种根际促生菌对谷子的促生作用

实验方法：

选择未灭菌的田间土作为盆栽基质，放入直径为15cm的盆钵中。每盆播种10粒种子，发芽一周后，每盆保留5株，在每株幼苗附近打三个洞，分别浇灌约30mL菌悬液，用土将洞填上。用清水浇灌的幼苗作为对照。将盆钵至于温室中，温度控制22～32℃(平均温度26℃)。每隔2天用20ml无菌蒸馏水浇灌一次，每周按重量补水以达到盆钵土壤容水量。

植株生长30天后，分别测量地上部分高度(株高)、叶面积(LI-3100C Area Meter,LI-COR,Inc.,USA)、根长(WinRHIZO,Regent Instruments Inc.,USA)、植株鲜重和植株干重(70℃烘干至恒重)等指标。

所有温室实验按照完全随机区组设计，每个处理3个平行样，2次重复。

实验结果：

表13 盆栽条件下黄色土源菌对谷子促生作用

表14 盆栽条件下Ferruginibacter菌对谷子促生作用

表15 盆栽条件下伦茨氏菌对谷子促生作用

表16 盆栽条件下土壤红色杆形菌对谷子促生作用

表17 盆栽条件下土生单胞菌对谷子促生作用

表18 盆栽条件下菌株组合对谷子促生作用

结果如表13-18和图7-12所示。结果表明，在盆栽条件下，黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合分别可以不同程度地增加谷子植株株高、叶面积、根长密度、分蘖数、鲜重及干重，促生作用十分明显，效果优于已知促生菌INR7。

实施例5盆栽条件下五种根际促生菌对玉米的促生作用

实验方法：

玉米种子用无菌蒸馏水反复清洗后晾干，浸泡于0.1％的HgCl₂溶液中10min，立即用无菌蒸馏水冲洗10次以上晾干，并检查消毒是否彻底。

玉米种子表面消毒后，45℃恒温水浴4h。将菌剂放在较大的盆中，加适量清水化开，调成糊状，放入种子搅拌均匀，让每粒种子沾上菌剂。以市场上销售的促生菌剂绿丰康拌种作用阳性对照，以用清水接种作为阴性对照。将处 理后的种子包裹在无菌纱布中，每天喷洒3次无菌水，室温条件下催芽3d。已发芽的玉米种子移栽入盆钵中，每盆约10粒，深度约1.5cm，各盆钵均放置于室温中并且在自然光照下培养。每天用无菌蒸馏水喷洒2次。处理33d后测量各试验组和对照组玉米植株的各种形态学参数，包括株高、根长、鲜重及干重。

其中，用作阳性对照的市售促生菌剂，如绿丰康988复合菌剂(实施例5-6)和绿科微生物肥料(实施例8)的信息如表5所示。

表19 用作阳性对照的市售促生菌剂信息

实验结果：

表20 盆栽条件下黄色土源菌对玉米促生作用

表21 盆栽条件下Ferruginibacter菌对玉米促生作用

表22 盆栽条件下伦茨氏菌对玉米促生作用

表23 盆栽条件下土壤红色杆形菌对玉米促生作用

表24 盆栽条件下土生单胞菌对玉米促生作用

表25 盆栽条件下菌株组合对玉米促生作用

结果如表20-25和图13-18所示。结果表明，黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合分别对玉米的促生效果明显，株高、根长、鲜重和干重方面均明显高于对照，且效果高于商用促生菌剂绿丰康。

实施例6盆栽条件下五种根际促生菌对小麦的促生作用

实验方法：

首先用饱和的氯化钠溶液选种，选出饱满完整的麦种，用浓度为10％的双氧水表面消毒5min，用蒸馏水漂洗4-5次。将小麦种子均匀地撒在育苗盘中，等发芽后移栽。

移栽时，将菌剂与基质调成浆状，粘附小麦的根部，转移至盆钵中。盆钵口径为12cm，盆底部放双层滤纸，加入消毒的河砂，高度为距盆面1.5cm。每盆均匀移栽5株长势一致的幼苗。设2个对照，其一用绿丰康处理，其二用清水处理。每个处理3盆，3次重复。

盆钵中适时添加无菌水，每隔5d每盆加5ml Hoagland营养液，保证适当的水分和养分供应。25d后测定株高、根长、鲜重和干重。

实验结果：

表26 盆栽条件下黄色土源菌对小麦促生作用

表27 盆栽条件下Ferruginibacter菌对小麦促生作用

表28 盆栽条件下伦茨氏菌对小麦促生作用

表29 盆栽条件下土壤红色杆形菌对小麦促生作用

表30 盆栽条件下土生单胞菌对小麦促生作用

表31 盆栽条件下菌株组合对小麦促生作用

结果如表26-31和图19-24所示。结果表明，分别经黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合处理后，谷子株高、根长、鲜重及干重与对照相比都有不同程度的提高，且促生效果优于商用促生菌剂绿丰康。另外，从小麦生长状况也可以看出，各处理小麦叶色葱绿，叶型厚实，与对照形成较明显的差异。

实施例7田间条件下五种根际促生菌对谷子的促生作用

选取一块土地评价五种根际促生菌在田间条件下对谷子生长的影响，土壤为红壤土。整地时，将菌剂与化肥(尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等)或细砂(沙、土、草木灰、木屑等)拌匀，均匀撒施，随拌随撒。阳性对照小区加INR7菌剂；阴性对照小区不加菌剂。每个处理4个小区，每个小区为5m长的一行，播种约50～100粒。播种后每15天浇灌一次。21天后，每行保留同样株数的幼苗。60天后，测量植株高度、叶表面积、穗头数/每株、穗头长度以及穗头周长。收获时测量各小区千粒重并计算总产量。

结果如从表32-37和图25-30所示。

表32 田间条件下黄色土源菌对谷子的促生作用

表33 田间条件下Ferruginibacter菌对谷子的促生作用

表34 田间条件下伦茨氏菌对谷子的促生作用

表35 田间条件下土壤红色杆形菌对谷子的促生作用

表36 田间条件下土生单胞菌对谷子的促生作用

表37 田间条件下菌株组合对谷子的促生作用

结果表明，分别经黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合处理后，的谷子的各项测量指标与对照相比都有不同程度的提高，且促生效果优于已知促生菌INR7。表明田间条件下，黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合可以促进谷子生长发育。

实施例8田间条件下五种根际促生菌对番茄的促生作用

番茄移栽后，在浇灌进行不同处理。将本发明实施例2制备的农用制剂溶于水或者直接取菌株发酵液或菌悬液随水冲施。

设两个对照组。对照组一：将绿科微生物菌肥料溶于水，同样的方法随水冲施；对照组二不加任何物质，直接用清水浇灌。每个对照组处理3个重复小区，每个小区面积约为24m²(3m×8m)，包括3垅，共6行，种植150株番茄。小区与小区之间设保护行，完全随机排列。

移栽即处理后30d调查，每个小区随机选取15株番茄，测量株高、根长和鲜重。当番茄开始采摘后，记录每次采摘时各小区的番茄重量，等番茄全部采摘完毕，计算各小区总产量。

表38 田间条件下黄色土源菌对番茄促生作用

表39 田间条件下Ferruginibacter菌对番茄促生作用

表40 田间条件下伦茨氏菌对番茄促生作用

表41 田间条件下土壤红色杆形菌对番茄促生作用

表42 田间条件下土生单胞菌对番茄促生作用

表43 田间条件下菌株组合对番茄促生作用

结果如表38-43和图31-36所示。结果表明，分别经黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合处理后，番茄株高、根长、鲜重及产量与对照相比都有不同程度的提高，且效果优于商用促生剂绿科。另外，从番茄生长状况也可以看出，各处理番茄茎干粗壮，叶色黑绿，长势较好。

实施例9五种根际促生菌对其他植物的促生作用

分别对其他植物，包括作物、蔬菜、果树、花卉等施用五种根际促生菌， 施用方式分别为种衣、拌种、浸种、灌根、粘根、穴施、冲施、撒施、滴灌等。分别测量植物产量或株高，并计算分别施用黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合后植物的增产率或增长率。

结果如表44-49所示。

表44 黄色土源菌对其他植物的促生作用

表45 Ferruginibacter菌对其他植物的促生作用

表46 伦茨氏菌对其他植物的促生作用

表47 土壤红色杆形菌对其他植物的促生作用

表48 土生单胞菌对其他植物的促生作用

表49 菌株组合对其他植物的促生作用

结果表明，黄色土源菌、Ferruginibacter菌、伦茨氏菌、土壤红色杆形菌、土生单胞菌、或其组合分别可以不同程度地促进不同植物生长发育，表现在产量增加或者株高增加，增产率或促生率介于5-50％之间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。