肺高血压病的检查方法

摘要

本发明的主要课题在于，提供一种能够简便且准确地检查肺高血压病的方法。作为解决所述的课题的发明，提供一种肺高血压病的检查方法，其以源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度为指标。

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种肺高血压病的检查方法。另外，本发明还涉及一种用于检出肺高血压病的生物标记、肺高血压病的检查试剂盒。

背景技术

肺高血压病是因各种原因而肺动脉的血压升高的疾病。在WHO等的分类中，被分类为：肺动脉性肺高血压病(Pulmonary arterial hypertension(PAH))、左心疾病所致肺高血压病(Pulmonary hypertension owing to left heart disease)、肺疾病和/或低氧导致的肺高血压病(Pulmonary hypertension owing to lung disease and/or hypoxia)、慢性血栓栓塞性肺高血压病(Chronic thromboembolic pulmonary hypertension(CTEPH))、及其它的原因不明的复合因素引起的肺高血压病(非专利文献1～5)。在日本，被指定为疑难病(特定疾病)的疾病包括多种，在末期症状中，也有时需要肺移植。

例如，在肺动脉性肺高血压病中，产生微小肺动脉的狭窄，由此，肺动脉的血压异常地升高。微小肺动脉的狭窄认为是血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的异常的增殖或变性引起的。肺动脉性肺高血压病为未治疗时的5年存活率为20％的致死性疾病。早期诊断对循环器专科医生而言也困难，大多在被诊断的时刻已经处于晚期。救治重症患者的手段依然除肺移植以外没有其它办法，但受脏器移植提供者数量限制，等不到移植之时的病例多。许多年青病例迅速地发展，通过内科的多剂并用疗法也因右心心力衰竭而丧命的病例连续不断。近年来，在日本，患者数存在增加倾向，但疾病的原因还不能充分地得知。

近年来，由于治疗方法的进步，如果可以对肺高血压病准确地进行诊断，则可以期待充分的治疗效果。特别是如果发现为初期，则可以期待治疗的效果，可以期待预后的改善。例如，可以在初期的阶段发现肺动脉性肺高血压病的情况下，通过进行适当的处理，5年存活率达到50％左右。

但是，肺高血压病的患者在初期诉说的自觉症状停留在辛勤劳动时的气喘、倦怠感等非特异的症状。因此，医师需要主要通过问诊来判断患者具有肺高血压病的可能性。进而，为了准确地检查肺高血压病，需要进行右心导管检查、肺换气/血流闪烁图、胸部造影CT等检查。即，肺高血压病的检查需要住院，对患者及医疗从业者这两者而言负担大，现状即如此。

在这种现状下，期望在门诊中主要以筛选目的、可以通过采血等而实施的、能够简便且准确地检查肺高血压病的方法。

另外，硒蛋白P(Selenoprotein P)蛋白质为含Se的蛋白质(selenoprotein family)之一，为具有多个硒代半胱氨酸残基的蛋白质。也查明：硒蛋白P蛋白质成为2型糖尿病中的胰岛素抵抗性的原因之一；在肝细胞中，来自细胞外的硒蛋白P蛋白质引起的刺激抑制细胞内的AMPK活性(非专利文献6)。但是，硒蛋白P蛋白质、包含其信号路径在内，尚不清楚的方面较多。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:日本循环器学会：肺高血圧症治療ガイドライン(肺高血压病治疗指导方针)(2012年改订版)

非专利文献2:J Am Col Cardiol 2009；54(suppl):S78-84.

非专利文献3:Circulation 2009；119:2250-2294.

非专利文献4:Eur Heart J 2009；30:2493-2537.

非专利文献5:Euro Respir J 2009；34:1219-1263.

非专利文献6:Cell Metabolism 2010；12:483-495.

非专利文献7:J Am Col Cardiol 2013；62(25suppl):D34-41.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的主要课题在于，主要提供一种肺高血压病的检查方法；特别是提供一种能够简便且准确地检查肺高血压病的方法。另外，本发明的课题还在于，提供一种用于检测肺高血压病的生物标记、肺高血压病的检查试剂盒。

本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：将源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度作为指标，能够检查肺高血压病。本发明是通过基于所述的见解进一步重复进行研究而完成的。

即，本发明包含下述中揭示的方式的发明。

项1、一种肺高血压病的检查方法，其以源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度为指标。

项2、如第一发明所述的方法，其包括：[1]测定源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度的工序；及

[2]基于上述[1]的结果，评价肺高血压病的有无和/或风险的工序。

项3、如第二发明所述的方法，其中，在硒蛋白P蛋白质的浓度大于预先设定的截断值的情况下，评价为肺高血压病和/或存在发病的风险。

项4、如第一发明～第三发明中任一项所述的方法，其中，源自被检对象的试样为血浆。

项5、一种用于检测肺高血压病的生物标记，其包含硒蛋白P蛋白质。

项6、一种肺高血压病的检查试剂盒，其包含用于测定源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度的单元。

项7、一种肺高血压病的治疗方法，其包括下述的工序：

(i)将源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度作为指标，进行肺高血压病的检查的工序；及

(ii)对被检出肺高血压病的被检对象进行处置的工序，所述处置为用于对肺高血压病进行治疗和/或进行肺高血压病的发展的预防的处置。

发明效果

根据本发明，提供一种能够简便且准确地检查肺高血压病的方法。本发明的检查方法能够通过检查患者的血液而进行，由于可以通过门诊而实施等理由，对患者及医疗从业者这两者的负担小。

根据本发明的检查方法，对肺高血压病的患者积极地进行检查，其结果，期待患者可以早期接受有效的治疗。

附图说明

图1：利用箱线图表示肺高血压病患者(PH、N＝146)及对照患者(Control、N＝19)的血浆中硒蛋白P蛋白质的浓度的测定结果。在肺高血压病患者的血浆中，硒蛋白P蛋白质的浓度(ng/ml)上升。P<0.001

图2：表示源自特发性肺动脉性肺高血压病患者的肺血管平滑肌细胞中的硒蛋白P蛋白质的检测结果。表示在正常氧压(normoxia)、低氧压(hypoxia)及法舒地尔(fasudil)存在下的低氧压(hypoxia+fasudil)的各自的条件下的、独立试行4例的结果。上段表示全细胞溶解液(whole cell lysates)中的基于免疫印迹分析的硒蛋白P蛋白质的检测，下段表示条件培养基(conditioned medium)中的基于免疫印迹分析的硒蛋白P蛋白质的检测。

图3：利用箱线图表示肺高血压病患者(PH、n＝203)及对照患者(Control、n＝20)的血浆中硒蛋白P蛋白质的浓度的测定结果。

图4：利用箱线图表示按照病型分类的肺高血压病患者的血浆中硒蛋白P蛋白质的浓度的测定结果。图中的星标及圆标表示离群值。

具体实施方式

1.肺高血压病的检查方法

肺高血压病

本发明的检查方法以肺高血压病为对象。

肺高血压病包含作为临床所见可看到上升的肺动脉压(mPAP、例如25mmHg以上)的疾病。肺高血压病包含肺动脉性肺高血压病(Pulmonary arterial hypertension(PAH))、左心疾病所致肺高血压病(Pulmonary hypertension owing to left heart disease)、肺疾病和/或低氧导致的肺高血压病(Pulmonary hypertension owing to lung disease and/or hypoxia)、慢性血栓栓塞性肺高血压病(Chronic thromboembolic pulmonary hypertension(CTEPH))、其它的原因不明的复合因素引起的肺高血压病等。

作为肺高血压病的一病态，可举出肺动脉性肺高血压病。作为肺动脉性肺高血压病的显著的临床所见，可举出：上升的肺动脉压(mPAP、例如25mmHg以上)和正常的肺动脉楔入压(右心房压)(PCWP、例如15mmHg以下)(以上，例如可以通过右心导管检查进行测定。)；没有看到肺血流分布的异常(例如可以通过肺换气、血流闪烁图检查进行测定。)。

肺动脉性肺高血压病是血管内皮功能降低、血管平滑肌细胞增殖、炎症细胞浸润等复杂地相互作用、肺微小血管的壁肥厚或狭小化(肺血管重塑)进展的致死性疾病。早期诊断对循环器专科医生而言也困难，在被介绍到肺移植实施设施的时刻，大多已经处于晚期。救治重症患者的最终手段依然除移植以外没有其它办法，但受脏器移植提供者数量限制，等不到移植之时的病例多。其中，许多特发性肺动脉性肺高血压病患者(Idiopathic PAH、IPAH)显示迅速的发展，显示以肺动脉血管平滑肌细胞的异常增殖为特征的高度的肺动脉重塑，因此，通过内科的多剂并用疗法也难以控制右心心力衰竭，年轻时丧命的病例连续不断。因此，需要在病期进展之前早期进行诊断及治疗。

肺动脉性肺高血压病包含：特发性肺动脉性肺高血压病(Idiopathic pulmonary arterial hypertension(IPAH))、遗传性肺动脉性肺高血压病(Heritable pulmonary arterial hypertension)、药物/毒物诱发性肺动脉性肺高血压病、与其它病态有关的肺动脉性肺高血压病、新生儿持续性肺高血压病(persistent pulmonary hypertension of newborn)、结缔组织病(Connective tissue disease)、门脉肺高血压(Portal hypertension、porto-PH)、先天性心脏病(Congenital heart diseases、shunt PAH)等病态。

关于肺动脉性肺高血压病以外的各肺高血压病，其病态是公知的。具体而言，可以参照日本的指导方针(非专利文献1)及欧美的指导方针(非专利文献2～5)等的记载。

在2013年的尼斯会议中，对肺高血压病的定义和临床分类进行了修改(本说明书中，称为“尼斯分类”。)(非专利文献1、非专利文献7)。

检查方法

本发明的检查方法以源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度为指标。

本说明书中，“检查”包含有无肺高血压病的检查、及肺高血压病的风险的检查。优选是指有无肺高血压病的检查。“风险的检查”包含有无将来罹患肺高血压病的可能性的检查、判定。“检查”也可以换言为“判定”、“诊断”。

试样、被检对象

在本发明的检查方法中，试样采用从被检对象中采取的样本。

试样源自检查方法的被检对象。被检对象没有特别限定，可例示包含人的哺乳类。作为非人哺乳类，可举出小鼠、大鼠、犬、猫、牛、绵羊、马等。本发明的检查方法的优选的被检对象为人。在被检对象为人的情况下，作为被检对象，可举出具有辛勤劳动时的气喘、胸部不适感等肺高血压病特征性自觉症状的患者、优选怀疑患有肺高血压病的患者。

在被检对象为人的情况下，被检对象的性别、年龄、人种没有特别限定。在本发明的优选的方式之一中，被检对象为东洋人(例如日本人、中国人、韩国人等。)，特别是日本人。另外，在本发明的优选的方式之一中，从统计上患者多的观点出发，被检对象为女性。

作为试样，可以优选使用源自被检对象的血液试样。在血液试样的具体例中，例如包含血液(全血)及源自血液的血清、血浆等。血液试样优选为血浆。血浆为从血液中除去了血细胞成分的部分，例如可以以在使血液不凝固的条件下(例如柠檬酸钠的存在下。)供于离心分离时的上清液的形式而得到。

血液试样所来源的血管没有限定。可以从体循环的血管(动脉(末梢动脉)、静脉(末梢静脉)、毛细血管。)或肺循环的血管(肺动脉、肺静脉、肺毛细血管。)中进行采血。从采血的简便性的观点出发，优选从体循环的血管、特别是静脉(末梢静脉)中进行采血。肺循环的血管可以在右心导管检查时进行采血。

本发明的检查方法优选为一种检查方法，其包括：

[1]测定源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度的工序；及

[2]基于上述[1]的结果，评价肺高血压病的有无和/或风险的工序。

硒蛋白P蛋白质的试样中浓度

在本发明的检查方法中，以硒蛋白P(Selenoprotein P、SeP)蛋白质的试样中浓度为指标。

硒蛋白P蛋白质为公知的蛋白质。人硒蛋白P蛋白质为selenoprotein P,plasma,1(SEPP1)基因座所编码的、含Se的蛋白质(selenoprotein family)之一，为具有多个硒代半胱氨酸残基的蛋白质。已知主要从肝脏分泌至细胞外。名称中的“P”是指“plasma”。

已知硒蛋白P蛋白质为2型糖尿病中的胰岛素抵抗性的原因之一。另一方面，也查明：在肝细胞中，来自细胞外的硒蛋白P蛋白质引起的刺激抑制细胞内的AMPK活性(非专利文献6)。但是，硒蛋白P蛋白质、包含其信号路径，尚不清楚的方面较多。特别是不知道与肺高血压病的关系。

例如，人(Homo sapiens)及小鼠(Mus musculus)的硒蛋白P蛋白质的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的mRNA的序列在美国生物工学信息中心(NCBI；National Center for Biotechnology Information)提供的基因库中以下述的检索号被注册(注册多个修订(revision)的情况下，被理解为是指最新的修订。)：

人硒蛋白P蛋白质：NP_005401、NP_001078955、NP_001087195

人硒蛋白P mRNA：NM_005410、NM_001085486、NM_001093726

小鼠硒蛋白P蛋白质：NP_033181、NP_001036078、NP_001036079

小鼠硒蛋白P mRNA：NM_009155、NM_001042613、NM_001042614。

关于测定硒蛋白P蛋白质的血中浓度的手段，本领域技术人员可以适当选择。优选例示使用可以特异性地检测硒蛋白P蛋白质的抗体(即与硒蛋白P蛋白质特异性地结合的抗体。)(包含抗体(免疫球蛋白)分子的全长及F(ab)、F(ab')₂等片段。)的免疫学的检定。作为免疫学的检定，可例示ELISA、EIA、免疫印迹等，其中，优选进行ELISA等可进行定量性试验的方法。用于免疫学的检定的抗体只要是可以特异性地检测试样中的硒蛋白P蛋白质的抗体，就没有特别限定。

硒蛋白P蛋白质的试样中浓度的测定也可以使用市售的试剂进行。例如，作为利用ELISA测定硒蛋白P蛋白质的试样中浓度的试剂，可以使用市售品。作为市售品的实例，可举出Human Selenoprotein P,SEPP1 ELISA Kit(Cusabaio公司制、型号CSB-EL021018HU)，但并不限定于此。此外，作为用于检测硒蛋白P蛋白质的抗体，也可以使用与抗硒蛋白P抗体(SANRA CRUZ公司制、型号sc-30162)等市售的与硒蛋白P蛋白质特异性结合的抗体。

所测定的硒蛋白P蛋白质的试样中浓度可以为绝对值及相对值的任一种。硒蛋白P蛋白质的试样中浓度优选测定其绝对值。

评价基准

在本发明的检查方法中，可以基于试样中的Selenoprotein P蛋白质的浓度测定，评价肺高血压病的有无和/或风险。关于检查方法中的评价基准，本领域技术人员可以适当选择。

作为评价基准，可以使用预先设定的截断值。例如，在以硒蛋白P蛋白质的浓度为指标时，在试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度大于预先设定的截断值的情况下，可以判定为有肺高血压病的存在和/或发病的可能性。

上述截断值可以利用各种统计分析方法求出。可例示肺高血压病中的中央值或平均值、基于ROC曲线分析的值(例如Youden's index。)等。也可以设定多个截断值。

在以硒蛋白P蛋白质的浓度为指标的情况下，例如可以将截断值设定为10μg/ml左右的值。予以说明，健康人中的硒蛋白P蛋白质的浓度通常在3～8μg/ml左右的范围内。

其它的指标

本发明的检查方法可以与其它公知的、或者将来被发现的肺高血压病的检查方法组合。

在本发明的某种方式中，可以设为包括测定被检对象的三尖瓣反流压力阶差(TRPG)的工序的检查方法。TRPG可以通过心脏超声波检查进行测定。TRGP是指对从心脏中挤出的血液的压力和对通过瓣膜之后的血液的压力之差，可以利用心回声法算出。通常，在TRPG约为50mmHg以上的情况下，可以判定为被检对象罹患肺高血压病的可能性高。在本发明的检查方法的这种方式中，除TRPG约为50mmHg以上的情况之外，在TRPG约为50mmHg以下、且所测定的检体中的硒蛋白P蛋白质的浓度为预先设定的截断值以上的情况下，也可以判定为被检对象罹患肺高血压病的可能性高。

这样，对被检对象的肺高血压病进行检查。

通过本发明的检查方法评价为肺高血压病或存在发病的风险的被检对象优选通过右心导管检查、肺换气/血流闪烁图检查、胸部CT(计算机断层成像法)检查、肺动脉造影、光学相干断层成像术(optical coherence tomography、OCT)等进行肺高血压病的有无的精密检查和/或病灶部的确定。

进而，特别是在通过精密检查判断为肺高血压病的可能性高的情况下，优选进行以下处置，所述处置为用于治疗肺高血压病和/或预防疾病的发展的适当的处理。例如，在肺高血压病为肺动脉性肺高血压病的情况下，可举出内皮缩血管肽受体拮抗剂(例如BOZENTAN、安立生坦。)的给药、前列腺素I₂(环前列腺素)制剂的给药、磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂(例如西地那非、他达那非)的给药。这些治疗法可以单独进行1种，也可以组合2种以上而进行。从治疗效果高的观点出发，优选并用疗法、特别是3种并用的疗法。

另外，通过本发明的检查方法没有被评价为肺高血压病或存在发病的风险的被检对象虽然不需要立刻的对应，但是优选进行充分的追踪观察。

2.试剂盒

本发明也提供用于检查肺高血压病的试剂盒。

本发明的试剂盒包含用于测定源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度的单元。

作为用于测定硒蛋白P蛋白质的浓度的单元，可例示用于实施使用特异性地检测上述的硒蛋白P蛋白质的抗体的免疫学的检定等的单元。具体而言，可例示可以特异性地检测硒蛋白P蛋白质的抗体、和/或其它的用于实施ELISA法、EIA法、免疫印迹法等免疫学的检定的试剂。

另外，在本发明的试剂盒中，可以根据需要含有其它成分。其它成分可举出例如用于采取试样的器具(例如注射器。)、阳性对照试样(例如源自确定为肺高血压病的患者的试样。)及阴性对照试样(例如源自确定不是肺高血压病的患者(健康人)的试样。)等，但并不限定于此。也可以包含记录有用于进行上述检查方法的步骤的文件等。

本发明的试剂盒可以通过按照常规方法、适当具备上述成分而制作。

试剂盒的使用方式没有特别限定，优选用于上述检查方法。在用于上述检查方法的情况下，可以容易地进行肺高血压病的检查。

3.治疗方法

本发明还提供一种肺高血压病的治疗方法。发明中所说的“治疗”包含肺高血压病的治疗、以及用于症状的减轻及防止复发的维持疗法。

本发明的治疗方法包括：

(i)将源自被检对象的试样中的硒蛋白P蛋白质的浓度作为指标，进行肺高血压病的检查的工序；及

(ii)对被检出肺高血压病的被检对象进行进行处置的工序，所述处置为用于对肺高血压病进行治疗和/或进行肺高血压病的发展的预防的处置。

工序(i)进行上述“1.”栏中记载的检查方法。

接着，对被检出肺高血压病的被检对象进行处置的工序，所述处置为用于对肺高血压病进行治疗和/或进行肺高血压病的发展的预防的处置(工序(ii))。

在工序(i)和工序(ii)之间可以通过心脏导管检查、血管造影检查法(血管造影法：包含X射线血管造影检查法、计算机断层成像(CT)血管造影检查法、核磁共振(MR)血管造影检查法等。)等精密检查进行心血管疾病的有无的精密检查和/或病灶部的确定。

用于实施肺高血压病的治疗和/或心血管疾病的发展的预防的处置进行公知的适当的处理。例如，在肺高血压病为肺动脉性肺高血压病的情况下，可举出内皮缩血管肽受体拮抗剂(例如BOZENTAN、安立生坦。)的给药、前列腺素I₂(环前列腺素)制剂的给药、磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制剂(例如西地那非、他达那非)的给药。这些处置可以单独进行1种，也可以组合2种以上而进行。从治疗效果高的观点出发，优选并用疗法、特别是3种并用的疗法。

这样，对肺高血压病进行治疗。

实施例

以下，基于实施例等更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例限定。

统计分析及箱线图的制作使用IBM SPSS Statistics而进行。

[实施例1]肺高血压病的检查

测定肺高血压病患者及非肺高血压病患者中的硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度。设为测定对象的肺高血压病患者为被诊断为肺动脉性肺高血压病的患者。

＜患者组＞

对从以下的患者组中采取的血液进行试验。

(i)非肺高血压病患者(non-PH)组(对照组)：19人(怀疑是心脏疾病而进行了包含心脏导管检查的详查，但为完全不能发现病变的健康人组)、及

(ii)肺高血压病患者(PH)组：146人。

予以说明，本研究得到东北大学伦理委员会的认可而进行，对全部的患者进行知情同意，得到承诺而进行。

＜方法＞

从由上述患者组在右心导管检查时得到的源自末梢静脉的血液试样及源自肺动脉的血液试样中分离血浆，使用Human Selenoprotein P,SEPP1 ELISA Kit(Cusabaio公司制、型号CSB-EL021018HU)利用ELISA对硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度进行测定。

＜结果及考察＞

将结果示于图1。如图1所示，得知：与非肺高血压病患者相比，肺高血压病患者的硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度显著地高。

[实施例2]肺高血压病的检查

与实施例1同样地，测定肺高血压病患者及非肺高血压病患者中的硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度。

＜患者组＞

对从以下的患者组中采取的血液进行试验。

(i)非肺高血压病患者(non-PH)组(对照组)：20人、及

(ii)肺高血压病患者(PH)组：183人。

肺高血压病患者的详情如下所述。

结缔组织病(CPAH、尼斯分类第1组4)-1)：25人、

慢性血栓栓塞性肺高血压病(CTEPH、尼斯分类第4组)：51人、

特发性肺动脉性肺高血压病(IPAH、尼斯分类第1组1))：58人、

与肺疾病和/或相伴随的低氧血症的肺高血压病(Lung-PAH、尼斯分类第3组)：10人、

与详细不明的多因子的机制相伴随的肺高血压病(non-categorized、尼斯分类第5组)：13人、

门脉肺高血压(proto-PH、尼斯分类第1组4)-3)：6人、及

先天性心脏病(shunt PAH、尼斯分类第1组4)-4)：20人。

予以说明，本研究得到东北大学伦理委员会的认可而进行，对全部的患者进行知情同意，得到承诺而进行。

＜方法＞

与实施例1同样地操作，从由上述患者组取得的血液试样中分离血浆，测定硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度。

＜结果及考察＞

将结果示于图3及图4。图3表示经测定的肺高血压病患者的全体的结果，图4表示肺高血压的各病型的结果。得知：不取决于肺高血压病的病型，在全部的病型的肺高血压病患者中，与非肺高血压病患者相比，硒蛋白P蛋白质的血浆中浓度显著地高。

[参考例1]

观察特发性肺动脉性肺高血压病(IPAH)患者的肺血管平滑肌(Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells、PASMC)(以下，也称为IPAH-PASMC。)中的、对低氧压刺激的反应性。

＜材料＞

由特发性肺动脉性肺高血压病患者的肺血管平滑肌、根据文献Ogawa A,Nakamura K,Matsubara H,Fujio H,Ikeda T,Kobayashi K,Miyazaki I,Asanuma M,Miyaji K,Miura D,Kusano KF,Date H,Ohe T.Circulation.2005；112:1806-1812.建立原代培养细胞系统。特发性肺动脉性肺高血压病患者的肺血管平滑肌从外径为1.5mm以下的肺动脉中进行离析。

＜培养条件＞

IPAH-PASMC在添加有10％FBS(胎牛血清、终浓度)的D-MEM培养基中，在温度37℃的恒温恒湿条件下，在95％的大气和5％的二氧化碳中，按照常规方法进行培养。试验中使用70～80％汇合的、继代第4代～第7代(Passage 4to 7)的细胞。

＜试验方法＞

将用于试验的细胞在正常氧压(normoxia、氧浓度21％)、低氧压(hypoxia、氧浓度2％)及法舒地尔(fasudil)存在下的低氧压(Hydroxyfasudil浓度：10μM)各个条件下培养24小时。

培养后，对各试样制备全细胞溶解液(whole cell lysates)及条件培养基(conditioned medium)，通过免疫印迹分析检测硒蛋白P蛋白质。

＜结果及考察＞

将结果示于图2。得知：源自特发性肺动脉性肺高血压病患者的肺血管平滑肌细胞在低氧压下与正常氧浓度压下相比，硒蛋白P蛋白质向细胞外(培养基中)的分泌亢进。另外，在Rho激酶(ROCK)抑制剂即法舒地尔(fasudil)的存在下，即使在低氧条件下也没有观察到硒蛋白P蛋白质的分泌的亢进。

以上的实验结果暗示：在源自肺动脉性肺高血压病患者的肺动脉血管平滑肌细胞中，通过低氧刺激，Rho激酶依赖性地分泌硒蛋白P蛋白质。