解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用

摘要

本发明属于微生物菌剂的制作，特别是指解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用。是将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.12821接种于含有碳源、氮源、及必要营养元素的无菌发酵培养基，进行通气发酵制成含有上述活菌的液态微生物菌剂。本发明填补了目前尚无解淀粉芽孢杆菌用于麻山药根腐病防治的技术空白，具有所制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂的各项技术指标符合GB20287‑2006的要求，对麻山药根腐病防治效果及增产效果好且麻山药条型顺直、粗大、颜色白、畸形率低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌剂的制作，特别是指解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用。

背景技术

麻山药(Dicscorea opposite Thunb)属薯蓣科多年生草质藤本植物，根茎营养丰富，兼有食、药功能，具有健脾、补肺、益精等功效。现代研究表明，麻山药中的多糖具有降低血糖、提高及调节免疫、防止高血脂、调整胃肠、防止衰老的功能，麻山药中含有的尿囊素有抗刺激物、麻醉镇静、促进上皮生长、消炎抑菌等作用。因此麻山药日益受到国内外消费者的欢迎。近年来我国麻山药出口创汇的态势很好，国内市场的价格也稳步提升，栽培山药的经济效益是种植小麦、玉米的8-l0倍，栽培面积逐年扩大，仅河北省沿潴龙河两岸有近万公顷的栽培面积，已走上产业化发展道路，成为当地农民的主要经济收入来源。但随着种植面积的扩大和不平衡施肥现象日益严重，化肥的过量使用，使土壤状况持续下降，土壤微生物环境遭到破坏，在种植过程中出现大量问题，病虫害时有发生，重茬现象严重，经常会造成减产或绝收。根腐病是麻山药重茬病的一种，是危害麻山药生产最严重的病害之一。目前生产上通常采用轮作和化学杀菌剂消毒种薯的方法减少根腐病的发生，但由于土传病害病原菌的寄主范围广，有时轮作难以奏效。而农药使用不仅可造成对人体健康的直接损害，也造成对环境的污染，长期使用后病原菌容易产生抗药性，增加防治难度，形成恶性循环。随着生物技术的发展，人们开始认识到施用微生物菌剂是改善土壤环境，从根本上解决作物重茬问题的有效措施。

解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，其与枯草芽孢杆菌亲缘性很高，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物。这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌可广泛的抑制真菌和细菌的活性。一般生长速度快，是植物根际土壤和植物体表体内的重要微生物，抑菌谱广，对于很多植物病菌均有较好的抑菌作用。

申请人检索到的背景文献包括：

1、《北方园艺》2011(01):159-160中公开了10亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂”对麻山药根腐病的有效剂量为15kg/hm²,平均防治效果70.34％,显著高于对照药剂敌克松的防效(20.26％),说明其对麻山药吸收根具有显著刺激生长作用，田间相对防效最高可达88.65％。

2、公开号为CN102382810A的专利文献中公开了预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法，其主要技术解决方案是将益生菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，发酵过程是在温度为30-37℃、pH值7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝雷丝孢酵母、淡紫拟青霉、细黄链霉菌、多粘芽孢杆菌和金龟子绿僵菌的等质量混合物，对发酵终产物吸附、固定化于草炭上制成益生菌菌剂。可有效的预防黄瓜霉菌病、烂根病和黄萎病。

3、公开号为CN105907683A的专利文献中公开了解淀粉芽孢杆菌cd5bc对辣椒菌核病、苦瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、黄黑星病、水稻稻瘟病、水稻纹枯病、蚕豆赤斑病、蚕豆褐斑病的病原菌的抑菌率均高达70％以上，对蚕豆赤斑病、蚕豆褐斑病病原菌的抑菌率高达100％。

申请人认为，不同作物易染病菌不一样，且不同菌株对同一种病菌的防治效果也存在较大区别。目前将解淀粉芽孢杆菌用于麻山药根腐病防治未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供解淀粉芽孢杆菌及其在麻山药根腐病防治中的应用。

本发明的整体技术构思是：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.12821。

本发明中的菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCCNo.12821系申请人从河北省保定市定兴县麻山药根际土壤中分离取得，申请人已于2016年8月8日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位简称CGMCC。

该菌种的形态特征及生理生化特征如下：

本发明中的菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCCNo.12821为革兰氏阳性，圆形光滑菌落，湿润，边缘整齐，呈微黄色,芽孢中生，不膨胀，椭圆，在葡萄糖培养基上产酸、产气V.P反应阳性，能水解淀粉，厌氧条件下和3℃不生长，在7％氯化钠中生长，G+C含量为43.5-44.9％。菌体大小为0.7-0.8×2-3μm。

上述菌种具有高效的解磷、解钾能力，用四苯硼钠法和钼锑抗比色法测定解钾、解磷能力，结果分别是解钾能力为6.13mg/L、解有机磷能力为7.95mg/L、解无机磷能力为82.79mg/L；接种麻山药根部30天后，经测定，解淀粉芽孢杆菌数量有10-100倍的增加，说明该菌株有良好的定植能力。

解淀粉芽孢杆菌在麻山药根腐病防治中的应用，是将解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.12821接种于含有碳源、氮源、及必要营养元素的无菌发酵培养基，进行通气发酵制成含有上述活菌的液态微生物菌剂。

本发明中的具体技术内容还有：

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉0.3％-1.5％；豆饼粉0.03％-0.1％；碳酸钙0.05％-0.2％；蔗糖0.08％-0.5％；硫酸铵0.01％-0.08％；三水合磷酸氢二钾0.08％-0.5％；七水合硫酸镁0.08％-0.5％；六水合三氯化铁0.008％-0.05％；酵母膏0.03％-0.15％；氢氧化钾0.01％-0.1％；泡敌0.005％-0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐容积10吨，装量60％-80％。按照体积比为10％-15％的接种量接种，发酵过程中温度为25-32℃，压力为0.03-0.05MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为200-250M³/hr，4-8小时为320-360M³/hr，8-12小时为420-470M³/hr，12-20小时为520-560M³/hr，20小时后为600-630M³/hr；发酵4-8小时后搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点,质检后包装入库。

为缩短发酵周期，优选且较为常见的技术方案是，所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.12821在接入发酵培养基前经过扩大培养。

更为优选的技术方案是，所述的扩大培养包括试管斜面菌种的制备、克氏瓶斜面菌种的制备及种子液的制备。

所述的斜面菌种的制备是将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12821中接种于无菌的试管斜面菌种培养基经培养制成试管斜面菌种；试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖5-15克；三水合磷酸氢二钾0.2-1.0克；七水合硫酸镁0.1-0.5克；氯化钠0.1-0.5克；碳酸钙0.5-3克；酵母膏0.1-1.0克；琼脂15-22克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为25-32℃，培养周期2-3天。

所述的克氏瓶斜面菌种的制备是将试管斜面菌种接种于无菌的克氏瓶斜面菌种培养基经培养制成克氏瓶斜面菌种，克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖0.5-2克；蛋白胨0.5-2克；三水合磷酸氢二钾0.5-2克；硫酸铵0.1-0.5克；酵母膏0.3-1.5克；七水合硫酸镁0.1-0.5克；琼脂15-22克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶60-80ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为25-32℃，培养周期2-3天。

所述的种子液的制备是将克氏瓶斜面菌种接种于无菌的种子培养基经培养制成种子液，种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉0.2％-1.0％；豆饼粉0.1％-0.7％；蔗糖0.05％-0.3％；碳酸钙0.05％-0.3％；硫酸铵0.1％-1.0％；泡敌0.005％-0.015％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下2-3瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中。种子罐体积1吨，装量60％-80％。培养温度25-32℃，压力0.05MPa，0-8小时：通风量为50-70M³/hr，8小时以后：通风量为70-90M³/hr，培养周期15-20小时。

所述的种子液制备过程中的培养终点是取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时、含菌量达到工艺要求且无杂菌。

所述的发酵4-8小时后搅拌转速为730转/分钟。

本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明填补了目前尚无解淀粉芽孢杆菌用于麻山药根腐病防治的技术空白，经申请人对利用本发明的方法制备的液态微生物菌剂进行检测，各项技术指标符合GB20287-2006的要求。

2、经申请人在保定市定兴县和蠡县进行的田间对比试验结果表明，使用本发明制备的液态微生物菌剂比施用敌克松可湿性粉剂对麻山药根腐病防治效果明显提高，增产效果显著提高且麻山药条型顺直、粗大、颜色白、畸形率低。

本发明中的菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCCNo.12821系申请人从河北省保定市定兴县麻山药根际土壤中分离取得，申请人已于2016年8月8日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位简称CGMCC。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.12821。

解淀粉芽孢杆菌在麻山药根腐病防治中的应用，是将解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.12821接种于含有碳源、氮源、及必要营养元素的无菌发酵培养基，进行通气发酵制成含有上述活菌的液态微生物菌剂。

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉1.5％；豆饼粉0.1％；碳酸钙0.2％；蔗糖0.5％；硫酸铵0.08％；三水合磷酸氢二钾0.5％；七水合硫酸镁0.5％；六水合三氯化铁0.05％；酵母膏0.15％；氢氧化钾0.1％；泡敌0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐容积10吨，装量80％。按照体积比为15％的接种量接种，发酵过程中温度为32℃，压力为0.05MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为250M³/hr，4-8小时为360M³/hr，8-12小时为470M³/hr，12-20小时为560M³/hr，20小时后为630M³/hr；发酵4-8小时后搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点，质检后包装入库。

所述的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12821在接入发酵培养基前经过扩大培养。

所述的扩大培养包括试管斜面菌种的制备、克氏瓶斜面菌种的制备及种子液的制备。

所述的斜面菌种的制备是将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12821中接种于无菌的试管斜面菌种培养基经培养制成试管斜面菌种；试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖15克；三水合磷酸氢二钾1.0克；七水合硫酸镁0.5克；氯化钠0.5克；碳酸钙3克；酵母膏1.0克；琼脂22克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为32℃，培养周期2天。

所述的克氏瓶斜面菌种的制备是将试管斜面菌种接种于无菌的克氏瓶斜面菌种培养基经培养制成克氏瓶斜面菌种，克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖2克；蛋白胨2克；三水合磷酸氢二钾2克；硫酸铵0.5克；酵母膏1.5克；七水合硫酸镁0.5克；琼脂22克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶80ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为32℃，培养周期3天。

所述的种子液的制备是将克氏瓶斜面菌种接种于无菌的种子培养基经培养制成种子液，种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉1.0％；豆饼粉0.7％；蔗糖0.3％；碳酸钙0.3％；硫酸铵1.0％；泡敌0.015％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下3瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中，种子罐体积1吨，装量80％。培养温度32℃，压力0.05MPa，0-8小时：通风量为70M³/hr，8小时以后：通风量为90M³/hr，培养周期15小时。

所述的种子液制备过程中的培养终点是取样镜检观察生长状况，当菌体处于对数期生长期时、含菌量达到工艺要求且无杂菌。

所述的发酵4-8小时后搅拌转速为730转/分钟。

所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为81.2亿/mL，无霉菌污染，杂菌率≤1％，pH为6.8。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉0.3％；豆饼粉0.03％；碳酸钙0.05％；蔗糖0.08％；硫酸铵0.01％；三水合磷酸氢二钾0.08％；七水合硫酸镁0.08％；六水合三氯化铁0.008％；酵母膏0.03％；氢氧化钾0.01％；泡敌0.005％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐为通用式发酵罐，容积10吨，装量60％。按照体积比为10％的接种量接种，发酵过程中温度为25℃，压力为0.03MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为200M³/hr，4-8小时为320M³/hr，8-12小时为420M³/hr，12-20小时为520M³/hr，20小时后为600M³/hr；发酵4-8小时后开始搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点，质检后包装入库。

试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖5克；三水合磷酸氢二钾0.2克；七水合硫酸镁0.1克；氯化钠0.1克；碳酸钙0.5克；酵母膏0.1克；琼脂15克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为25℃，培养周期3天。

克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖0.5克；蛋白胨0.5克；三水合磷酸氢二钾0.5克；硫酸铵0.1克；酵母膏0.3克；七水合硫酸镁0.1克；琼脂15克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶60ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为25℃，培养周期3天。

种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉0.2％；豆饼粉0.1％；蔗糖0.05％；碳酸钙0.05％；硫酸铵0.1％；泡敌0.005％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下2瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中，种子罐体积1吨，装量60％。培养温度25℃，压力0.05MPa，0-8小时：通风量为50M³/hr，8小时以后：通风量为70M³/hr，培养周期20小时。

所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为81.5亿/mL，无霉菌污染，杂菌率≤1％，pH为6.8。

其余内容同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉0.9％；豆饼粉0.065％；碳酸钙0.12％；蔗糖0.29％；硫酸铵0.045％；三水合磷酸氢二钾0.29％；七水合硫酸镁0.29％；六水合三氯化铁0.029％；酵母膏0.09％；氢氧化钾0.065％；泡敌0.012％-0.02％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐容积10吨，装量75％。按照体积比为13％的接种量接种，发酵过程中温度为29℃，压力为0.04MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为220M³/hr，4-8小时为340M³/hr，8-12小时为450M³/hr，12-20小时为540M³/hr，20小时后为615M³/hr；发酵4-8小时后搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点，质检后包装入库。

试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖10克；三水合磷酸氢二钾0.6克；七水合硫酸镁0.3克；氯化钠0.3克；碳酸钙1.8克；酵母膏0.55克；琼脂19克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为28℃，培养周期2.5天。

克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖1.25克；蛋白胨1.25克；三水合磷酸氢二钾1.25克；硫酸铵0.3克；酵母膏0.9克；七水合硫酸镁0.3克；琼脂18克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶70ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为28℃，培养周期2.5天。

种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉0.6％；豆饼粉0.4％；蔗糖0.17％；碳酸钙0.17％；硫酸铵0.55％；泡敌0.01％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下2.5瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中，种子罐体积1吨，装量75％。培养温度28℃，压力0.03MPa，0-8小时：通风量为60M³/hr，8小时以后：通风量为80M³/hr，培养周期18小时。

所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为82.5亿/mL。无霉菌污染，杂菌率≤1％，pH为6.9。

其余内容同实施例1。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉0.6％；豆饼粉0.04％；碳酸钙0.08％；蔗糖0.1％；硫酸铵0.02％；三水合磷酸氢二钾0.2％；七水合硫酸镁0.2％；六水合三氯化铁0.02％；酵母膏0.05％；氢氧化钾0.03％；泡敌0.008％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐容积10吨，装量70％。按照体积比为11％的接种量接种，发酵过程中温度为26℃，压力为0.035MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为210M³/hr，4-8小时为330M³/hr，8-12小时为430M³/hr，12-20小时为530M³/hr，20小时后为610M³/hr；发酵4-8小时后搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点，质检后包装入库。

试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖7克；三水合磷酸氢二钾0.4克；七水合硫酸镁0.2克；氯化钠0.2克；碳酸钙1克；酵母膏0.3克；琼脂16克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为26℃，培养周期2.5天。

克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖1克；蛋白胨1克；三水合磷酸氢二钾1克；硫酸铵0.2克；酵母膏0.6克；六水合硫酸镁0.2克；琼脂16克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶65ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为26℃，培养周期2.5天。

种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉0.4％；豆饼粉0.3％；蔗糖0.1％；碳酸钙0.1％；硫酸铵0.3％；泡敌0.007％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下2瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中，种子罐体积1吨，装量70％。培养温度26℃，压力0.05MPa，0-8小时：通风量为55M³/hr，8小时以后：通风量为75M³/hr，培养周期19小时。

所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为83.9亿/mL。无霉菌污染，杂菌率≤1％，pH为6.8。

其余内容同实施例1。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

所述的发酵培养基由如下质量百分数的组分组成：

淀粉1.2％；豆饼粉0.08％；碳酸钙0.15％；蔗糖0.4％；硫酸铵0.06％；三水合磷酸氢二钾0.4％；七水合硫酸镁0.4％；六水合三氯化铁0.04％；酵母膏0.12％；氢氧化钾0.08％；泡敌0.018％；余量为自来水；pH＝7.2-7.4；

通气发酵的工艺条件如下：

发酵罐容积10吨，装量65％。按照体积比为12％的接种量接种，发酵过程中温度为30℃，压力为0.045MPa；发酵过程中通风量为：0-4小时为240M³/hr，4-8小时为350M³/hr，8-12小时为460M³/hr，12-20小时为550M³/hr，20小时后为620M³/hr；发酵4-8小时后搅拌，当发酵液中不低于95％的营养体形成芽孢且有效活菌不低于80亿/mL时，作为发酵终点，质检后包装入库。

试管斜面菌种的培养基由如下质量的原料组成：

蔗糖12克；三水合磷酸氢二钾0.8克；七水合硫酸镁0.4克；氯化钠0.4克；碳酸钙2.5克；酵母膏0.8克；琼脂21克；水1000毫升；pH＝7.2；

试管斜面菌种的培养条件是：

温度为30℃，培养周期2天。

克氏瓶斜面菌种培养基由如下质量的原料组成：

葡萄糖1.5克；蛋白胨1.5克；三水合磷酸氢二钾1.5克；硫酸铵0.4克；酵母膏1.2克；七水合硫酸镁0.4克；琼脂21克；水1000ml；pH＝7.2；

克氏瓶斜面菌种的培养条件是：

将上述克氏瓶斜面菌种培养基按照每瓶75ml的量装入250ml克氏瓶中，培养温度为30℃，培养周期2天。

种子液培养基由如下质量百分含量的原料组成：

淀粉0.8％；豆饼粉0.6％；蔗糖0.2％；碳酸钙0.2％；硫酸铵0.8％；泡敌0.012％；余量为自来水；pH＝7.2；

种子液的培养条件是：

用无菌水清洗下3瓶克氏瓶斜面菌种培养基上生长好的菌种制成菌悬液，将菌悬液接种至盛装有无菌的种子培养基的种子罐中，种子罐体积1吨，装量65％。培养温度31℃，压力0.05MPa，0-8小时：通风量为65M³/hr，8小时以后：通风量为85M³/hr，培养周期16小时。

所制备的微生物菌剂中有效活菌含量为82.0亿/mL。无霉菌污染，杂菌率≤1％，pH为6.9。

其余内容同实施例1。

经申请人检测表明，采用本发明实施例1-5的方法所制备的微生物菌剂均符合GB20287-2006的标准。

为验证本发明的效果，申请人对实施例1-5中制备的微生物菌剂进行如下田间应用试验：田间应用试验参照《微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南(NY/T 1536-2007)执行。试验分2014和2015两年进行。2014年试验地在保定市定兴县北田村，麻山药品种为棒药，4月29日播种，10月25日收获；2015年在保定市蠡县随东村进行，5月2日播种，10月28日收获。试验地均为重茬2年土地，每年选择两块试验地进行试验。麻山药根腐病病原菌为立枯丝核菌。敌克松可湿性粉剂为市售。

一、试验设计

每组试验均采用随机区组设计。解淀粉芽孢杆菌菌剂用量为15kg/hm²，敌克松可湿性粉剂用量为15kg/hm²，设敌克松可湿性粉剂(T₁)、解淀粉芽孢杆菌菌剂(本发明实施例1-5所制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂，T₂-T₆)和清水对照(CK)七个处理，每处理4次重复，小区面积60m²。各处理浇水、施肥等其他管理条件一致。

二、试验方法

分别将解淀粉芽孢杆菌菌剂和敌克松可湿性粉剂按450kg/hm²加水稀释，用喷雾器均匀喷洒到播好种的麻山药种薯上，随即覆土封沟。

三、试验调查

(一)麻山药发病率调查：麻山药定植出苗后30d开始麻山药根腐病初次调查，每小区调查30株麻山药的吸收根，每隔15d调查1次。收获之前计算相对防效。

病情指数＝[Σ(各级病根根数×该病级值)/(调查总根根数×最高病级值)]×100

相对防效(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100

(二)麻山药产量调查：各处理分别采收，每个处理随机挖取30株，进行调查，称块总重，计算产量。

四、试验结果如表1。

表1麻山药根腐病的防治效果及对产量的影响

由表1可见如下结果：

1、对麻山药根腐病的防效

施用本发明中实施例1-5的方法所制备的解淀粉芽孢杆菌制剂相对防效均达到89.6％以上。分别高于施用化学药剂敌克松可湿性粉剂的T₁处理4.69％-9.58％。可见采用本发明的方法制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂对麻山药根腐病具有很高的防效。

2、对麻山药的增产效果

从产量结果看，四块地的对照处理由于发病率较高，严重影响麻山药产量，均显著低于T₁-T₆处理，而T₂-T₆处理产量分别比T₁处理高7.48％-11.7％，差异均显著。可见本发明方法制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂对麻山药的增产效果亦显著。从麻山药成品的顺直和整齐度来看，施用采用本发明实施例1-5的方法所制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂的麻山药条型顺直、粗大，颜色白，畸形率低。