一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法

摘要

本发明提供一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法。本方法通过设计西瓜果斑病菌VapB特异性引物，以样品DNA为模板，利用上述通用引物进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，利用两对西瓜果斑病菌特异性引物VapB‑1F/VapB‑1R和VapB‑1F/VapB‑2R进行第二轮PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，如果出现175bp的特异条带，则确定所检测的病原菌为西瓜果斑病菌。本发明克服了生物学鉴定、酶联免疫技术和常规PCR等方法的缺点，提供了特异性快速、灵敏、特异的西瓜果斑病菌检测方法，可用于西瓜果斑病菌的早期诊断，对该病害的预防和及时防治具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及特异性植物病原菌PCR检测方法，具体涉及一种西瓜果斑病菌（Acidovorax>）巢式PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch, BFB)是西甜瓜等葫芦科作物上重要的细菌病害。瓜类细菌性果斑病是一种典型的种传病害，由西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli)引起。该病能侵染叶片、果实和种子，严重影响果实的品质和产量，对瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁。我国自上世纪90年代首次报道后，现已在新疆、宁夏、河北、内蒙古、北京、福建、海南、山东、吉林、湖南等地大量发生。瓜类细菌性果斑病造成大田西瓜和甜瓜减产甚至绝收，给西甜瓜生产带来巨大损失，该病害目前的发生已呈上升趋势。因此建立西瓜噬酸菌的快速、准确的检测技术是防止该病害发生的重要举措。

传统的病原菌检测技术是在分离和进行进一步的培养从而获得相应病原物的基础上，通过形态学观察和科赫氏法则来判断病原物的种类。但是，分离，培养全部过程往往都非常消耗时间以及需要大量的劳动力资源。免疫血清学鉴定方法虽然敏感，特异性强，但制备过程耗时耗力。近几年，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速的发展和应用，PCR快速分子检测方法普遍具有精度高，快速，有效的特点，而且PCR技术相对特异，敏感。而套式PCR检测方法拥有比传统过往PCR分子检测方法更准确的灵敏度以及更强的特异性。因此，建立西瓜果斑病菌快速分子检测体系，可以在西瓜发病前或者发病早期对发病植株进行快速准确检测，对西瓜果斑病害的及时预报，以及控制其产生的病害，保护我国瓜类产业具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，其具有特异性强、灵敏度高的特点，可用于田间西瓜果斑病的早期诊断。该技术对于西瓜果斑病菌引起病害显症之前的早期监测和及时防治具有十分重要的意义。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：

西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤A、基因组DNA提取：采用CTAB法提取西瓜果斑病菌基因组DNA或发病植物组织DNA；

步骤B、第一轮PCR扩增：以步骤A得到的DNA样品为模板，采用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/ VapB -1R经过PCR扩增得到第一轮PCR产物。

引物序列：VapB-1F：5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’；

VapB -1R：5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’；

PCR反应体系25μl：基因组DNA 1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)>

步骤C、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用特异性引物VapB-2F/VapB-2R经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物。

引物序列：VapB-2F：5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’；

VapB-2R：5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’；

PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)>

PCR扩增程序：94℃预变性4min， 94℃变性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；

步骤D、PCR扩增产物检测：取8 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在80 V 电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min后取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在175bp的特异条带，则确定所检测的病菌为西瓜果斑病菌。

本发明具有以下技术优势和积极效果

1、灵敏度高：本发明检测灵敏度为0.5 fg西瓜果斑病菌基因组DNA，较常规PCR灵敏度提高了1000倍。

2、特异性强：本发明针对性的检测出西瓜果斑病菌，能从西瓜果斑病菌基因组中扩增出175bp的单一目的条带，而燕麦食酸菌燕麦亚种、野油菜黄单胞菌锦葵致病变种、丁香假单胞菌、大黄欧文氏菌、方氏棒形杆菌、解淀粉欧文氏菌等30个参试菌株基因组DNA和西瓜植物组织DNA中均无扩增产物，受其他菌类干扰小，准确率高。

3、实用性好：本发明可用于西瓜果斑病潜伏期或者感病初期时的病害检测。对病害的早期诊断和及时防治报具有十分重要的意义。

4、操作简便快速：应用本发明方法，对带西瓜果斑病菌的植物组织进行病菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在8小时内完成。

附图说明

图1是西瓜果斑病菌VapB特异性引物的特异性验证结果。其中，M：DL2000 DNAMarker，1为阳性对照，2-3是不同来源地的西瓜果斑病菌的DNA，6：燕麦食酸菌燕麦亚种，7：野油菜黄单胞菌锦葵致病变种，8：丁香假单胞菌，9：大黄欧文氏菌，10：方氏棒形杆菌，11：解淀粉欧文氏菌，12：阴性对照。

图2是西瓜果斑病菌VapB灵敏性验证结果。其中，M为DL2000 DNA Marker，1-9：5.0ng/μL，5.0×10-1ng/μL，5.0×10-2ng/μL，5.0×10-3ng/μL，5.0×10-4ng/μL，5.0×10-5ng/μL，5.0×10-6ng/μL，5.0×10-7ng/μL，5.0×10-8ng/μL的不同浓度西瓜果斑病菌DNA。

图3是发病组织VapB特异性检测结果。其中，M为2000 DNA marker，1，8：健康植物组织，2：阳性对照，3-4：发病潜伏期植物组织，5-7，9：分别为发病植物组织。

具体实施方式

以下结合实施例具体阐述本发明。

实施例1西瓜果斑病菌的巢式PCR检测

1. 样品DNA提取

1.1 提取菌体DNA

将西瓜果斑病菌接种于LB液体培养基，28℃、200rpm过夜培养。用CTAB法提取细菌基因组DNA，具体操作如下：

1) 取1.5ml 培养物于2.0ml离心管中，12000rpm离心2min；

2) 弃上清液，加入567μl TE缓冲液重新悬浮菌体，加入30μl 10%SDS溶液和3μl 20mg/ml 的蛋白酶K，轻轻混匀，于37℃温育1h；

3) 加入100μl 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl 溶液，混匀后65℃温育10min；

4) 加入800μl的酚/氯仿/异戊醇溶液（三者体积比为25:24:1），混匀后12000rpm离心5min；

5) 取上清液转入新的1.5ml离心管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000rpm离心15 min；

6) 弃上清液，加入1000μl 无水乙醇，混匀，12000 rpm 离心 5 min；

7) 弃上清液，在超净工作台上自然晾干，加入60 μl ddH₂O溶解DNA，于－20℃保存备用。

1.2 提取待检植物组织样品DNA

1)称取荔枝发病组织100mg，加入液氮研磨成粉末，转入2.0ml离心管中；

2)加入1000μl CTAB/NaCl 溶液，于65℃水浴30min，每各10min混匀一次，12000rpm离心10min；

3)取上清液800μl于2.0ml离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液（三者体积比为25:24:1），混匀后12000rpm离心5min；

4)取上清液750μl于2.0ml离心管中，加入等体积的氯仿/异丙醇溶液（体积比为24:1），混匀，12000rpm离心5min；

5)取上清液500μl于2.0ml离心管中，加入50μl预冷的3mol/L NaAC溶液(PH=5.2)，混匀，加入50μl预冷的异丙醇，混匀，于－20℃放置30min；

6)4℃10000rpm离心5min，弃上清液，加入1000μl 预冷的75%无水乙醇洗涤沉淀2次，在用无水乙醇洗涤1次，在超净工作台上自然晾干，加入60 μl ddH₂O溶解DNA，于－20℃保存备用。

2. 第一轮PCR扩增

以提取的DNA样品为模板，采用西瓜果斑病菌VapB-like抗毒素基因引物VapB -1F/VapB -1R经过PCR扩增得到第一轮PCR产物。

引物序列：VapB-1F：5’-GGGCAATAGCTTGGCGGTTCG-3’

VapB -1R：5’-CATTGGCCTCGTCCCGGTTGA-3’

PCR反应体系25μl：基因组DNA 1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)>

2. 第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用特异性引物VapB-2F/VapB-2R经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物。

引物序列：VapB-1F：5’-GCGAACGTAGTCGAAGCGCTCG-3’

VapB-2R：5’-TGGCCTCGTCCCGGTTGAACT-3’

PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液1μl，10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)>

PCR扩增程序：94℃预变性4min， 94℃变性30sec，55℃退火30 sec，72℃延伸40sec，共30个循环；72℃延伸8min；4℃保存；

4. PCR扩增产物检测

取8 μl第二轮PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶，在80 V 电压下电泳30min，之后置于EB内染色20min后取出，于凝胶成像系统下观察拍照，如果存在175bp的特异条带，则确定所检测的病菌为西瓜果斑病菌。

实施例2 巢式PCR灵敏度试验

利用10倍稀释的方法将提取的西瓜果斑病菌初始浓度为50 ng/μL的DNA，分别稀释成5.0 ng/μL，5.0×10^-1ng/μL，5.0×10^-2ng/μL，5.0×10^-3ng/μL，5.0×10^-4ng/μL，5.0×10^-5ng/μL，5.0×10^-6ng/μL，5.0×10^-7ng/μL，5.0×10^-8ng/μL，5.0×10^-9ng/μL不同浓度进行套式PCR。分别取各浓度的DNA>

实施例3：发病组织中西瓜果斑病菌的检测

1．样品采集：植物组织样品采自福建福州不同地区超市及农贸市场。

2．DNA提取及检测

发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取西瓜果斑病菌DNA。具体过程如下：(1)将西瓜组织洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。

按实施例1的步骤2和步骤3依次进行第一轮和第二轮两轮PCR扩增。两轮扩增后的产物电泳结果见图3。其中，M为2000 DNA marker，1：健康植物组织，2：阳性对照，3-7：分别为发病植物组织，8-11：分别为发病潜伏期植物组织。由图3可见，利用巢式PCR对35个样品进行检测时均扩增出175bp的目的条带，健康组织和阴性对照均无扩增产物。这表明，本发明可用于西瓜果斑病潜伏期或者感病初期时的病害检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种西瓜果斑病菌巢式PCR检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggcaatagc ttggcggttc g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cattggcctc gtcccggttg a 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgaacgtag tcgaagcgct cg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggcctcgtc ccggttgaac t 21

去获取专利，查看全文>