肌酸激酶MB同工酶的测定方法以及其中使用的试剂盒

摘要

本发明的目的在于提供能避免CK‑BB的影响且能特异性地测定CK‑MB的方法。即本发明涉及“在CK‑MB测定中避免CK‑BB的影响的方法，其是测定试样中的CK‑MB的方法，其特征在于，包含下述工序，工序1：使试样、第一抗体、第二抗体和抗CK‑B抗体进行反应的工序，所述第一抗体是针对CK‑MB的第一抗体，所述第二抗体是针对CK‑MB但识别的表位与第一抗体不同的第二抗体，所述抗CK‑B抗体是对肌酸激酶的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个区域进行识别的抗CK‑B抗体；工序2：对该反应所产生的光学变化进行测定的工序；工序3：根据工序2所得到的结果，求出该试样中的CK‑MB的量的工序；以及上述方法中所使用的试剂盒；且以该抗CK‑B抗体来处理试样。”。

说明书

技术领域

本发明涉及肌酸激酶MB同工酶的测定方法以及其中使用的试剂盒。

背景技术

肌酸激酶(以下简称为CK。)是包含在骨骼肌、心肌、平滑肌、脑等中的酶，并起到与细胞的能量代谢相关的重要作用。

CK是由两个亚单位构成的二聚体的蛋白质，其亚单位中有M型(muscle type,M)和B型(brain type,B)两个种类。另外，作为CK，通过亚单位的组合而在骨骼肌中存在较多的CK-MM，在心肌中存在较多的CK-MB，在脑中存在较多的CK-BB，即存在三种同工酶。其中，CK-MB的心肌特异性高，如果发生心肌损伤，则CK-MB从心肌细胞脱离而流入血液中。因此，CK-MB作为心肌损害(心肌梗塞)的标志物，在临床检查中成为了重要的检查对象。

在CK-MB的定量测定中，有测定“酶活性”的免疫抑制法、测定“蛋白量”的乳胶凝集比浊法、电化学发光免疫测定法等，另外，作为同工酶分析方法已知的有“电泳法”。

其中，免疫抑制法由于能借助通用的自动分析装置进行测定而被常用，但如果试样中含有CK-BB等，则会一并对其活性进行测定，从而存在针对CK-MB测定的特异性低而无法得到准确的CK-MB测定值的问题。电化学发光免疫测定法是不受CK-BB影响而可特异性地测定CK-MB的方法，但存在需要特别的测定设备、使用的试剂昂贵等问题。另外，电泳法由于迅速性不足、定量性差等原因，并不用于对CK-MB进行定量的目的中。

另一方面，作为测定蛋白质含量的方法、即乳胶凝集比浊法是采用了对CK-MB特异性的单克隆抗体的免疫学方法将CK-MB作为蛋白量进行定量的方法。本法可借助通用的自动分析装置进行测定，与测定酶活性的免疫抑制法相比，精度高，另外CK-MB的特异性优异，是一种能准确地监测CK-MB的脱离量的方法。

但实际上，在一直以来的乳胶凝集比浊法中，如果对共存有CK-BB的试样测定CK-MB值，则会有一并测定CK-BB(出现伪高值)而无法得到准确的CK-MB的测定值的情况。作为其原因，我们认为应该是使用的一部分抗CK-MB抗体还与试样中的CK-BB进行了结合(交叉)。

因此，为了避免该问题，人们开发出了既不与CK-MM、也不与CK-BB结合的抗CK-MB单克隆抗体，且提出有采用所述抗CK-MB单克隆抗体的乳胶凝集比浊法(专利文献1)。该方法是这样的方法：固定在乳胶粒子上的具有上述特异性的第一抗CK-MB抗体、和固定在乳胶粒子上的所述第一抗CK-MB抗体，可结合于不同的表位，进而使具有上述特异性的第二抗CK-MB抗体与试样中的CK-MB反应，并对抗原抗体反应结果产生的凝集的增加进行测定。然而，实际上即使在用该方法测定CK-MB时，仍有得到伪高值的情况。

另外，作为利用其他乳胶凝集比浊法的测定方法，有采用了固定有与CK-MB特异性结合的单克隆抗体的乳胶粒子、与固定有与CK-BB特异性结合的单克隆抗体的乳胶粒子的方法(专利文献2)。在该方法中，通过调整乳胶粒子的粒径来避免CK-MB测定中的CK-BB的影响。但是，即使用该方法也无法完全避免CK-MB测定中的CK-BB的影响。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第2774875号公报

专利文献2：日本特开2013-125005号公报

发明内容

发明要解决的问题

如上所述，一直以来的借助测定蛋白质含量的CK-MB测定法难以避免CK-BB的影响来特异性地测定CK-MB。作为其原因，我们认为恐怕是因为抗CK-MB抗体的特异性不够，不但是CK-MB、连CK-BB也发生了若干交叉(出现伪高值)。

因此，鉴于上述情况，本发明的目的在于提供避免CK-BB的影响来特异性地测定CK-MB的方法。

用于解决问题的方法

本发明是以解决上述问题为目的而完成的，且具有以下构成。

(1)一种测定试样中的CK-MB的方法，其中，包含下述工序：

1)使试样、第一抗体、第二抗体和抗CK-B抗体进行反应的工序(工序1)，所述第一抗体是针对CK-MB的第一抗体，所述第二抗体是针对CK-MB但识别的表位与第一抗体不同的第二抗体，所述抗CK-B抗体是对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域进行识别的抗CK-B抗体，

2)对该反应所产生的光学变化进行测定的工序(工序2)，

3)根据工序2所得到的结果，求出该试样中的CK-MB的量的工序(工序3)。

(2)一种在CK-MB的测定中避免CK-BB的影响的方法，其特征在于，用抗CK-B抗体来处理试样，所述抗CK-B抗体是对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域进行识别的抗CK-B抗体。

(3)一种CK-MB测定用试剂盒，其中，包含第一抗体、第二抗体和抗CK-B抗体，所述第一抗体是针对CK-MB的第一抗体，所述第二抗体是针对CK-MB但识别的表位与第一抗体不同的第二抗体，所述抗CK-B抗体是对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域进行识别的抗CK-B抗体。

本发明人发现通过使识别CK的B亚单位的特定区域的抗体(本发明的抗CK-B抗体)共存于借助了一直以来的测定蛋白质含量的方法的CK-MB的测定系统中，能避免试样中的CK-BB的影响，能高精度且高灵敏度地测定CK-MB，从而完成了本发明。

发明的效果

根据本发明，能在CK-MB的测定中避免试样中共存的CK-BB对测定值的影响(出现伪高值)，且能够更高精度地、更高灵敏度地进行CK-MB的测定。另外，根据本发明的方法，可借助通用的自动分析装置测定CK-MB蛋白量，从而不需要使用特别的设备。

进而，本发明的抗CK-B抗体能避免CK-MB测定中的CK-BB的影响。因此，本发明能提供在CK-MB测定时避免CK-BB的影响的方法。

附图说明

图1是在实施例2中，使用MAb to CK-BB(Merideian Life Science,Inc.制)作为抗CK-B抗体而得的电泳图。

图2是在实施例2中，使用CKBB Monoclonal Antibody(Roche Diagnostics K.K.制)作为抗CK-B而得的电泳图。

具体实施方式

本发明的CK-MB的测定方法是

“测定试样中的CK-MB的方法，其中，包含下述工序：

(1)使试样、第一抗体、第二抗体和抗CK-B抗体进行反应的工序(工序1)，所述第一抗体是针对CK-MB的第一抗体，所述第二抗体是针对CK-MB但识别的表位与第一抗体不同的第二抗体，所述抗CK-B抗体是对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域进行识别的抗CK-B抗体，

(2)对该反应所产生的光学变化进行测定的工序(工序2)，

(3)根据工序2得到的结果，求出该试样中的CK-MB的量的工序(工序3)。”。

即，本发明的方法是这样的方法：通过在采用了两种抗CK-MB抗体的CK-MB的测定方法中增加本发明的抗CK-B抗体，从而避免了CK-BB的影响，其结果，能特异性地测定CK-MB。

关于本发明能避免CK-BB影响的测定原理，本发明人作如下推测。

CK-MB是M亚单位和B亚单位的异源二聚体。CK-BB是B亚单位的同源二聚体。

当试样中共存有CK-MB和CK-BB时，如果该试样与本发明的抗CK-B抗体接触，则本发明的抗CK-B抗体就与该试样中的CK-MB的B亚单位以及CK-BB的B亚单位结合。且可以认为与CK-BB的B亚单位结合的本发明的抗CK-B抗体会阻碍第一抗体或第二抗体与CK-BB结合。进而可以认为，其结果，凭借本发明的CK-MB的测定方法，可避免存在于试样中的CK-BB的影响，可特异性且高精度地测定CK-MB。

作为本发明的针对CK-MB的第一抗体(以下有简称为“第一抗体”的情况。)，可举出对CK-MB的M亚单位和B亚单位两者进行识别的抗体。

作为本发明的针对CK-MB的第二抗体(以下有简称为“第二抗体”的情况。)，可举出对CK-MB的M亚单位和B亚单位两者进行识别，但识别的表位与第一抗体不同的抗体。

作为本发明的抗CK-B抗体可举出对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1(即N末端氨基酸)～100个氨基酸区域进行识别的抗体。即，只有是对CK的B亚单位进行识别的抗B亚单位抗体、且是对B亚单位中从N末端起1～100个氨基酸区域中的特定区域进行识别的抗体才能实现本发明的效果。

且，本发明的抗CK-B抗体更优选为能对天然的CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域的三维结构(立体结构)进行识别的抗体。

具体而言，CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域的氨基酸序列是序列号1所表示的氨基酸序列。

且，CK的B亚单位的整个氨基酸序列是公知的(NCBI Reference Sequence:NP_001814.2、本说明书的序列号2)

以下有将本发明的第一抗体、本发明的第二抗体和本发明的抗CK-B抗体一并简称为“本发明的抗体”的情况。

本发明的抗体只要是分别具有上述性质的抗体即可，可以是市售品或用常规方法适当制备而成的抗体，也可以分别是单克隆抗体或多克隆抗体。

当本发明的抗体是单克隆抗体时，其来源没有特别限定，市售品、或者通过利用细胞融合技术或基因重组技术等的本身公知的方法〔Eur.Jimmunol,6,511(1976)〕等而产生的具有上述性质的抗体就全部可以使用。

当本发明的抗体是多克隆抗体时，其来源没有特别限定，但可以举出来源于兔、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、马等的具有上述性质的抗体。可以用市售品，或者用例如“免疫学实验入门、第二次印刷、松桥直等、株式会社学会出版中心、1981”等中记载的方法获得的抗体。

另外，本发明的抗体中还包含用木瓜蛋白酶等进行部分分解而得的Fab片断、用胃蛋白酶等进行部分分解而得的(Fab')₂片断、对(Fab')₂片断进行还原处理而得的Fab'等的所谓的抗体片断。

本发明的抗体通过上述的本身公知的方法来配制也能得到，但也可以使用市售品。

作为第一抗体以及第二抗体的市售品，在市面上被作为抗CK-MB抗体出售的产品中，选择使用识别的表位互不相同的产品即可，没有特别限定。

作为本发明的抗CK-B抗体的市售品，在市面上被作为抗CK-B抗体、抗CK-BB抗体出售的产品中，选择使用能对CK的B亚单位的氨基酸序列中从N末端起1～100个氨基酸区域进行识别的产品即可。作为这样的市售品，例如可举出Merideian Life Science,Inc.制造的MAb to CK-BB、Roche Diagnostics K.K.制造的CKBB Monoclonal Antibody、BiosPacific,Inc.制造的CK-BB Monoclonal Antibody、Fitzgerald I.I.制造的CKBB antibody等。

也可将第一抗体以及第二抗体固定(载持)在不溶性载体上来使用。如果使用市售的试剂盒则更为简便，其含有作为构成试剂的固定有第一抗体的乳胶粒子以及固定有第二抗体的乳胶粒子。作为这样的市售试剂盒，例如可举出L Type Wako CK-MB mass(和光纯药工业株式会社制)等。

当把第一抗体以及第二抗体固定于不溶性载体来使用时，作为所用的不溶性载体，通常只要是本领域使用的载体就可任意使用，但作为优选的载体例如可举出用以下物质为材料制备而成的载体：聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯甲酸酯、硅树脂、硅橡胶等的合成高分子化合物，或多孔玻璃、毛玻璃、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等的无机物质等。另外，这些载体能以乳胶粒子、珠子、管、盘状片、微粒子等多种多样的形态进行使用。

在上述的不溶性载体中，乳胶粒子作为人工载体，由于其可轻松地根据不同目的对载体表面进行化学处理、且难以发生非特异反应，从而特别优选。其材质没有特别限定，只要是在该领域中通常使用的就没有特别限定，但作为优选的材质例如可举出聚苯乙烯乳胶粒子等的苯乙烯类乳胶粒子、丙烯酸类乳胶粒子等。且，在这些乳胶粒子中，由于通过不用乳化剂的乳化聚合所得到的聚苯乙烯乳胶粒子等，其表面疏水性强，因此具有能顺利地吸附蛋白质或肽，且借助表面的负电荷之间的排斥，即使没有乳化剂也能在溶液中稳定地分散的性质，从而特别优选。另外，根据需要也可使用各种改性乳胶粒子(例如，在上述聚苯乙烯中导入羧基而成的羧酸改性乳胶粒子)、磁性乳胶粒子(内含磁性粒子的乳胶粒子)等。

固定有第一抗体的乳胶粒子和固定有第二抗体的乳胶粒子的材质只要是如上所述的物质，则既可以相同，也可以互不相同。

另外，作为本发明的乳胶粒子也可以使用市售品，但由于每单位重量的表面积大的乳胶粒子能有效地敏化抗体，从而优选。具体而言，可举出平均粒径为通常的0.05～2.4μm、优选的0.05～1.0μm、更优选的0.05～0.50μm的乳胶粒子。

固定有第一抗体的乳胶粒子和固定有第二抗体的乳胶粒子可以粒径相同，也可以组合使用从上述范围中选出的平均粒径不同的粒子。

另外，固定有第一抗体的乳胶粒子可以粒径相同，也可以不同。同样地，固定有第二抗体的乳胶粒子可以粒径相同，也可以不同。

作为将第一抗体以及第二抗体固定于不溶性载体的方法，只要通过使各抗体与不溶性载体接触而固定即可，可利用本身公知的固定化方法，例如借助共价键固定的方法、物理吸附固定的方法等的固定化方法。

不溶性载体载持的第一抗体的量、以及不溶性载体载持的第二抗体的量虽然根据其载体而不同，但相对于1g载体，通常为0.5～2000mgAb，优选为2～500mgAb，并按此进行制备。当载体为乳胶粒子时，相对于1g乳胶粒子，通常为0.5～2000mgAb，优选为2～500mgAb。

固定有第一抗体的不溶性载体和固定有第二抗体的不溶性载体可以分别是只固定有第一抗体的载体、以及只固定有第二抗体的载体，也可以是将第一抗体和第二抗体固定在同一不溶性载体上的载体。

在本发明中，虽然第一抗体和第二抗体可以与不溶性载体结合使用，但本发明的抗CK-B抗体不与不溶性载体结合使用。例如，当使用乳胶粒子作为不溶性载体来实施本发明的CK-MB测定法时，试样中的CK-MB、固定于乳胶的第一抗体、以及固定于乳胶的第二抗体形成交联结构，产生光学变化。但，本发明的抗CK-B抗体虽然与试样中的CK-MB的B亚单位结合，但与交联结构的形成无关。

本发明的CK-MB的测定方法的工序1是使含CK-MB的试样、第一抗体、第二抗体、本发明的抗CK-B抗体反应的工序。

在工序1中，虽然只要最终得到含有试样、第一抗体、第二抗体和本发明的抗CK-B抗体的溶液即可，但优选在试样与第一抗体以及第二抗体中的至少一者接触并反应之前，加入本发明的抗CK-B抗体。换言之，优选使试样与本发明的抗CK-B抗体先接触后，再与第一抗体和第二抗体接触。

在工序1中，本发明的第一抗体、第二抗体以及本发明的抗CK-B抗体多以悬浊于缓冲液等溶液中而成的溶液的形态进行使用。作为用于制备这样的试剂溶液的缓冲液只要是在本领域常用的就没有特别限定，但可举出通常在pH 5.0～10.0的范围中、优选在pH 6.5～8.5的接近中性的范围中具有缓冲作用的缓冲液。具体而言，例如可举出HEPES缓冲剂、硼酸、Tris缓冲剂、磷酸缓冲剂、佛罗拿缓冲剂、顾德缓冲剂等。另外，作为这些缓冲液的缓冲剂浓度可以在通常的10～1000mM、优选的10～300mM的范围中进行选择。

另外，当使用上述市售试剂盒时，可使用该试剂盒中附带的缓冲液，所述市售试剂盒含有作为构成试剂的固定有第一抗体或第二抗体的乳胶粒子。

当用后述的含有本发明的抗CK-B抗体的第一试剂、和含有第一抗体以及第二抗体的第二试剂的双试剂系统来进行测定时，考虑到稳定性，则第一试剂的pH优选为6.0～8.0的大小。考虑到稳定性，第二试剂的pH也与第一试剂一样，优选6.0～8.0的大小。

在将本发明的抗CK-B抗体悬浊于上述缓冲液而成的试剂溶液中，只要在对试样和含有本发明的抗CK-B抗体的溶液进行混合时，本发明的抗CK-B抗体的浓度能达到目标浓度范围内的即可。例如为0.1～200μgAb/mL，优选为0.5～50μg Ab/mL，更优选为1～40μg Ab/mL，进一步优选为1～20μg Ab/mL。即，下限值为0.1μg Ab/mL，优选为0.5μg Ab/mL，更优选为1μg Ab/mL。另外，其上限值为200μg Ab/mL，优选为50μg Ab/mL，更优选为40μg Ab/mL，进一步优选为20μg Ab/mL。

另外，在把第一抗体或者/以及第二抗体悬浊于上述缓冲液而成的试剂溶液中，第一抗体或者/以及第二抗体的浓度虽然根据测定的CK-MB的浓度而不同，但通常为0.4～4200μg/mL，优选为2～4200μg/mL，更优选为2～420μg/mL。

另外，在将固定有第一抗体以及第二抗体的不溶性载体悬浊于上述缓冲液而成的试剂溶液中，作为各种不溶性载体的含量虽然根据所用的载体的种类而不同，但通常为0.001～10w/v％，优选为0.005～5w/v％。当载体为乳胶粒子时，其含量通常为0.1～10w/v％，优选为0.2～5w/v％。

且，在含本发明的抗体的溶液中，可进一步具有以下试剂：敏化剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、安息香酸等)、稳定剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂、共存物质的影响防护剂，除此之外，还可以含有在本领域使用的，不阻碍与共存试剂的稳定性的，或不阻碍抗原抗体反应的其他试剂。另外，这些试剂的浓度范围也可适当选用在本身公知的该测定方法中常用的浓度范围。

在工序1中，当试样与本发明的抗CK-B抗体接触并发生反应时，本发明的抗CK-B抗体在反应液中的浓度只要是能抑制并避免抗CK-MB抗体与试样中的CK-BB的结合反应，且能避免CK-MB测定中CK-BB的影响的量即可。例如，其可以为0.1～200μg/mL Ab/mL，可优选为0.5～50μg/mLAb/mL，可更优选为1～40μgAb/mL，可进一步优选为1～20μg Ab/mL。即，下限值为0.1μg Ab/mL，优选为0.5μg Ab/mL，更优选为1Ab/mL。另外，其上限值为200μg Ab/mL，优选为50μg Ab/mL，更优选为40μg Ab/mL，进一步优选为20μg Ab/mL。

另外，在工序1中，当使试样、第一抗体、和第二抗体接触并发生反应时，第一抗体以及第二抗体在反应开始时的反应液中的浓度虽然根据试样中的CK-MB的浓度而不同，且没有特别限定，但通常为0.1～1000μgAb/mL，优选为0.5～1000μg Ab/mL，更优选为0.5～100μg Ab/mL。

另外，当使用乳胶粒子作为不溶性载体时，在工序1中，当使试样、固定有第一抗体的乳胶、和固定有第二抗体的乳胶接触并发生反应时，反应液中的乳胶浓度为0.01～3w/v％，优选为0.01～1.2w/v％。

另外，作为本发明的抗CK-B抗体、以及第一抗体和第二抗体进行该反应时的pH，只要是在不抑制抗原抗体反应的范围内的就没有特别限定，例如通常为6.0～10.0，优选为6.0～8.0的范围，反应时的温度只要在不抑制抗原抗体反应的范围内的也没有特别限定，例如通常为10～50℃，优选为20～40℃的范围。另外，其反应时间根据所用的本发明的抗体、pH以及温度等反应条件而不同，根据各条件可按1～60分钟、或优选的1～15分钟的程度来进行反应。

作为该工序1的具体方法，例如可举出以下方法。

(ⅰ)分别制备含本发明的抗CK-B抗体的溶液、含第一抗体和第二抗体的溶液，依次把含本发明的抗CK-B抗体的溶液、含第一抗体和第二抗体的溶液与试样进行混合的方法(双试剂系统)；

(ii)分别制备含本发明的抗CK-B抗体的溶液、含第一抗体的溶液、含第二抗体的溶液，将试样与含本发明的抗CK-B抗体的溶液混合后，再依次混合含第一抗体的溶液、含第二抗体的溶液的方法(含第一抗体的溶液和含第二抗体的溶液哪个先加都可以。)；

(iii)制备含第一抗体、第二抗体和本发明的抗CK-B抗体的溶液，将试样和该溶液混合，使这些成分同时发生作用的方法。

在以上方法中，如果考虑到例如用自动分析仪进行测定的情况或作业效率，则在(ⅰ)的方法中，优选使含CK-MB的试样与本发明的抗CK-B抗体反应后，再与第一抗体以及第二抗体反应的做法。

且，也可使试样中的共存物质的影响防护剂等的试样的预处理液先于本发明的抗体来与试样接触。

另外，可使本发明的抗CK-B抗体存在于构成市售试剂盒的试剂类的任意一种中，来形成上述任一状态而进行使用，所述市售试剂盒是采用了临床检查领域中常用的抗CK-MB抗体的、CK-MB测定用的市售试剂盒。

本发明的CK-MB的测定方法的工序2是对工序1的反应所产生的光学变化进行测定的工序。

在该工序2中，可根据本身公知的使用抗CK-MB抗体的测定法来测定反应所产生的光学变化。

作为该光学变化可举出吸光度变化、浊度变化或散射光强度变化等。

光学变化的测定是指，对免疫凝集的结果所产生的光学变化进行的测定，具体而言可举出免疫散射比浊法、免疫乳胶比浊法等免疫凝集法等。可基于本身公知的方法来实施这些测定方法，当例如采用免疫散射比浊法时，可基于“金原出版株式会社临床检查法提要第三0版p.853-854”等中记载的方法，而当例如采用免疫乳胶比浊法时，可基于“金原出版株式会社临床检查法提要第30版p.851-853”等中记载的方法。

其中，优选用免疫散射比浊法进行测定，尤其是采用了乳胶粒子的乳胶凝集比浊法具有测定灵敏度高，可借助通用的自动分析装置进行测定，不仅简便而且能进一步享受本发明的效果等特点，从而优选。

当根据乳胶凝集比浊法来实施本发明的测定法时，除了使本发明的抗CK-B抗体与试样接触混合以外，可基于借助本身公知的乳胶凝集比浊法的CK-MB的测定方法中的测定条件(例如测定波长等)、以及测定操作法来实施。

当借助乳胶凝集比浊法进行CK-MB的测定时，用于吸光度测定的测定波长通常为340～880nm，优选为540～800nm。当用双波长进行测定时，可通过540nm左右的主波长、800nm左右的次波长来进行测定。

本发明的光学变化例如可按如下方法求出。

(1)在固定有第一抗体的不溶性载体、固定有第二抗体的不溶性载体和CK-MB开始反应后，以适当的间隔进行两次反应液的光学测定，将其测定值的差作为光学变化(端点法)。

(2)在固定有第一抗体的不溶性载体、固定有第二抗体的不溶性载体和CK-MB开始反应后，将反应液的光学变化率(尤其是其最大变化率)作为吸光度变化(速率法)。

当然也可通过手动检测法来进行吸光度变化、浊度变化或散射光强度变化的测定，但本发明的方法由于能够适用于借助了自动分析装置的测定系统，因此可使用自动分析装置、分光光度计等的生化通用仪器、或激光浊度仪等的乳胶比浊测定用专用仪器等来进行测定，具体操作时参照各仪器的手册即可。

当用手动检测法或自动分析装置进行测定时，试剂类的组合没有特别限定，只要根据自动分析装置的使用环境、其他因素等来适当进行即可。

在本发明的CK-MB测定方法的工序2的实施中，当采用的是利用例如通过乳胶凝集比浊法测定CK-MB的方法的市售试剂盒、和通用的自动分析装置时，可将本发明的抗CK-B抗体包含在试剂盒的构成试剂中的任一种中进行使用。且，除了使本发明的抗CK-B抗体同时或先于其他抗体与试样接触并反应以外，可根据试剂盒附带的使用说明书并使用自动分析装置来进行通常的CK-MB的测定。

本发明的CK-MB测定方法的工序3是“基于工序2所得到的结果来求出CK-MB的量的工序”。

例如，通过将工序2中测出的光学变化量套用校正曲线来算出试样中的CK-MB量。所述校正曲线是表示CK-MB浓度和光学变化量的关系的校正曲线，其通过例如将预先已知CK-MB浓度的标准液等作为试样且用相同的测定方法求出。

以用所述(ⅰ)的方法(制备含本发明的抗CK-B抗体的溶液、含第一抗体和第二抗体的溶液，将含本发明的抗CK-B抗体的溶液、含第一抗体和第二抗体的溶液依次与试样混合的方法。)、且根据采用了乳胶粒子的免疫散射比浊法来进行测定的方法为例，具体说明本发明的CK-MB的测定法(工序1～工序3)。

首先，使例如血液、血清、血浆等的需要测定CK-MB的试样与含0.1～200μg Ab/mL的本发明的抗CK-B抗体的第一试剂进行接触混合，且通常在10～50℃、优选在20～40℃下，通常进行1～60分钟的反应，优选进行1～15分钟的反应，更优选进行5分钟左右的反应。其次，将该反应液、与含有固定于乳胶粒子的第一抗体和固定于乳胶粒子的第二抗体的第二试剂进行混合，且通常在10～50℃、优选在20～40℃下，通常进行1～60分钟的反应，优选进行1～15分钟的反应，更优选进行5分钟左右的反应。例如用340～880nm的测定波长，或优选用540～800nm的测定波长来测定作为结果而产生的、起因于抗原抗体反应的反应液的吸光度变化。另外，例如将预先已知浓度的CK-MB标准品作为试样使用，并相同地进行测定，绘制出表示CK-MB浓度和吸光度的关系的校正曲线。进而，将用需要测定CK-MB的试样所得到的测定值套用在该校正曲线中，求出CK-MB的浓度，从而对试样中的CK-MB进行定量。

作为本发明的CK-MB测定中的CK-BB的影响避免方法，可举出在含CK-MB的试样中加入本发明的抗CK-B抗体来处理该试样的方法。关于此时使用的试剂以及处理方法的具体例子，可举出上述试样中的CK-MB的测定方法一栏中所记载的方法。

本发明的CK-MB测定用试剂盒只要是将含第一抗体、第二抗体、本发明的抗CK-B抗体的试剂作为构成试剂来含有而成的试剂盒即可。各构成要素的优选形态、具体例子以及浓度等，同上述的本发明的CK-MB的测定方法相关说明中的记载。

另外，含该第一抗体、第二抗体、本发明的抗CK-B抗体的试剂可以是使本发明的抗体、固定有第一抗体的不溶性载体、固定有第二抗体的不溶性载体、以及本发明的抗CK-B抗体等在适当的缓冲液中悬浊而成的悬浊液等的溶液状态，也可以是将其冷冻而成的冷冻品、或冷冻干燥而成的冷冻干燥品。作为为了该目的而使用的缓冲剂等的具体例子，其pH以及浓度同上。

另外，在这些试剂盒所包含的试剂中，可具有以下试剂：本领域常用的试剂类、例如缓冲剂、敏化剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、安息香酸等)、稳定剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂、共存物质的影响防护剂，除此之外，还可以含有在本领域使用的，不阻碍与共存试剂的稳定性，或不阻碍抗原抗体反应的其他试剂。另外，这些试剂类的浓度范围也可适当选用在本身公知的该测定方法中常用的浓度范围。

另外，当该试剂盒由多种试液构成时，各试液中还含有用于对测定对象成分进行测定的必要的试剂类，且也可使这些试剂类适当地分散并包含于各试液中的任一种中，以便在混合各试液的时间点开始目标成分测定的反应。关于构成这些试液的试剂类的使用浓度，可在本领域常用的范围中作适当选择。

进而，该试剂盒中可组合有测定CK-MB时使用的、绘制校正曲线用的CK-MB标准品。作为该标准可使用市售的标准品，也可使用按照公知方法制造的标准品。

进而，本发明的试剂盒中还可含有CK-MB测定方法的说明书等。该“说明书”是指以文章或图表等形式实质性地记载有该方法中的特征、原理、操作步骤、判定步骤等的该试剂盒的使用说明书、附属文件或产品手册(传单)等。

作为本发明的试剂盒的具体实施例，例如可举出如下构成：

(1)将包含本发明的抗CK-B抗体而成的第一试剂、包含第一抗体和第二抗体而成的第二试剂作为构成试剂的试剂盒；

(2)将包含本发明的抗CK-B抗体而成的第一试剂、包含第一抗体而成的第二试剂、和包含第二抗体而成的第三试剂作为构成试剂的试剂盒；或者

(3)将包含第一抗体、第二抗体和本发明的抗CK-B抗体而成的试剂作为构成试剂的试剂盒。

作为本发明的试样只要是含CK-MB的试样即可，具体而言，例如可举出血液、血浆、血清、关节液、肋膜液、淋巴液、骨髄液等体液，或尿、大便、唾液等，其中优选血清、血浆等。

以下，举出实施例来对本发明作更具体的说明，但本发明不受其任何限定。

实施例

实施例1

使用市售的CK-MB测定试剂盒、即L Type Wako CK-MB mass(和光纯药工业株式会社制)，根据试剂盒的附属文件的记载，进行如下测定。

上述试剂盒是利用分别固定有表位互不相同的两种抗CK-MB抗体的乳胶粒子、并通过乳胶凝集比浊法来测定CK-MB的方法中所使用的试剂盒。

(1)CK-BB试样的制备

在人血清在添加来源于人脑的精制CK-BB(Merideian Life Science,Inc.)并使其为400ng/mL和2000ng/mL，得到CK-BB试样。

(2)第一试剂的制备

在试剂盒附带的缓冲液中加入作为抗CK-B抗体的市售的小鼠抗CK-BB单克隆抗体、即MAb to CK-BB(Merideian Life Science,Inc.制)、或CKBB Monoclonal Antibody(Roche Diagnostics K.K.制)，制备出浓度为0μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL的含抗体的缓冲液(第一试剂)。

且，当混合CK-BB试样和第一试剂时，反应溶液中的抗CK-B抗体的浓度分别为0μg/mL、1.2μg/mL、2.3μg/mL、4.9μg/mL、9.4μg/mL、18.8μg/mL、37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL。

(3)第二试剂

将试剂盒附带的乳胶试液用作为第二试剂。乳胶试液含有分别固定有识别表位互不相同的两种抗CK-MB抗体的、两种乳胶粒子。

(4)CK-MB的测定(两端点法)

用日立7170自动分析装置(株式会社日立高新技术制)进行以下测定。

即，在上述(1)所制备的10μL的CK-BB试样中混合上述(2)所制备的150μL的第一试剂，在37℃下保温5分钟后，添加第二试剂50μL再保温5分钟。添加第二试剂后，测定从30秒后到5分钟后为止的、660nm下的吸光度变化。

作为对照，除了使用不含抗CK-B抗体的缓冲液作为第一试剂以外，使用相同试剂、测定设备，并用相同的方法测定相同的试样中的CK-MB。

(5)结果

在表1中示出使用含有MAb to CK-BB作为抗CK-B抗体的第一试剂时的结果。

另外，在表1中一并示出有：用400ng/mL以及2000ng/mL的CK-BB试样进行CK-MB的测定得到的测定值(CK-MB测定)，以及用该试样进行CK-MB测定得到的CK-MB测定值与测定中使用的CK-BB试样的浓度之间的比率(CK-BB交叉率)。

表1

在本实施例中，对不含CK-MB的试样中的CK-MB值进行了测定。然而，根据表1，当例如用含400ng/mL的CK-BB的试样，并用不含抗CK-B抗体(MAb to CK-BB)的第一试剂来进行CK-MB的测定时(即抗CK-B抗体的添加浓度为0μg/mL时)，得到18.6ng/mL的测定值。由于该试样中包含400ng/mL的CK-BB，因此以该测定得出18.6(ng/mL)/400(ng/mL)×100≈4.6％的交叉率，判定混杂了CK-BB的测定值(伪高值)。同样地，当用含2000ng/mL的CK-BB的试样，并用不含抗CK-B抗体(MAb toCK-BB)的第一试剂来进行CK-MB的测定时，其交叉率为5.3％。

与此相对地，如果用含抗CK-B抗体(MAb to CK-BB)的第一试剂来进行CK-MB的测定，则CK-BB的交叉率明显降低。例如用含5μg/mL的抗CK-B抗体(MAb to CK-BB)的第一试剂来进行CK-MB的测定时的CK-BB交叉率，无论是使用400ng/mL的试样、还是使用2000ng/mL的试样，在两种情况下均为0.8％。即，如果用含抗CK-B抗体(MAb to CK-BB)的第一试剂来进行CK-MB的测定，则与用不含抗CK-B抗体(MAb toCK-BB)的第一试剂所进行CK-MB的测定的情况相比，CK-BB对CK-MB测定值的影响得到了明显的抑制。

相同地，在表2中示出使用第一试剂时的结果，所述第一试剂含有作为抗CK-B抗体的CKBB Monoclonal Antibody。

表2

由表2的结果可知，当用含抗CK-B抗体(CKBB Monoclonal Antibody)的第一试剂来进行CK-MB的测定时，与用不含抗CK-B抗体(CKBBMonoclonal Antibody)的第一试剂所进行CK-MB的测定的情况相比，CK-BB的影响也得到了明显的抑制。

由以上的结果可判定：通过在以往的乳胶凝集比浊法的CK-MB的测定系统中加入抗CK-B抗体(CKBB Monoclonal Antibody)，避免了存在于试样中的CK-BB的影响，从而能对CK-MB进行高特异性的测定。

另外，虽然数据并未显示，但除此以外，作为抗CK-B抗体还使用含BiosPacific,Inc.制造的CK-BB Monoclonal Antibody、或Fitzgerald I.I.制造的CKBB antibody的第一试剂，用与上述相同的方法进行了CK-MB的测定。其结果，与用不含这些抗体的第一试剂进行CK-MB的测定的情况相比，能明显地抑制CK-BB的影响。从而可判定：通过在以往的乳胶凝集比浊法的CK-MB的测定系统中加入这些CK-B抗体(BiosPacific,Inc.制的CK-BB Monoclonal Antibody或Fitzgerald I.I.制的CKBB antibody)，避免了存在于试样中的CK-MB的影响，从而能对CK-MB进行高特异性的测定。

实施例2

根据实施例1的结果确认了实施例1使用的抗CK-B抗体(本发明的抗CK-B抗体)能够避免借助乳胶凝集比浊法的CK-MB测定时的CK-BB的影响，从而用以下方法确认了这些抗体的抗原性。

(1)免疫印迹

将0.1mg/mL的来源于人脑的精制CK-BB(Merideian Life Science,Inc.)2μL应用在SuperSep^TM(电泳用凝胶、和光纯药工业株式会社、5-20％的梯度凝胶)中，进行SDS-PAGE电泳(恒定电流25mA)。其次，用半干印迹法将电泳后的条带转印到PVDF薄膜上。

在PBS-T(Phosphate Buffered Saline with Tween^TM>

其次，作为抗CK-B抗体把4种市售的兔的抗CK-BB多克隆抗体(全为Abcam plc制)分别添加到浸有PVDF薄膜的封闭液中，在室温下处理2小时，所述抗CK-B抗体是将CK的B亚单位的整个氨基酸序列(序列号1)中的200aa-300aa(从N末端起200～300个氨基酸为止的氨基酸序列部分)作为(识别为)抗原的抗CK-B抗体、将同氨基酸序列中的350aa-C末端(从N末端起350个～C末端氨基酸为止的氨基酸序列部分)作为抗原的抗CK-B抗体、将同氨基酸序列中的165aa-357aa(从N末端起165～357个氨基酸为止的氨基酸序列部分)作为抗原的抗CK-B抗体、或者将同氨基酸序列中的1aa-100aa(从N末端起1～100个氨基酸为止的氨基酸序列部分)作为抗原的抗CK-B抗体。

其次，把与实施例1中使用的相同的抗CK-B抗体(Mab to CK-BB或CK-BB Monoclonal Antibody、本发明的抗CK-B抗体)进一步添加到浸有上述薄膜的封闭液中，在4℃下浸渍一整夜。然后，将封闭液换成足量的PBS-T，并把薄膜浸渍在PBS-T中10分钟后，用每次都换成新的PBS-T的方法对薄膜进行3次洗净。之后，把薄膜浸渍在新的封闭液中，并在封闭液中加入Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP(DAKO A/S)，在室温下浸渍1小时。接着，用足量的PBS-T洗净薄膜，并通过ECL^TM>

(2)结果

在图1中示出使用MAb to CK-BB作为本发明的抗CK-B抗体而得到的结果，在图2中示出使用CK-BB Monoclonal Antibody作为本发明的抗CK-B抗体而得到的结果。

在图1以及图2中，用箭头表示CK-BB的电泳条带的位置。

另外，在图1以及图2中“无添加”表示的是“未进行使用了兔的抗CK-B抗体的电泳条带的预处理”的情况。

进而，例如“200-300”表示的是“把CK的B亚单位中从N末端起200～300个氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体、与电泳条带先进行反应后，与本发明的抗CK-B抗体[MAb to CK-BB(图1)或CKBB Monoclonal Antibody(图2)]进一步反应”的结果。

“350-C”表示的是“把CK的B亚单位中从N末端起的350个～C末端氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体、与电泳条带先进行反应后，与本发明的抗CK-B抗体[MAb to CK-BB(图1)或CKBB Monoclonal Antibody(图2)]进一步反应”的结果。

“165-357”表示的是“把CK的B亚单位中从N末端起165～357个氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体、与电泳条带先进行反应后，与本发明的抗CK-B抗体[MAb to CK-BB(图1)或CKBBMonoclonal Antibody(图2)]进一步反应”的结果。

“1-100”表示的是“把CK的B亚单位中从N末端起1～100个氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体、与电泳条带先进行反应后，与本发明的抗CK-B抗体[MAb to CK-BB(图1)或CKBBMonoclonal Antibody(图2)]进一步反应”的结果。

由图1以及图2可知，只有在“1-100”的情况、即“把CK的B亚单位中从N末端起1-100个氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体、与电泳条带先进行反应后，与本发明的抗CK-B抗体[MAb toCK-BB(图1)或CKBB Monoclonal Antibody(图2)]进一步反应”的情况中，条带的染色程度明显降低。

这表明所使用的兔的抗CK-B抗体(把CK的B亚单位中从N末端起1-100个氨基酸为止的氨基酸序列部分作为抗原的兔的抗CK-B抗体)与本发明的抗CK-B抗体(MAb to CK-BB以及CKBB Monoclonal Antibody)对抗原(CK的B亚单位中从N末端起1-100个氨基酸为止的氨基酸序列部分)发生了冲突。

由上可知，本发明的抗CK-B抗体(MAb to CK-BB以及CKBBMonoclonal Antibody)是能识别CK的B亚单位中的1～100个氨基酸区域的抗体。

比较例1.

用以下方法来调查对CK的B亚单位的“从N末端起1～100个氨基酸区域”以外的区域进行识别的抗体是否能够避免CK-MB的测定中CK-BB的影响。

(1)CK-BB试样的制备

使用与实施例1相同的CK-BB试样。

(2)第一试剂的制备

在试剂盒(L Type Wako CK-MB mass)附带的缓冲液中加入下述的、分别对不同区域进行识别的市售的抗CK-B抗体，分别制备浓度5μg/mL的含抗体的缓冲液(第一试剂)。关于各抗体的“抗原”，参照各抗体的附属文件中关于抗原范围的记载。

抗体a：对CK的B亚单位中从N末端起200～300个氨基酸为止的氨基酸序列进行识别的抗CK-B抗体(兔的抗CK-BB多克隆抗体、Abcam plc制)

抗体b：对CK的B亚单位中从N末端起350个～C末端氨基酸为止的氨基酸序列进行识别的抗CK-B抗体(兔的抗CK-BB多克隆抗体、Abcam plc制)

抗体c：对CK的B亚单位中从N末端起165～357个氨基酸为止的氨基酸序列进行识别的抗CK-B抗体(兔的抗CK-BB多克隆抗体、Abcam plc制)

抗体d：MAb to CK-BB(Merideian Life Science,Inc.制、实施例1中使用的本发明的抗CK-B抗体。)。

(3)第二试剂

使用与实施例1所用相同的试剂盒附带的乳胶试液用作为第二试剂。

(4)CK-MB的测定(两端点法)

使用与实施例1所用相同的设备，并通过相同的方法进行CK-MB的测定。

(5)结果

将结果示于表3。

另外，表3中一并表示的是用400ng/mL以及2000ng/mL的CK-BB试样进行CK-MB的测定而得到的测定值(CK-MB测定)、以及用该试样进行CK-MB测定而得到的CK-MB测定值相对于测定中使用的CK-BB试样的浓度的比率(CK-BB交叉率)。

表3

由表3可知，当用含抗体a～c的第一试剂进行CK-MB的测定时，与用不含抗体a～c的第一试剂进行CK-MB的测定的情况相比，CK-MB测定值与CK-BB间的交叉率几乎没有变化。只有在用含抗体d(本发明的抗CK-B抗体)的第一试剂进行CK-MB的测定的情况中，CK-MB测定值与CK-BB间的交叉率有明显的降低。

由以上的结果可知，对CK的B亚单位中从N末端起1～100个氨基酸区域以外的区域进行识别的抗体(抗体a～c)无法抑制CK-BB对CK-MB的测定系统的影响。

实施例3

用与实施例1所用相同的市售的CK-MB测定试剂盒、即L Type Wako CK-MB mass(和光纯药工业株式会社)，并根据试剂盒的附属文件所记载的方法进行以下测定。

(1)基于本发明方法的CK-MB的测定

1)测定试样

作为测定试样使用如下血清：在从株式会社Veritas、NITTOBO MEDICAL株式会社、或International Biocience株式会社购买的血清中确认含有CK-BB的人血清。

2)第一试剂的制备

在试剂盒附带的缓冲液中加入本发明的抗CK-B抗体(Mab to CK-BB或CK-BB Monoclonal Antibody)，制备出浓度5μg/mL的含抗体的缓冲液(第一试剂)。

且，将第一试剂与测定试样混合后，反应溶液中的本发明的抗CK-B抗体的浓度为4.7μg/mL。

3)第二试剂

与实施例1相同地，使用试剂盒附带的乳胶试液作为第二试剂。

4)CK-MB的测定(两端点法)

用LABOSPECT008自动分析装置(株式会社日立高新技术制)进行测定。在上述1)的7μL含CK-MB的试样中混合由上述2)制备的100μL第一试剂，在37℃下保温5分钟后，添加33μL第二试剂，再保温5分钟。添加乳胶试液后，用660nm测定从30秒后起到5分钟后为止的吸光度变化。

作为对照，除了使用不含本发明的抗CK-B抗体的缓冲液以外，使用相同的试剂、测定设备，并通过相同的方法，进行相同试样中的CK-MB的测定。

(2)基于现有方法(电化学发光免疫测定法)的CK-MB的测定

用基于电化学发光免疫测定法的CK-MB测定用试剂盒、即Ekurushisu试剂CK-MBII(Roche Diagnostics株式会社制)，并使用cobas8000((Roche Diagnostics株式会社制)，测定相同试样中的CK-MB。

(3)结果

将结果示于下述表4。

表4

在表4中，用阴影标注出得到了CK-MB蛋白量在参考基准值“5.0ng/mL(参考临床检查法提要第33版)”以下的CK-MB值的情况。

由表4可知，与通过在不共存有本发明的抗CK-B抗体的情况下进行的、以往的乳胶凝集比浊法而得到的测定值(“不添加抗BCK-B抗体”)相比，根据本发明的方法得到的测定值(“添加Mab to CK-BB”或“添加CKBB Monoclonal Antibody”)，由于用以往的电化学发光免疫测定法得到的测定值与cutoff判定完全一致，因此用本发明的方法得到的测定值的可靠性高。

工业实用性

根据本发明的CK-MB的测定方法，即使试样中共存有CK-BB也能避免其影响，并能特异性地对CK-MB进行测定。另外，本发明的CK-MB的测定方法由于还适用于通用的自动分析装置，因此可用在临床检查领域的CK-MB的测定中，其非常具有实用性。