用于治疗、诊断和预后血液系统恶性肿瘤的方法

摘要

本发明涉及用于预防和/或治疗血液系统恶性肿瘤的5‑羟色胺受体(5‑HTR)抑制剂，其选自1型5‑HTR抑制剂和2型5‑HTR抑制剂。另外，本发明涉及基于检测1型5‑HTR和/或2型5‑HTR的表达，用于识别或分离来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞、或用于诊断血液系统恶性肿瘤的体外方法。而且，本发明涉及基于测定1型5‑HTR和/或2型5‑HTR的水平，用于测定预后、用于监测疗法效果或为遭受血液系统恶性肿瘤的对象设计定制疗法的体外方法。

说明书

技术领域

本发明涉及治疗、诊断和预后方法的领域。

背景技术

血液系统或造血系统恶性肿瘤是血液或骨髓的癌症，包括白血病和淋巴瘤。白血病的特征在于血细胞的不受控制的积累，其可以分为四种类型：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

急性髓性白血病(AML)，还被称为非淋巴性、成髓细胞性、粒细胞性或髓细胞性白血病，影响包括粒细胞和单核细胞在内的各种白细胞。急性白血病是一种快速进展的疾病，其导致不成熟的、无功能的细胞在骨髓和血液中积累；骨髓常常停止产生足够的传播至肝脏、脾脏、淋巴结、中枢神经系统、肾脏和生殖腺的正常红细胞、白细胞和血小板以及白血病细胞。结果，AML患者可以显露AML的一种或多种症状，比如，例如贫血、疲劳、类流感症状、骨痛、食欲不振、体重减轻、容易擦伤、出血和易于感染。

在全世界，每年有多于1/25万的成年人被诊断为患有急性髓性白血病(AML)。尽管在过去30年期间对AML的治疗取得了相当大的进展，但是2/3的青少年和90％的老年人仍然死于该疾病。

来自患有血液系统恶性肿瘤的患者并且尤其是患有AML的患者的经历表明全身血浆/血清细胞因子分布型(cytokine profile)可以用做患者的诊断工具和用于患者的预后二者。但是，细胞因子/趋化因子由多种不同的细胞释放并且在多种不同的生物过程中涉及；改变的水平可以因此主要反映生物过程的强度和性质，并且细胞因子/趋化因子分析的最佳临床应用可能因此需要与器官特异性生物标记结合。趋化因子水平还被临床程序、治疗干扰和患者的一般状态改变(Reikvam H.等，Toxins(Basel).Feb 2013；5(2)：336-362)。因此，新型诊断和预后方法对于建立血液系统恶性肿瘤的最佳评估和管理是必需的。

AML的当前治疗方法可以包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法、输血和骨髓移植。早期治疗主要依靠阿糖胞苷(ara-C)与蒽环类抗生素结合，其在将近40年前被开发并且一直是全球治疗标准，或者可选地，3到8种药物比如例如阿糖胞苷、道诺霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、巯鸟嘌呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、依托泊甙和氨甲喋呤的组合。虽然当前的化学疗法可以导致完全缓解，但是白血病——尤其是AML——的长期无病生存率是低的。

可选的治疗方法涉及开发低毒的和更有效的疗法。多种新型化学治疗剂已经在AML中被评估，包括拓扑异构酶I抑制剂比如拓扑替康(topotecan)和喜树碱(campothecin)，含铂药剂(卡铂)和新型抗代谢物，包括吉西他滨(gemcitabine)、曲沙他滨(troxcitabine)和氯法拉滨(clofarabine)(Smith M，等，Critical Reviews inOncology/Hematology.2004；50(3)：197-222)。所有这些药剂对白血病母细胞(blast)具有活性但是其应用仍有待调查。使用环孢霉素A或PSC 833阻断MDR-1没有证明是有益的并且可能增加毒性或者迫使剂量降低，并且从而降低整体化疗暴露(Larson RA.等，Leukemia2003；17：488-91)。

由于化学疗法还通常杀死正常细胞，因此接受化学疗法的患者通常经历副作用，比如，例如恶心、疲劳和更高的感染风险。

因此，存在对用于治疗血液系统恶性肿瘤——包括白血病——的具有降低毒性的有效疗法的明确和未满足的需要。

发明内容

在第一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液系统恶性肿瘤的5-羟色胺受体(5-HTR)抑制剂，其选自1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂。

在第二方面，本发明涉及用于在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中识别来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括在所述细胞中检测1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达。

在第三方面，本发明涉及用于诊断对象中的血液系统恶性肿瘤的体外方法，其包括通过本发明的方法识别恶性肿瘤细胞。

在第四方面，本发明涉及用于在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中分离来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括在所述细胞中检测1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达和分离表达所述5-HTR的所述细胞。

在第五方面，本发明涉及用于测定遭受血液系统恶性肿瘤的对象的预后的体外方法，其包括：

(a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平，和

(b)将所述水平与参比值进行比较

其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于参比值的降低表明对象示出了良好预后，或者

其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于参比值的增加表明对象示出了不良预后。

在第六方面，本发明涉及用于监测遭受血液系统恶性肿瘤和用疗法治疗的对象中所述疗法的效果的体外方法，其包括：

a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平，和

b)将所述水平与更早时间点处来自所述对象的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平进行比较

其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于更早时间点处来自所述对象的样本中测定的水平的降低表明疗法是有效的，或者其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于更早时间点处来自所述对象的样本中测定的水平的增加表明疗法是无效的。

在第七方面，本发明涉及用于为诊断患有血液系统恶性肿瘤的对象设计定制疗法的体外方法，其包括：

a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平

b)将所述水平与参比值进行比较

其中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平相对于参比值的增加表明对象要用1型5-HTR抑制剂和/或2型5-HTR抑制剂治疗。

附图说明

图1.阿扑吗啡治疗降低AML细胞活力。在完全RPMI培养基中每mL>6个HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1细胞用0.1、1和10μM阿扑吗啡治疗72h。细胞在37℃和5％CO₂下培育。细胞用7-氨基放线菌素D(7-AAD，CAS号7240-37-1)和Hoechst>*p＜0.05。

图2. 1型和2型5HTR拮抗剂诱导AML细胞系的细胞死亡。将每mL>6个HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1AML细胞系用0.1、1和10μM的阿扑吗啡、甲硫替平(Methiothepin)、安哌齐持(Amperozide)或GR113808在37℃和5％CO₂下培育。核细胞通过Hoechst正染色鉴定，而死细胞通过7-AAD正染色排除。细胞数目通过容量计数计算。A.代表了来自每个AML细胞系的平均值(符号)和来自6个不同的生物复制的标准偏差(误差线)。B.AML细胞系在存在或不存在5-CT或5-HT的情况下用10μM阿扑吗啡或甲硫替平处理。^*p＜0.05。Apo：阿扑吗啡；Methio：甲硫替平。

图3.在24h时，5HTR拮抗剂降低原发性患者AML样本的细胞活力。每mL 5x>6个原发性AML细胞用0.1、1和10μM的阿扑吗啡或甲硫替平在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理24h。AML混合群体(bulk>*p＜0.05。

图4.在72h时，5HTR拮抗剂降低原发性患者AML样本的细胞活力。每mL 5x>6个原发性AML细胞用0.1、1和10μM的阿扑吗啡或甲硫替平在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理24h。AML混合群体基于它们的CD45表达和SSC分布型通过细胞计量术鉴定。原发性AML群体在AML混合群体内基于它们对CD34的阳性和对CD38的阴性来鉴定。核细胞通过Hoechst正染色鉴定，而死细胞通过7-AAD正染色排除。细胞数目通过容量计数计算。11个原发性AML样本一式三份被分析。每种符号代表具体的AML患者。条代表每个复制的细胞活力平均值。^*p＜0.05。

图5. 5HTR拮抗剂诱导AML细胞系的髓样分化。每mL>6个HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1AML细胞用0.1、1和10μM的阿扑吗啡和甲硫替平在37℃和5％CO₂下在完全RPMI培养基中处理72h。CD11c、CD11b和CD14表面表达通过流式细胞术检测。死亡细胞通过7-AAD-增染色排除。^*p＜0.05。MFI：平均荧光强度。

图6.5HTR拮抗剂阿扑吗啡诱导原发性患者AML样本的髓样分化。每mL 5x>6个原发性AML细胞用0.1、1和10μM的阿扑吗啡在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理72h。AML混合群体基于它们的CD45表达和SSC分布型通过细胞计量术鉴定。CD11b、CD14和CD15的表面表达通过流式细胞术检测。死亡细胞通过7-AAD-正染色排除。9个AML样本一式三份被分析。每种符号代表具体的AML患者。条代表每个复制的细胞活力平均值。^*p＜0.05。

图7.5HTR拮抗剂甲硫替平诱导原发性患者AML样本的髓样分化。每mL 5x>6个原发性AML细胞用0.1、1和10μM的甲硫替平在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理72h。AML混合群体基于它们的CD45表达和SSC分布型通过细胞计量术鉴定。CD11b、CD14和CD15的表面表达通过流式细胞术检测。死亡细胞通过7-AAD-正染色排除。9个AML样本一式三份被分析。每种符号代表具体的AML患者。线代表每个复制的细胞活力平均值。^*p＜0.05。

图8.健康血细胞活力在用5HTR拮抗剂处理之后保持不受影响。每6mL 5x>6个菲可-分离的单核细胞——来自从健康供体获得的外周血样本——用0.1、1和10μM的阿扑吗啡或甲硫替平在完全RPMI培养基中在37℃和5％CO₂下处理24h(A)或72h(B)。血细胞基于它们的CD45表达和SSC分布型通过细胞计量术鉴定。核细胞通过Hoechst正染色鉴定，而死细胞通过7-AAD正染色排除。细胞数目通过容量计数计算。4个原发性供体样本一式三份被分析。条代表每个复制的细胞活力平均值，并且误差线指示标准偏差。^*p＜0.05。

图9.5HTR拮抗剂处理而健康的造血肝细胞/祖细胞免受影响(spare)。2x>5个谱系缺失的菲可-分离的单核细胞——来自从健康供体获得的脐带血样本——用10μM的阿扑吗啡在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理24h。血细胞基于它们的CD45表达和SSC分布型通过细胞计量术鉴定。进行CD34和CD38表面染色以鉴定每个亚群。核细胞通过Hoechst正染色鉴定，而死亡细胞通过7-AAD正染色排除。细胞数目通过容量技术计算。3个原发性脐带血样本一式三份被分析。条代表每个复制的细胞活力平均值，并且误差线指示标准偏差。

图10.原发性AML样本的产克隆能力在5HTR拮抗剂处理之后降低。每mL 5x>5个原发性患者AML血细胞用10μM的阿扑吗啡或甲硫替平在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理18h。细胞然后在补充有造血细胞因子的甲基纤维素中培养14天。获得的CFU-B的数目通过显微镜检查基于形态学标准测量。分析7个原发性AML血液样本。每个符号代表具体的患者样本。线代表中值。^*p＜0.05。CFU-B：母细胞集落生成单位。

图11.5HTR拮抗剂处理不降低健康造血肝细胞的产克隆能力。每mL 1x>3个原发性谱系缺失的脐带血细胞用10μM的阿扑吗啡或甲硫替平在完全IMDM培养基中在37℃和5％CO₂下处理18h。细胞然后在补充有造血细胞因子的甲基纤维素中培养14天。获得的集落的数目通过显微镜检查基于形态学标准测量。A.代表集落的总数目。CFU：集落生成单位。B.示出每个集落亚型的频率(CFU-混合，混合谱系集落；CFU-GM，粒状(granulo)-单核细胞集落；CFU-G，粒细胞集落；CFU-M，单核细胞集落；BFU-E红细胞母细胞集落)。分析4个原发性脐带血样本。条代表每个复制的细胞活力平均值，并且误差线指示标准偏差。^*p＜0.05。

图12.AML样本差异地表达5HTR。对原发性AML血液样本、健康外周血样本和AML细胞系(HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1)的表面进行染色5HTR 1A和HTR1B。样本通过流式细胞术分析，并且代表了阳性细胞的频率。代表了18个原发性患者AML外周血样本和16个健康供体外周血样本。圆圈：AML细胞系，正方形：AML，方块：健康的成熟红细胞^*p＜0.05；^***p＜0.001。

图13.5HTR mRNA水平与AML临床结果相关联。来自原发性患者AML血液样本的总RNA被分离并且5HTR1A(A)和5HTR1B(B)mRNA水平通过半定量PCR测量。表达水平针对GAPDH标准化并且按照2^-ΔCt方法计算。代表了一式三份的与良好预后组对应的6个AML样本和与不良预后组对应的8个AML样本。^*p＜0.05。

图14.用5HTR拮抗剂处理导致二次CFU的降低。用10μM阿扑吗啡、10μM甲硫替平或运载体对照预处理的来自原发性CFU的每mL>6个原发性AML患者细胞在补充有造血细胞因子的甲基纤维素中再铺板(replate)14天。获得的CFU-B的数目通过显微镜检查基于形态学标准检测。测试了三个原发性AML样本。^*p＜0.05，^***p＜0.005，^****p＜0.001。

图15.用5HTR1拮抗剂处理降低体内异种移植小鼠模型中的AML负荷。6-8周龄NOD.Cg-Prkdc^scid>tmlWjl/SzJ(NSG)小鼠在第0天时用白消安(30mg/kg>6MonoMac-1细胞进行IV注射。从第7天到第14天，用阿扑吗啡(5mg/kg)或甲硫替平(0.1mg/kg)经IP每隔一天处理小鼠，而对照小鼠用生理盐水运载体(0.9％NaCl)处理。在第15天时，处死小鼠并收获它们的骨骼(髂嵴、股骨和胫骨)和分析人细胞的存在。骨髓样本通过流式细胞术测量。人CD45阳性细胞(上图)和总的人CD45阳性细胞(下图)在BM中的频率参考对照。条代表平均值。误差线代表SEM。^**p＜0.01；^***p＜0.001。

图16.5HTR拮抗剂处理降低原发性AML细胞的白血病再生能力，同时健康的造血肝细胞/祖细胞免受影响。1-10x10⁶个原发性AML患者细胞或10-14x>4个谱系缺失的CB细胞在补充有5％热灭火的胎牛血清和造血细胞因子的IMDM中在体外处理(10μM阿扑吗啡、10μM甲硫替平或运载体对照)18h。在先前白消安(30mg/kg)-适应(condition)的NSG小鼠中IV注射细胞并且保持8周不被处理。处死小鼠并收获它们的骨骼(髂嵴、股骨和胫骨)和通过流式细胞术分析人白血病(上图)或健康红(下图)细胞的存在。四个AML患者样本和三个脐带血(UCB)样本被测试。^*p＜0.05；^**p＜0.01。

图17.用5HTR拮抗剂处理降低二次接受者中原发性AML样本的白血病再生能力，而不影响正常造血作用。上图.来自原发性移植的小鼠的3-10x>5个移入的骨髓细胞被静脉内注入二次接受者(适应的NSG小鼠)并保持未被处理持续8周。骨髓细胞如在图16中被分析。代表了参照对照的人CD45阳性细胞的频率。下图.50x10³个移入的人细胞的CFU被筛选。代表了获得的CFU的标准化的数目。^*p＜0.05；^***p＜0.005；^****p＜0.0001。

具体实施方式

本发明的发明人已经发现血液系统恶性肿瘤细胞，尤其是AML细胞，表达5-羟色胺受体(5HTR)和1型和/或2型5HTR的抑制对AML细胞具有细胞毒性作用，如实施例1和2中所示，降低AML母细胞的产克隆能力同时健康造血肝细胞免受影响(实施例5)，并且发现了1型和/或2型5HTR抑制剂对健康红细胞和健康造血肝细胞/祖细胞(实施例4)都没有影响。另外，他们已经观察到1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达的检测可以用于鉴定来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞(实施例6)，并且观察到来自遭受血液系统恶性肿瘤的患者的样本中的1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达的降低与良好预后相关联(实施例7)。

定义

如本文所使用，“5-羟色胺受体”，还已知为5-羟基色胺受体或5-HT受体或5-HTR，是在中枢和周围神经系统中发现的一组G蛋白偶联受体(GPCR)和配体门控型离子通道(LGIC)。

如本文所使用，术语“1型5-HT受体”或“1型5-HTR””或“5-HT1受体”或“5-HTR1”指的是结合内源性神经递质5-羟色胺(5-羟基色胺，5-HT)的5-HT受体的亚科。5-HT1受体亚科由偶联至Gi/Go的五种G蛋白偶联受体(GPCR)组成并且该术语包括5-HTR1A、5-HTR1B、5-HTR1D、5-HTR1E和5-HTR1F。这些受体通过降低cAMP的细胞水平来介导抑制性神经传递。人1A型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P08908(2014年4月16日)。人1B型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P28222(2014年4月16日)。人1D型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P28221(2014年4月16日)。人1E型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P28566(2014年5月14日)。人1F型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P30939(2014年4月16日)。

如本文所使用，术语“2型5-HT受体”或“2型5-HTR”或“5-HT2受体”或“5-HTR2”指的是结合内源性神经递质5-羟色胺(5-羟基色胺，5-HT)的5-HT受体的亚科。5-HT2受体亚科由偶联至Gq/G11的三种G蛋白偶联受体(GPCR)组成并且该术语包括5-HTR2A、5-HTR2B和5-HTR2C。这些受体通过增加IP3和DAG的细胞水平来介导兴奋性神经传递。人2A型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P28223(2014年5月14日)，人2B型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P41595(2014年5月14日)，和人2C型5-HT受体的完全蛋白序列具有UniProt登录号P28335(2014年5月14日)。

如本文所使用，术语“抑制剂”指的是抑制5-HT受体的活性的化合物。术语抑制剂包括但不限于5-HT受体的拮抗剂、针对5-HT受体的抗体、阻止5-HT受体的表达的化合物和导致5-HT受体的降低的mRNA或蛋白质水平的化合物。在优选的实施方式中，抑制剂是拮抗剂。在本发明的背景下，术语“拮抗剂”指的是结合至5-HT受体和其本身缺乏激活受体的任何实质能力的化合物。当激动剂存在时，拮抗剂可以从而通过激动剂或天然配体阻止或降低受体的功能性激活或占据。如本文所使用，术语“5-HT受体的拮抗剂”意欲包含中性拮抗剂和反向激动剂。“中性拮抗剂”是阻断激动剂的作用但是对固有或自发受体活性没有作用的化合物。“反向激动剂”能够阻断受体中激动剂的作用并减弱受体的组成性活性。术语“拮抗剂”还包括竞争性拮抗剂，其是结合至与天然配体相同位点的药物；非竞争性拮抗剂，其结合至与天然配体相比受体上的不同位点；可逆性拮抗剂，其以由受体-配体动力学确定的速率结合和解开(unbind)受体；和不可逆性拮抗剂，其通过与活性位点形成共价键或仅仅通过解离速率有效地为0的紧密地结合而与受体永久结合。

如本文所使用，术语“1型5-HTR抑制剂”指的是能够抑制5-HTR1的活性的任何化合物(例如通过结合至5-HTR1和其本身缺乏激活受体的任何实质能力；或者通过阻止或降低5-HTR1mRNA或5-HTR1蛋白质的表达)。该术语包括对5-HTR1或对任何5-HTR1亚型(5-HTR1A、5-HTR1B、5-HTR1D、5-HTR1E和5-HTR1F)的选择性抑制剂和还能够对来自其它亚科的5-HT受体充当抑制剂的非选择性抑制剂。

如本文所使用，术语“2型5-HTR抑制剂”指的是能够抑制5-HTR2的活性的任何化合物(例如通过结合至5-HTR2和其本身缺乏激活受体的任何实质能力；或者通过阻止或降低5-HTR2mRNA或5-HTR2蛋白质的表达)。该术语包括对5-HTR2或对任何5-HTR2亚型(5-HTR2A、5-HTR2B和5-HTR2C)的选择性抑制剂和还能够对来自其它亚科的5-HT受体充当抑制剂的非选择性抑制剂。

如本文所使用，“阿扑吗啡”指的是(6aR)-6-甲基-5，6，6a，7-四氢-4H-二苯并[de，g]喹啉-10，11-二醇，CAS号314-19-2。阿扑吗啡是1型和2型5-HTR拮抗剂(Millan>

“甲硫替平”或甲替平(metitepine)指的是1-甲基-4-(8-甲基磺酰基-5，6-二氢苯并[b][1]苯并硫杂卓(benzothiepin)-6-基)哌嗪，CAS号74611-28-2。甲硫替平是1型和2型5-HTR拮抗剂(Kawano>

如本文所使用，“安哌齐持”指的是4-[4，4-双(4-氟苯基)丁基]-N-乙基哌嗪-1-甲酰胺，CAS号75558-90-6。安哌齐持是2型5-HTR拮抗剂(Svartengren J.和SimonssonP.PharmacolToxicol，1990；66suppl 1：8-11)。在一个实施方式中，抑制剂是安哌齐持。

术语“血液系统恶性肿瘤”指的是影响血液、骨髓和淋巴结的肿瘤类型。血液系统恶性肿瘤可以源自下面两个主要的血细胞谱系中的任一个：髓样和淋巴样细胞系。髓样细胞系正常地产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴样细胞产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤、淋巴细胞性白血病和骨髓瘤来自淋巴系，而急性和慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病起源于骨髓。血液系统恶性肿瘤的非限制性的、说明性的实例是急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤和骨髓瘤。

如本文所使用，“白血病”指的是血液或骨髓的癌症类型，其特征在于被称为“母细胞”的不成熟白细胞的异常增加。白血病是疾病谱的广义术语。而且，其是影响血液、骨髓和淋巴系统的甚至更宽泛组的疾病的一部分，其被众所周知为血液系统肿瘤。存在四种主要类型的白血病：急性成淋巴细胞性白血病或ALL；急性髓性白血病，或AML；慢性淋巴细胞性白血病，或CLL；慢性髓细胞性白血病，CML。

“急性成淋巴细胞性白血病(ALL)或急性淋巴性白血病”是白血病的急性形式，或白细胞的癌症，特征在于癌性的、未成熟的白细胞——已知为淋巴母细胞——的过度产生。

“急性髓性白血病(AML)或急性髓细胞性白血病或急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)”是血细胞的骨髓系癌症，特征在于在骨髓中积累并干扰正常血细胞产生的异常白细胞(成髓细胞(mieloblast))的快速生长。AML的症状由正常骨髓被白血病细胞替换引起，其引起红细胞、血小板和正常白细胞的减少。血液和骨髓(blood>

“慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)”是使得身体产生大量白细胞(B细胞淋巴细胞)的癌症类型。

“慢性髓细胞性白血病(CML)”，其已知为“慢性粒细胞性白血病(CGL)”，是使得身体产生大量白细胞(髓细胞)的癌症类型。在CML中，发现了成熟粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和它们的前体的增殖。其与被称为费城染色体的特征染色体易位相关联。

如本文所使用，“样本”指的是选自骨髓、血液和淋巴结的样本。

如本文所使用，“外周血”指的是包含血液的细胞成分的样本，由红细胞、白细胞和血小板组成，红细胞、白细胞和血小板在血液的循环库(pool)内被发现并且不在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓内被隔绝(sequester)。

如本文所使用，“恶性肿瘤细胞”是“肿瘤细胞”或“癌细胞”并且指的是在不受调节的、加快的速度下生长和分裂的细胞。

术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”包括任何对象，尤其是哺乳动物对象，对于该对象而言疗法是期望的。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物或宠物动物，比如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

“免疫细胞化学”指的是通过使用结合至特定蛋白或抗原的特异性一次抗体定位特定蛋白或抗原的存在的技术，其中细胞外间质和其它基质成分被去除，仅剩下完整细胞来染色。

术语“表达水平的降低”指的是低于参比值的1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。当表达水平与其参比值相比低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更低时，其被认为低于参比值。

术语“表达水平的增加”指的是高于参比值的1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。当表达水平与其参比值相比高至少1.5％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更高时，其被认为低于参比值。

如本文所使用，术语“参比值”指的是预定的标准，其被用作用于评估从收集自对象的样本获得的值或数据的参比。参比值或参比水平可以是绝对值；相对值；具有上限和下限的值；一定范围的值；均值；中值；平均值；或与具体对照或基线值相比较的值。参比值可以基于单个样本值，比如例如，从来自正在被测试的对象的样本获得的，但是在更早时间点处的值。参比值可以基于大量样本，比如来自实足年龄匹配组的对象群体，或者基于包括或排除将要被测试的样本的样本库。

如本文所使用，“良好预后”意思是对于患者而言将被视为积极的结果并且取决于预后类型；例如，1年存活(1YS)的良好预后将意味着患者将存活至少1年。在优选的实施方式中，良好预后指的是在疾病的诊断之后5年存活超过40％的概率。

如本文所使用，“不良预后”意思是对于患者而言将被视为消极的结果并且取决于预后类型；例如，1年存活的不良预后将意味着患者将不会存活至少1年。在优选的实施方式中，不良预后指的是在疾病的诊断之后5年存活低于40％的概率。

如本文所使用，“更早时间点”指的是在疗法被施用至遭受血液系统恶性肿瘤的对象之前的任何时候。

如本文所使用，“有效疗法”指的是如此疗法：其导致在遭受血液系统恶性肿瘤和正在用所述疗法治疗的患者的样本中1型5-HTR和/或2型5-HTR的水平降低。

如本文所使用，“无效疗法”指的是如此疗法：其不帮助在遭受血液系统恶性肿瘤和正在用所述疗法治疗的的患者的样本中1型5-HTR和/或2型5-HTR的水平降低。

1-医学用途

本发明的作者已经发现1型5-HTR和2型5-HTR抑制剂在治疗血液系统恶性肿瘤——优选地AML——中是治疗上有效的，并且发现所述抑制剂对于健康红细胞和对于健康造血肝细胞都没有作用，因而避免了传统化学疗法治疗产生的对正常细胞的毒性。

在第一方面，本发明涉及选自1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂的5-羟色胺受体(5-HTR)抑制剂用于预防和/或治疗血液系统恶性肿瘤。

可选地，本发明涉及选自1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂的5-羟色胺受体(5-HTR)抑制剂用于制备预防和/或治疗血液系统恶性肿瘤的药物的用途。

可选地，本发明涉及用于预防和/或治疗血液系统恶性肿瘤的方法，其包括将选自1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂的5-羟色胺受体(5-HTR)抑制剂施用至有需要的对象。

如本文所使用，术语“预防(prevention)”、“预防(preventing)”或“预防(prevent)”指的是施用根据本发明的抑制剂或包含所述抑制剂的药物至对象，所述对象在施用时还没有被诊断为可能患有血液系统恶性肿瘤，但是其将正常地被预期为发展所述疾病或者处于患所述疾病的增加风险之下。本发明意欲避免所述疾病的出现。本发明可以是彻底的(例如，完全没有疾病)。本发明还可以是部分的，使得例如在对象中疾病的发生低于在不施用本发明的抑制剂的情况下将发生的疾病。预防还指的是降低对临床状态的易感性。

如本文所使用，术语“治疗”指的是施用根据本发明的抑制剂或者包含所述抑制剂的药物至遭受血液系统恶性肿瘤的对象，其包括在疾病的初期或早期的施用，其中目标是为了阻止或减缓(减少)不期望的生理学改变或紊乱。有益的或期望的临床结果包括但不限于缓和症状、减小疾病程度、使疾病状态稳定(即，不恶化)、延迟或减慢疾病进展、改善或减轻疾病状态、和缓解(部分或完全)，无论可检测的或不可检测的。治疗还指与如果不接受治疗预期的存活相比，延长存活。

在一个优选实施方式中，1型5-HTR抑制剂选自1A型、1B型、1D型、1E型和1F型5-HTR抑制剂；优选地是1A型5-HTR抑制剂。

在另一优选实施方式中，2型5-HTR抑制剂选自2A型、2B型和2C型5-HTR抑制剂；优选地选自2B型和2C型5-HTR抑制剂；更优选地为2C型5-HTR抑制剂。

本领域技术人员知道如何测定具体分子对1型5-HTR和/或2型5-HTR的亲和力，并且还知道如何测定该具体分子是否是所述受体的抑制剂。例如，分子的5-HTR亲和力可以使用Millan等描述的方法测定(Millan等J Pharmacol Exp Ther.2002；303(2)：791-804)(放射性配体结合试验)。评估化合物是否是1型5-HTR抑制剂的试验是测定Gi激活状态以及测量cAMP产生和腺苷酸环化酶的激活(Nichols D.E.和Nichols C.E.Chem Rev，2008；108(5)：1614-41)。评估化合物是否是2型5-HTR抑制剂的试验是测量膜磷酸肌醇水解作用和PKC的激活(Nichols D.E.和Nichols C.E.Chem Rev，2008；108(5)：1614-41)。可以由本领域技术人员执行以区分1型5-HTR抑制剂是否是1A型、1B型、1D型、1E型或1F型5-HTR抑制剂的试验是利用亚型特异性激动剂的竞争性激活试验。可以由本领域技术人员执行以区分2型5-HTR抑制剂是否是2A型、2B型和2C型5-HTR抑制剂的试验是使用亚型特异性激动剂的竞争性激活试验。

在一个实施方式中，5-HTR抑制剂是可以充当不同类型的5-HTR的抑制剂的非选择性抑制剂。在另一实施方式中，5-HTR抑制剂对于1型5-HTR和/或2型5-HTR是选择性的。

1型或2型5-HTR抑制剂可以是蛋白质、肽、干扰RNA、反义寡核苷酸或有机小分子等等。

在优选实施方式中，1型5-HTR抑制剂和/或2型5-HTR抑制剂选自表1的化合物或其药学上可接受的盐。

在优选的实施方式中，抑制剂是拮抗剂，并且更优选的拮抗剂选自阿扑吗啡、甲硫替平、安哌奇特和其药学上可接受的盐。术语“拮抗剂”在前面已经被限定。1型5-HTR的活性可以通过检测cAMP的增加水平(Williams C.Nat Rev Drug Discovery，2004；3(2)：125-35)和磷光体-Akt的增加水平(Suni MA.和Maino VC.Methods Mol Biol 2011；717：155-69)来测定：并且2型5-HTR的活性可以通过检测IP3和DAG的增加水平(Thomsen W.，FrazerJ.等.Curr Opin Biotechnol，2005；16(6)：655-65)和磷光体-ERK1/2的增加水平(SuniMA.And Maino VC.Methods Mol Biol 2011；717：155-69)来测定。

如本文所使用，术语“其药学上可接受的盐”指的是表1的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱盐而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括，但不限于，碱性残基(residue)比如胺的矿物或有机酸盐；酸性残基比如羧酸的碱性或有机盐；等。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这种常规无毒盐包括，但不限于，衍生自无机和有机酸的那些，所述无机和有机酸选自1，2-乙二磺酸、2-乙酸基苯甲酸、2-羟乙基磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、二碳酸(bicarbonic)、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、乙醇胂酸(glycollyarsanilic)、己基间苯二酚酸(hexylresorcinic)、异羟肟酸(hydrabamic)、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟基乙磺酸、乳酸、乳糖酸、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、辛酸(napsylic)、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸(subacetic)、琥珀酸、氨基磺酸、磺胺酸、硫酸、丹宁酸、酒石酸和甲苯磺酸。

表1的化合物的药学上可接受的盐可以从包含碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。一般而言，这种盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适合的碱或酸在水中或在有机溶剂中，或在二者的混合物中反应制备；一般而言，非水介质比如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是有用的。适合的盐的列举在Remington’sPharmaceutical Sciences，18^thed.，Mack>

在一个实施方式中，抑制剂是抑制性抗体。根据本发明，术语“抑制性抗体”被理解为指能够结合至1型5-HTR或2型5-HTR的抗体，通过其天然配体引发所述受体的激活的抑制。可以使用本领域技术人员已知的任何方法制备抗体。因此，多克隆抗体通过利用目的是被抑制的蛋白质免疫动物制备。单克隆抗体可以使用Kohler，Milstein等(Nature，1975，256：495)描述的方法制备。一旦能够结合至1型5-HTR或2型5-HTR的抗体被鉴定，使用测定1型5-HTR或2型5-HTR活性的上述试验，能够抑制1型5-HTR或2型5-HTR活性的那些抗体将被选择。本发明中的适合抗体包括含有抗原结合可变区和恒定区的完整抗体、片段“Fab”、“F(ab′)2”、“Fab‘”、Fv、scFv、双抗体和双特异性抗体。

在另一实施方式中，抑制剂是干扰RNA。如本文所使用，术语“干扰RNA”或“iRNA”指的是能够使1型5-HTR或2型5-HTR基因或对于1型5-HTR或2型5-HTR功能所需要的任何基因的表达沉默的RNA分子。为了那个目的，iRNA通常是在长度上具有至少30个碱基对的双链寡核苷酸，并且它们更优选地包括大约25、24、23、22、21、20、19、18或17个核糖核酸碱基对。几种不同类型的分子已经被有效地用于iRNA技术，包括有时也被称为短干扰RNA或沉默RNA的小干扰RNA(siRNA)、通常与siRNA不同的微小RNA(miRNA)，因为它们由单链RNA前体加工并且它们显示为仅部分地与靶mRNA和短短发夹RNA(shRNA)互补。

小干扰RNA(siRNA)试剂能够通过干扰RNA抑制靶基因表达。siRNA可以被化学合成，或者可以通过体外转录获得，或者可以在靶细胞中体内合成。通常，siRNA由在长度上15到40个核苷酸的双链RNA组成并且可以包含在长度上1到6个核苷酸的突出区(protuberantregion)3’和/或5’。突出区的长度独立于siRNA分子的总长度。siRNA通过转录后降解或靶信使的沉默起作用。

siRNA可以被称为shRNA(短发夹RNA)，其特征在于形成siRNA的反向平行链通过环或发夹区连接。siRNA由如下组成：短反义序列(19到25个核苷酸)、随后是5-9个核苷酸的环和有义链。shRNA可以可以由质粒或病毒——具体地逆转录病毒，并且更具体地，逆转录病毒——并且在启动子比如RNA聚合酶III的U6启动子的控制下编码。

本发明的siRNA与1型或2型5-HTR mRNA或该蛋白编码基因组序列基本同源。术语“基本同源”被理解为指siRNA具有与靶mRNA充分互补或相似的序列，使得siRNA可以能够通过RNA干扰诱发mRNA降解。诱发干扰的适合的siRNA包括由RNA，以及包含化学上不同修饰的siRNA形成，比如：

-siRNA，其中核苷酸之间的键与天然存在的那些不同，比如硫代磷酸键。

-链状RNA缀合物，其含有功能性试剂，比如荧光团(fluorophoro)。

-通过在2’位置处结合不同的功能性羟基修饰RNA链的末端，具体地3’端。

-糖修饰的核苷酸，比如2’位置——比如2’-O-甲基核糖或2’-O-氟核糖——处的O-烷基化自由基。

-碱基修饰的核苷酸，比如卤化碱基(例如，5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶)或烷基化碱基(例如，7-甲基-鸟苷)。

本发明的siRNA和shRNA可以使用本领域技术人员已知的一系列技术获得。例如，siRNA可以由受保护的核糖核苷亚磷酰胺在常规DNA/RNA合成器中化学合成。可选地，siRNA可以通过重组切丁酶由质粒和病毒载体产生，其中siRNA链(一条或多条)的编码区在RNA聚合酶III启动子的有效控制之下。RNase切丁酶在细胞中将shRNA加工为siRNA。

被用作siRNA的设计的基础的区是没有限制的并且可以包含编码序列(在起始密码子和终止密码子之间)的区，或者可选地，可以包含来自5’或3’非翻译区的序列，优选地在长度上25到50个核苷酸并且在关于起始密码的3’位置的任何位置中。siRNA设计的程序包括识别序列模体(sequence motive)AA(N19)TT，其中N可以是感兴趣的序列和展示高G/C含量的那些的选择中的任何核苷酸。如果所述序列模体没有被发现，则可能的是识别序列模体NA(N21)，其中N可以是任何核苷酸。

在另一实施方式中，本发明的抑制剂是对1型5-HTR和/或2型5-HTR 1特异的反义寡核苷酸，即，其序列与编码1型5-HTR或2型5-HTR的mRNA互补——即，与cDNA编码链互补——的分子。反义寡核苷酸可以与完全编码区或该完全编码区的区互补，所述完全编码区的区包括编码区与5’和3’非翻译区二者。反义寡核苷酸可以由在长度上5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多的核苷酸组成。反义寡核苷酸可以通过化学合成或者通过本领域技术人员广泛知晓的酶促结合反应获得。例如，反义寡核苷酸可以进一步包括修饰的核苷酸，其增加其生物学稳定性或在反义寡核苷酸和靶多核苷酸之间形成的双链状(bicatenary)DNA-RNA复合体的稳定性，该复合体比如硫代磷酸衍生物、肽核酸和吖啶取代的寡核苷酸。可以用于制备反义核酸的修饰的寡核苷酸包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基-胞嘧啶(citosine)、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。可选地，反义核酸可以使用表达载体生物学地产生，在该表达载体中反义定向的核酸已经被克隆。

可以在本发明中使用的另一组抑制剂是已知为核酶(ribozime)的催化活性核酸。核酶包括催化区和第二区，该第二区的序列与靶核酸互补并且对核酶给予底物特异性。在核酶与其底物之间通过杂交相互作用和靶核酸与核酶的互补区之间的偶联之后，催化区的激活产生，诱发靶核酸的分子间或分子内破裂。设计核酶的基本考虑因素对于本领域技术人员而言是众所周知的(参见，例如，Doherty和Doudna(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.2001；30：457-75)。

可以在本发明中使用的能够抑制1型5-HTR或2型5-HTR表达的其它化合物包括适配体和镜像异构体(spiegelmer)。适配体和镜像异构体是特异性地结合至蛋白质的单链或双链D-或L-核酸，导致蛋白质的生物学活性的改性。适配体和镜像异构体的长度为15到80个核苷酸，优选地，其长度为20到50个核苷酸。

用于测定抑制剂是否能够降低mRNA水平的适合方法包括，但不限于，用于测定mRNA表达水平的标准试验，比如qPCR、RT-PCR、RNA保护分析、RNA印迹、RNA斑点杂交、原位杂交、微阵列技术；基于标记的方法，比如包含变体的基因表达系列分析(SAGE)，比如LongSAGE和SuperSAGE；微阵列；荧光原位杂交，包括变体比如Flow-FISH、qFiSH和双融合FISH(D-FISH)等。

用于测定抑制剂是否通过降低1型或2型5-HTR蛋白水平起作用的适合方法包括借助于常规方法的定量，例如，使用具有特异性地结合至由基因编码的蛋白质(或结合至包含抗原决定簇的其片段)的能力的抗体，和得到的抗体-抗原复合体的随后定量。

本发明的抑制剂可以抑制1型或2型5-HTR活性至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、或至少90％，和5％与100％之间的所有范围。用于测定抑制剂是否通过降低1型或2型5-HTR活性起作用的适合方法已经在前面描述。

在另一优选实施方式中，抑制剂是1型5-HTR抑制剂，优选地拮抗剂。

根据本发明，选自1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂的5-羟色胺受体(5-HTR)抑制剂在预防和/或治疗遭受血液系统恶性肿瘤的对象中是有用的。在本发明的优选的实施方式中，对象是哺乳动物。在本发明的更优选的实施方式中，对象是任何种族和性别的人。在另一优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，更优选髓性白血病(AML)。

如本领域技术人员知道，1型5-HTR抑制剂和2型5-HTR抑制剂在血液系统恶性肿瘤治疗中的效力可以通过分析血液学反应(测量白细胞、红细胞和血小板的数目以及血红蛋白和血细胞比容的水平)、细胞遗传学反应和/或血清学肿瘤标记物来证明。

虽然个体需要改变，但是根据本发明的治疗有效量的抑制剂的使用的最佳范围的确定属于本领域技术人员的共同经验。一般而言，提供有效治疗需要的剂量——其可以由本领域的专家调节——将根据如下因素改变：年龄、健康、适应性、性别、饮食、体重、受体的改变程度、治疗频率、损伤的性质和情况、损害或疾病的性质和程度、对象的医疗条件、施用途径、药理学考虑，比如使用的具体化合物的活性、效力、药代动力学和毒理学分布，如果使用系统药物递送，和如果抑制剂作为药物组合的一部分被施用。

本发明的抑制剂可以通过任何适合的施用途径被施用，比如，但不限于，肠胃外、口腔、局部、鼻、直肠途径。在具体实施方式中，本文描述的抑制剂通过肠胃外途径，例如通过静脉内、囊内、腹膜内、皮下、皮内、肌肉内或硬膜外施用而被施用。

2-识别来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞的方法

本发明的发明人已经发现来自血液系统恶性肿瘤——特别是来自AML——的恶性肿瘤细胞以与健康供体相比显著更高的量表达1型5-HTR和/或2型5-HTR。因此，血细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达的检测可以用于识别来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞。

在另一方面，本发明涉及用于在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中识别来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括检测所述细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达。

如本领域技术人员可以知道，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达还可以通过检测所述受体的功能等价变体的表达来检测。

“功能等价变体”被理解为指源自1型5-HTR或2型5-HTR的序列中一个或多个氨基酸的修饰、插入和/或缺失的所有那些蛋白质，只要功能基本上被维持。

1型5-HTR的活性可以通过检测cAMP的降低水平和磷光体(phospho)-AKt的增加水平来测定；并且2型5-HTR的活性可以通过检测IP3和DAG的增加水平以及磷光体-ERK1/2的增加水平来测定。

优选地，1型5-HTR和/或2型5-HTR的变体是(i)如此多肽，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)置换并且这样置换的氨基酸可以被遗传密码编码或者可以不被遗传密码编码，(ii)如此多肽，其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基结合修饰的残基，(iii)来源于相似mRNA的可选加工的多肽，(iv)多肽片段和/或(v)来源于1型5-HTR和/或2型5-HTR融合的多肽或者在(i)至(iii)中限定的多肽以及另一种多肽，比如分泌型前导序列或用于纯化(例如，His标记)或用于检测(例如，Sv5表位标记)的序列。片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白酶解)生成的多肽。变体可以被翻译后或化学修饰。这样的变体都应该对于本领域技术人员显而易见。

如本领域中公知，两个多肽之间的“相似性”通过将从多肽保存的氨基酸序列和置换的氨基酸与第二多肽的序列进行比较来测定。变体被限定为包括与原始序列不同的多肽序列，优选地与原始序列相比每个关心的区段少于40％残基的不同，更优选地与原始序列相比每个关心的区段少于25％残基的不同，更优选地与原始序列相比每个关心的区段少于10％残基的不同，更优选地与原始序列相比每个关心的区段仅几个残基的不同，并且同时，充分地与原始序列同源以保存原始序列的功能。本发明包括与原始氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％相似性或同一性的氨基酸序列。两个多肽之间的同一性程度可以使用计算机算法和本领域技术人员广泛知晓的方法来测定。两个氨基酸序列之间的同一性优选地使用BLASTP算法[BLASTManual，Altschul，S.等，NCBI>

1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中测定。

来自骨髓的样本可以通过本领域中已知的吸引术和环锯活组织检查获得。血液样本可以通过常规方法，使用本领域技术人员的现有技术已知的过程获得，所述过程比如通过刺穿动脉或静脉——通常地来自肘的内部或来自手背的静脉——的血液提取，血液样本在气密小瓶或注射器中收集。淋巴结通过对所有或部分淋巴结的活组织检查(切除氏淋巴结活组织检查或切开氏淋巴结活组织检查)获得。

表达“检测表达”指的是检测在其表面上携带1型5-HTR和/或2型5-HTR或表达1型5-HTR和/或2型5-HTR mRNA的样本中血液学细胞(haematological cell)的存在。所述检测可以是定性的或定量的。

在一个实施方式中，用于识别本发明的恶性肿瘤细胞的方法不需要测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。

在另一实施方式中，用于识别本发明的恶性肿瘤细胞的方法包括测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。

如本文所使用，表达“测定表达水平”指的是测定生物标记(1型5-HTR和/或2型5-HTR)的表达水平和/或在其表面(即，细胞表面标记)上携带该生物标记的细胞数目。在其中，表达水平指的是mRNA的水平和/或蛋白质的水平和/或在其表面上携带生物标记的细胞数目。

用于检测表达的方法可以基于检测1型5-HTR和/或2型5-HTR mRNA或蛋白质，或者它们还可以基于测定mRNA水平或蛋白质水平和其变体的水平，在作为整体的样本中、在样本的细胞中和/或在样本的非细胞部分中进行。

用于检测mRNA的方法在本领域中是熟知的并且包括，例如，实时PCR(rtPCR)、RNA印迹法、纳米链(nanostring)和微阵列技术。

通过非限制性说明，表达水平通过由所述基因编码的mRNA的水平的定量来测定。后者可以通过使用常规方法来定量，例如，包括mRNA的扩增和所述mRNA的扩增产物的定量的方法，比如电泳和染色，或者任选地，通过RNA印迹和使用感兴趣基因的mRNA或其对应的eDNA/cRNA的适合探针、利用S1核酸酶作图、RT-PCR、杂交、微阵列等。同样地与由标记基因编码的所述mRNA对应的cDNA/cRNA的水平还可以通过使用常规技术来定量；在这种情况下，本发明的方法包括如下步骤：通过对应mRNA的逆转录(RT)合成对应cDNA，接着合成(RNA聚合酶)和扩增与所述eDNA互补的cRNA。

为了使不同样本之间的mRNA表达的值标准化，将测试样本中感兴趣的mRNA的表达水平与对照RNA的表达进行比较是可能的。如本文所使用，“对照RNA”指的是其表达水平不改变或仅以限制的量改变的RNA。优选地，对照RNA是源自管家基因的mRNA并且其编码组成性表达并且实施基本细胞功能的蛋白质。在本发明中使用的优选的管家基因包括18-S核糖体蛋白、β-2-微球蛋白、泛素、亲环蛋白、GAPDH、PSMB4、微管蛋白和β-肌动蛋白。

任选地，还可能的是通过测定由1型5-HTR和/或2型5-HTR基因编码的蛋白质的表达水平来测定所述基因的表达水平，这是由于如果基因的表达增加，则对应蛋白的量的增加应当发生，并且如果基因的表达降低，则对应蛋白的量的降低应当发生。

基本上，任何常规方法可以在本发明的构架内使用以检测和定量蛋白质的水平。通过非限制性说明，表达水平通过具有特异性地结合至将要被测定的蛋白质(或者结合至包含抗原决定簇的其片段)的能力的抗体和随后定量得到的抗原-抗体复合体来测定。将在该类型的试验中使用的抗体可以是，例如，多克隆血清、杂交瘤上清液或多克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、双抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabody)和人源化抗体。同时，抗体可以被标记或者可以不被标记。可以使用的说明性但是非排他性的实例包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶辅因子或底物、酶抑制剂、微粒、染料等。存在可以在本发明中使用的多种众所周知的试验，其使用非标记的抗体(一次抗体)、标记的抗体(二次抗体)或1型或2型5-HTR的标记的拮抗剂或激动剂；这些技术包括蛋白质印迹或免疫印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)、竞争性EIA(酶免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体酶联免疫吸附测定)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、免疫荧光、基于使用包含特异性抗体的生物芯片或蛋白微阵列的技术或基于在格式(format)比如试剂条中胶体沉淀的试验。检测和定量蛋白质的其它形式包括亲和层析技术、配体结合试验等。

在本发明的优选实施方式中，表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞通过免疫细胞化学，优选地通过免疫荧光检测。

在本发明的优选实施方式中，检测1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达或测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的水平通过免疫荧光执行。免疫荧光(IF)是如此技术：其用于含有荧光显微镜的光学显微镜并且主要用于生物样本。该技术使用抗体对它们的抗原的特异性以将荧光染料靶向至细胞内特定的生物分子靶标，并且因而使得靶分子通过样本的分布可视化。IF是免疫染色的广泛使用的实例并且是免疫组织化学(IHC)或免疫细胞化学(ICC)——其使用荧光团以使抗体的位置可视化——的具体实例。IF可以用于组织切片、培养的细胞系或单个细胞。IF可以与例如使用DAPI标记DNA的荧光染色的其它非抗体方法结合使用。几种显微镜涉及可以被用于分析IF样本；最简单的是荧光显微镜，并且共聚焦显微镜也是广泛使用的。也可以使用能够具有更高分辨率的各种超分辨率显微镜。在优选的实施方式中，恶性肿瘤细胞的识别通过流式细胞术执行，其是在细胞技术、细胞分选和生物标记检测中采用的基于激光的生物物理技术，通过将细胞悬浮在流体流中并使它们通过电子检测器。

根据本发明，在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中检测1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达在识别来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞中是有用的。

在优选的实施方式中，血液样本是外周血。

在另一个优选的实施方式中，1型5-HTR是5-HTR 1A和2型5-HTR选自5-HTR 2A、5-HTR 2B和5-HTR 2C。在更优选的实施方式中，2型5-HTR是5-HTR 2C。

在另一优选的实施方式中，用于识别恶性肿瘤细胞的本发明的方法包括检测5-HTR1A和5-HTR2C的表达。

在优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，更优选地急性髓性白血病。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

3-诊断血液系统恶性肿瘤的方法

在另一方面，本发明涉及用于诊断对象中血液系统恶性肿瘤的体外方法，其包括通过根据本发明的方法识别恶性肿瘤细胞，具体地识别选自骨髓、血液和淋巴结的样本中来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞，所述方法包括检测所述细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达。

如本文所使用，诊断指的是试图确定和/或识别对象中的可能疾病的过程，即诊断程序，和通过该过程达到的意见，即诊断意见。因此，其还可以被视为尝试将个体状况分类为单独的和不同的类别——其允许与将要被进行的治疗和预后有关的医疗决策。如本领域技术人员将理解，虽然是优选的，但是血液系统恶性肿瘤的诊断不需要校正将要被诊断的或评估的100％的对象。但是，该术语要求对象的统计学上显著的部分被识别为遭受血液系统恶性肿瘤。对象是否是统计学上显著的可以在不需要进一步麻烦的情况下由本领域技术人员使用各种熟知的统计学评估工具来确定，例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验(Student′s t-test)、曼-惠特尼检验等。细节在Dowdy和Wearden，Statistics>

在优选的实施方式中，用于检测对象中血液系统恶性肿瘤的方法包括：

(a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平，和

(b)将所述水平与参比值进行比较

其中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平相对于参比值的增加表明对象正在遭受血液系统恶性肿瘤。

参比值源自优选地通过来自不受血液系统恶性肿瘤影响的正常个体的将要被分析的样本的混合物形成的样本收集。所述参比值可以通过现有技术中熟知的技术来测定，例如，测定在取自健康对象的样本中测量的1型5-HTR和/或2型5-HTR蛋白的水平的平均值。参比值还可以从取自将要被分析的相同对象的组成型表达蛋白获得。

在优选的实施方式中，血液样本是外周血。在另一优选的实施方式中，1型5-HTR是5-HTR 1A并且2型5-HTR选自5-HTR 2A、5-HTR 2B和5-HTR 2C。在更优选的实施方式中，2型5-HTR是5-HTR 2C。

在另一优选的实施方式中，本发明的用于诊断血液系统恶性肿瘤的方法包括检测5-HTR 1A和5-HTR 2C的表达。

在优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，更优选地急性髓性白血病。

在另一优选的实施方式中，表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞通过免疫细胞化学，优选地通过免疫荧光，更优选地通过流式细胞术检测。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

4-分离恶性肿瘤细胞的方法

在另一方面，本发明涉及在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中分离来自血液系统恶性肿瘤的恶性肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括检测所述细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达和分离表达所述5-HTR的所述细胞。

如本文所使用，术语“分离”意思是从在选自骨髓、血液和淋巴结的样本中存在的剩余成分中识别和分离或去除恶性肿瘤细胞。

在优选的实施方式中，血液样本是外周血。

在另一优选的实施方式中，1型5-HTR是5-HTR 1A并且2型5-HTR选自5-HTR 2A、5-HTR 2B和5-HTR 2C。在更优选的实施方式中，2型5-HTR是5-HTR 2C。

在另一优选的实施方式中，用于分离恶性肿瘤细胞的本发明的方法包括检测5-HTR 1A和5-HTR 2C的表达。

在优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，更优选地急性髓性白血病。

在另一优选的实施方式中，表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞通过免疫细胞化学，优选地通过免疫荧光，更优选地通过流式细胞术检测。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

5-测定预后的方法

在另一方面，本发明涉及用于测定遭受血液系统恶性肿瘤的对象的预后的体外方法，其包括：

(a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平，和

(b)将所述水平与参比值进行比较

其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于参比值的降低表明对象展示了良好预后，或者其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于参比值的增加表明对象展示了不良预后。

在优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，并且更优选地急性髓性白血病。

如本文所使用，术语“测定”指的是可以用于测定患者的演化的任何参数。如本领域技术人员将理解，虽然是优选的，但是结果的预测不需要校正将要被诊断或评估的100％的对象。但是，该术语要求对象的统计学上显著的部分被识别为具有含有给定结果的增加的可能性。对象是否是统计学上显著的可以在不需要进一步麻烦的情况下由本领域技术人员使用各种熟知的统计学评估工具来确定，例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、曼-惠特尼检验等。细节在Dowdy和Wearden，Statistics>

如本文所使用，术语“预后”意思是从疾病恢复的可能性或疾病的可能发展或结果的预测，包括但不限于预测总存活(OS)的长度、1年存活(1YS)、治疗反应(RT)、无病存活、无进展存活和无事件存活。如本领域技术人员将理解，虽然是优选的，但是预测不需要校正将要被诊断或评估的100％的对象。但是，该术语要求对象的统计学上显著的部分被识别为具有含有给定结果的增加的可能性。对象是否是统计学上显著的可以在不需要进一步麻烦的情况下由本领域技术人员使用各种熟知的统计学评估工具来确定，例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、曼-惠特尼检验等。细节在Dowdy和Wearden，Statistics>

标准准则(Miller等Cancer，1981；47(1)：207-14)可以因此用于评估患者响应治疗的临床结果。对于测定治疗效力广泛接受的任何参数可以用于测定患者响应治疗的临床结果，并且包括但不限于：

·无病进展，如本文所使用，其描述完全缓解的对象的比例，该对象在研究的时期期间没有疾病的复发。

·无病存活(DFS)，如本文所使用，被理解为疾病治疗之后的时间长度，在疾病治疗之后的期间对象在没有疾病征兆的情况下存活。

·目标反应，如本文所使用，其描述被治疗的对象的比例，在该对象中观察到完全或部分反应。

·肿瘤控制，如本发明中所使用，涉及被治疗的对象的比例，在该对象中观察到完全反应、部分反应、轻微反应或疾病稳定≥6个月。

·无进展存活，如本文所使用，被限定为从治疗开始到第一次测量肿瘤生长的时间。

·进展时间，如本文所使用，指的是疾病被治疗后直到疾病开始恶化的时间。术语“进展”在前面已经被限定。

·六个月无进展存活，如本文所使用，其指的是治疗开始之后的前六月中无进展对象的百分比。

·总存活(OS)，如本文所使用，被限定为原发性癌症的诊断之后存活的患者的百分比。

·生存中值，如本文所使用，涉及研究中登记的对象的一半仍活着的时间，和

·细胞遗传危险分级(Cytogenetic>

在优选的实施方式中，患者的临床结果通过测定细胞遗传危险分级来测量。

用于测定预后的体外方法的第一步骤包括测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。测定生物标记的表达水平指的是测定生物标记的表达水平和/或在其表面(即细胞表面标记)上携带生物标记的细胞的数目。在其中，表达水平指的是mRNA的水平或蛋白质的水平和/或在其表面上携带生物标记的细胞的数目。用于测定生物标记的表达水平的方法的实例在前面被描述。

在另一优选的实施方式中，用于测定遭受血液系统恶性肿瘤的对象的预后的体外方法包括通过测量由1型5-HTR基因和/或2型5-HTR基因编码的mRNA或其变体的水平来测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。在另一优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过测量1型5-HTR蛋白和/或2型5-HTR蛋白的水平或其变体的水平来测定。在更优选的实施方式中，mRNA表达水平通过PCR测定。在另一优选的实施方式中，蛋白质或其变体的表达水平通过蛋白质印迹或免疫细胞化学来测定。在更优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过半定量聚合酶链反应来测定。

在另一优选的实施方式中，血液样本是外周血。

在优选的实施方式中，用于测定遭受血液系统恶性肿瘤的对象的预后的体外方法包括测定1型5-HTR的水平。在更优选的实施方式中，1型5-HTR选自5-HTR 1A和5-HTR-1B。

在优选的实施方式中，方法包括测定5-HTR 1A和5-HTR-1B的水平。

在第二步骤，用于测定预后的体外方法包括将1型5-HTR和/或2型5-HTR的水平与参比值进行比较。如果对象展示良好或不良预后，所述比较允许结束。

在优选的实施方式中，由本发明的体外方法测定的预后是5年存活的概率。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

6-监测疗法效果的方法

在另一方面，本发明涉及用于监测遭受血液系统恶性肿瘤和用疗法治疗的对象中所述疗法效果的方法，其包括：

a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平，和

b)将所述水平与更早时间点处来自所述对象的样本的细胞中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平进行比较

其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于更早时间点处来自所述对象的样本中测定的水平的降低表明疗法是有效的，或者其中1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平相对于更早时间点处来自所述对象的样本中测定的水平的增加表明疗法是无效的。

在优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，并且更具体地急性髓性白血病。

如本领域技术人员所理解，疗法涉及治疗血液系统恶性肿瘤。通过非限制性实例，可以使用阿糖胞苷(ara-C)与道诺霉素(柔毛霉素)或伊达比星、氟达拉滨(fludarabine)或拓扑替康的组合。在另一实施方式中，疗法是1型5-HTR抑制剂或2型5-HTR抑制剂。

用于测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平的方法已经在前面详细地描述。

在优选的实施方式中，用于监测遭受血液系统恶性肿瘤的对象中疗法效果的体外方法包括测定1型5-HTR的水平。在更优选的实施方式中，1型5-HTR选自5-HTR 1A和5-HTR-1B。

在优选的实施方式中，方法包括测定5-HTR 1A和5-HTR-1B的表达水平。

在另一优选的实施方式中，血液样本是外周血。

在另一优选的实施方式中，用于监测遭受血液系统恶性肿瘤的对象中疗法效果的体外方法包括通过测量由1型5-HTR基因和/或2型5-HTR基因编码的mRNA或其变体的水平来测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。在另一优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过测量1型5-HTR蛋白和/或2型5-HTR蛋白的水平或其变体的水平来测定。

在另一优选的实施方式中，mRNA表达水平通过通过PCR测定。在另一优选的实施方式中，蛋白质或其变体的表达水平通过蛋白质印迹或免疫细胞化学来测定。在更优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过半定量聚合酶链反应来测定。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

7-设计定制疗法的方法

在另一方面，本发明涉及为诊断患有血液系统恶性肿瘤的对象设计定制疗法的体外方法，其包括

a)测定来自所述对象的选自骨髓、血液和淋巴结的样本中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平，和

b)将所述水平与参比值进行比较

其中表达1型5-HTR和/或2型5-HTR的细胞的水平相对于参比值的增加表明对象要用1型5-HTR抑制剂和/或2型5-HTR抑制剂治疗。

给诊断患有血液系统恶性肿瘤的对象设计定制疗法被理解为基于1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达，决定适合时施用1型5-HTR抑制剂和/或2型5-HTR抑制剂。

在优选的实施方式中，5-HTR抑制剂选自表1的化合物或其药学上可接受的盐。

在更优选的实施方式中，5-HTR抑制剂选自阿扑吗啡、甲硫替平、安哌奇特和其药学上可接受的盐。

在优选的实施方式中，用于在遭受血液系统恶性肿瘤的对象中设计定制疗法的体外方法包括包括测定1型5-HT的表达水平。在更优选的实施方式中，1型5-HTR选自5-HTR 1A和5-HTR-1B。

在优选的实施方式中，方法包括测定5-HTR 1A和5-HTR1B的表达水平。

在另一优选的实施方式中，血液系统恶性肿瘤是白血病，并且更优选地急性髓性白血病。

在另一优选的实施方式中，血液样本是外周血。

在另一优选的实施方式中，用于监测遭受血液系统恶性肿瘤的对象中疗法效果的体外方法包括通过测量由1型5-HTR基因和/或2型5-HTR基因编码的mRMA或其变体的水平来测定1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平。在另一优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过测量1型5-HTR蛋白和/或2型5-HTR蛋白的水平或其变体的水平来测定。在更优选的实施方式中，mRNA表达水平通过PCR测定。在另一优选的实施方式中，蛋白质或其变体的表达水平通过蛋白质印迹或免疫细胞化学来测定。在更优选的实施方式中，1型5-HTR和/或2型5-HTR的表达水平通过半定量聚合酶链反应来测定。

前面描述的所有的术语和实施方式同样适用于本发明的该方面。

***

本发明将通过下面的实施例来描述，这些实施例被视为仅是说明性的并且不限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

实施例1. 1型和2型5-羟色胺受体(5HTR)拮抗剂对AML细胞系具有细胞毒性作用。

为了测试5HTR拮抗剂的抗白血病作用，HL-60(Collins，Gallo等Nature.1977；270(5635)：347-9)、MonoMac-1(Steube，Teepe等Leuk Res.1997；21(4)：327-35)、KG-1(Koeffler和Golde.Science.1978；200(4346)：1153-4)和Kasumi-1(Asou，Tashiro等Blood.1991；77(9)：2031-6)AML(急性髓性白血病)细胞系用宽的5HTR拮抗剂阿扑吗啡(CAS号314-19-2)在不同剂量下处理72h。在96孔板中，将每mL一百万接种在补充有10％胎牛血清的完全RPMI培养基中。用于阿扑吗啡处理的浓度为0.1、1和10μM。如图1中所示出，细胞活力的降低以剂量反应方式在所有被测试的AML细胞系中被检测到。

人5HTR家族由7种亚型(从1到7)的受体组成(Nichols和Nichols.Chem Rev 2008，108：16414-41)。HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1AML细胞系用亚型特异性5HTR拮抗剂：阿扑吗啡(1、2和5型)、甲硫替平(1和2型)(CAS号74611-28-2)、安哌奇特(2型)(CAS号75558-90-6)、GR113808(4型)(CAS号144625-51-4)培育。在处理后72小时，细胞活力通过流式细胞术测定。细胞用7-AAD(CAS号7240-37-1)和Hoechst 33342(CAS号23491-52-3)染色。细胞生存力通过7-AAD染色排斥和Hoechst正染色的存在来确定。细胞计数通过体积来测量。仅阿扑吗啡、甲硫替平和安哌奇特诱导AML细胞系中的细胞死亡(图2)；因此，1型和2型5THR的抑制对AML细胞具有细胞毒性作用。事实上，抗白血病作用在竞争性激动剂比如天然配体5-HT(CAS号153-98-0)或5-CT(CAS号74885-72-6)的存在下被逆转。

实施例2. 1型和2型5-羟色胺受体(5HTR)拮抗剂对原发性患者AML样本具有细胞毒性作用。

原发性AML患者样本用0.1、1和10μM的1和2亚型HTR拮抗剂处理24和72h。将每mL五十万个细胞接种在补充有胰岛素、运铁蛋白、牛血清白蛋白、IL3和非必需氨基酸的IMDM中。细胞生存力通过如上面描述的流式细胞术测量。与AML细胞系类似，阿扑吗啡和甲硫替平治疗都以剂量反应方式诱导原发性AML母细胞的细胞死亡(图3和4)。

与正常造血系统相同，AML被认为组织为细胞的不同和功能上异源种类的阶层，其最终通过具有增强的自我更新能力、受损的分化能力和增加抗药性的少量白血病干细胞(LSC)维持(Bonnet和Dick Nat Med.1997；3(7)：730-7)。LSC群被发现在CD34+CD38-AML母细胞群内富集。基于存在CD34和不存在CD38，阿扑吗啡和甲硫替平降低由流式细胞术识别的大部分原发性LSC富集的母细胞群(图3和4)的细胞生存力。事实上，原发性部分的降低显著高于混合群体中的降低；因此，5HTR拮抗剂选择性地影响LSC。

实施例3. 5HTR拮抗剂诱导AML细胞系的分化

如上面所述，HL-60、KG-1、MonoMac-1和Kasumi-1AML细胞系用不同浓度的阿扑吗啡和甲硫替平处理72小时。分化相关的表面标记的表达通过流式细胞术测量。在所有AML细胞系中，5HTR拮抗剂的存在诱导CD11c、CD11b和CD14的表达(图5)。

类似地，阿扑吗啡和甲硫替平诱导原发性AML患者样本中髓样标记的上调(图6和7)。

实施例4. 5HTR拮抗剂对健康血细胞和健康造血干细胞/祖细胞都没有作用

来自健康供体的外周血细胞被分离并使用与对于原发性患者AML样本相同的条件利用5HTR拮抗剂处理。与后者不同，健康血细胞在用阿扑吗啡或甲硫替平处理之后保持不受影响(图8)。

为了研究5HTR拮抗剂处理对造血干细胞/祖细胞的作用，来自健康供体的脐带血样本的单核细胞被分离并且谱系-阴性(lineage-negative)部分在阿扑吗啡的存在下培养。与AML细胞不同，原发性造血干细胞/祖细胞在处理之后保持不受影响。细胞生存力的显著改变没有在每个群体的频率或细胞的绝对数目中观察到(图9)。

实施例5. 5HTR拮抗剂降低AML母细胞的产克隆能力同时健康造血肝细胞免受影响

考虑到5HTR拮抗剂降低大部分原发性AML群体的细胞生存力，研究处理之后的产克隆能力。原发性患者AML样本在阿扑吗啡和甲硫替平的存在下培养18h并且在每mL五万个细胞的浓度下在有益细胞因子(instructive cytokine)的存在下在半固体甲基纤维素培养基中平板培养(plate)14天。通过光学显微镜基于形态学和细胞结构对集落进行计数。如图10中所示出，两种5HTR拮抗剂降低原发性AML样本的产克隆能力，其通过获得的CFU-B的数目测量。

接着，如上面对AML细胞的做法，谱系缺失的脐带血细胞用阿扑吗啡或甲硫替平处理。在平板培养后14天，通过光学显微镜基于形态学和细胞结构对集落进行计数。5HTR拮抗剂都不影响健康造血干细胞/祖细胞的产克隆能力，如通过集落的总数目或每种亚型的CFU的频率测量的(图11)。

实施例6. 5HTR差异地在AML患者样本中表达

为了测定5HTR是否在AML患者样本与健康血液样本中差异地表达，通过流式细胞术研究原发性患者AML外周血液样本、健康供体外周血液样本和AML细胞系中的其表达。如图12中所示出，原发性患者AML外周血细胞以与健康供体相比显著更高的量表达5HTR。

实施例7. 5HTR表达与AML患者的临床结果相关联。

5HTR1A和5HTR1B mRNA表达水平在原发性患者AML样本中被测定并且与临床结果相关联。基于细胞遗传风险：良好(有利分子组)和不良(不利分子组)，限定两个患者组。在两种情况下，在每种5HTR mRNA的高表达和更坏的临床结果之间存在关联(图13)。

实施例8. 5-羟色胺受体(5HTR)拮抗剂降低二次CFU中AML细胞的产克隆能力

为了测试体外产克隆能力，将来自AML患者的等量的阿扑吗啡-、甲硫替平-和运载体-处理的原发性CFU-B(如在实施例5中解释)连续地在每mL五万个细胞的浓度下在有益细胞因子的存在——但是不存在任何药物——下在半固体甲基纤维素培养基中平板培养14天。通过光学显微镜基于形态学和细胞结构对集落进行计数。如图14中所示出，在处理之后观察到产克隆能力的降低。

实施例9.用5-羟色胺受体拮抗剂处理降低体内异种移植小鼠模型中的AML负荷，而健康血细胞免受影响

白血病细胞主要驻留在骨髓龛中，在骨髓龛中基质细胞室提供强烈地介导白血病细胞的生存和增殖并且保护白血病细胞免受细胞凋亡的旁分泌信号。因此，条件免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdc^scid>tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(Sanchez等Leukemia.2009Nov；23(11)：2109-17)被移植有人AML细胞并且保持7小时以便建立白血病。其后，用总计4倍腹膜内剂量的阿扑吗啡(5mg/kg重)(Schmidt等J>

白血病起源细胞(LIC)或LSC是在异种移植小鼠模型中移入AML细胞的原因并且被认为引起和维持人的疾病。原发性AML患者样本用5HTR拮抗剂离体处理18h并且被移植入条件免疫缺陷的NSG小鼠。在移植之后8周，分析小鼠骨髓人AML细胞的存在。如图16中所示，阿扑吗啡-和甲硫替平-处理的AML细胞与运载体-处理的AML细胞相比展示较低的归巢和移入能力。有趣的是，在用阿扑吗啡和甲硫替平处理之后，在谱系缺失的UCB细胞的正常造血再生能力方面观察到微不足道的作用(图16)。

为了测试移入的样本中保留的体内自我更新能力，进行二次移植。注射有阿扑吗啡-或甲硫替平-处理的细胞的小鼠中检测到少于35％的AML细胞(图17)。但是，健康造血干细胞在处理之后保留了它们的自我更新和分化能力，如在二次移植中由它们的再生潜力示出的(图17)。而且，移入的样本的产克隆能力在用5HTR1拮抗剂处理的AML细胞中显著降低，如通过CFU试验测量的。有趣的是，在移入的健康HSC中观察到较小作用(图17)。