多囊卵巢综合征的诊断和/或分型标志物及制备试剂的用途

摘要

本发明公开了多囊卵巢综合征的诊断和/或分型标志物及制备试剂的用途。具体为环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮、棕榈鞘磷脂联合高密度脂蛋白胆固醇和左卵泡数目作为多囊卵巢综合征的诊断和/或分型标志物的用途。相比现有PCOS诊断的临床指标而言，环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮、棕榈鞘磷脂联合诊断即可达到区分PCOS亚组一和亚组二的效果。而结合HDL‑C与左卵泡数目联合诊断，对正常、PCOS亚组一和亚组二均达到了非常高的诊断准确率，为临床疾病诊断提供了准确有效的指标体系。

说明书

技术领域

本发明属于基于生物标志物的疾病诊断技术领域，具体涉及多囊卵巢综合征的诊断和/或分型标志物及试剂。

背景技术

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)于1935年首先由Stein和Leventhal提出，它是一种生殖障碍和代谢紊乱为主要表现的内分泌综合征。持续性无排卵、雄激素过多和胰岛素抵抗是其重要特征，是生育期妇女最常见的内分泌紊乱性疾病，其生化改变、发病机制及临床表现有高度的异质性，病因亦尚未阐明，治疗手段目前仍停留在对症治疗及促排卵层面，尚无特效治疗手段。

多囊卵巢综合征的西医临床诊断标准(鹿特丹诊断标准)：⑴稀发排卵或无排卵。⑵高雄激素的临床表现和/或高雄激素血症。⑶卵巢多囊性改变：一侧或双侧卵巢直径2～9mm的卵泡≥12个，和/或卵巢体积≥10mL。⑷上述三条中符合两条。

诊断过程需要结合问诊、超声和多个免疫生化试剂盒的联合检测，成本高、诊断复杂。因此开发新的方法应用于临床十分紧迫。

AE-PCOS和香港大学共同举办了一次共识会议，通过对亚太地区PCOS临床研究的总结，结合对我国社区15924名受试者的流行病学调查，发现亚太地区PCOS女性临床特点与欧美女性显著不同，亚太地区女性胰岛素抵抗的发病率更高(Human Reproduction,2013,28:2562)，鹿特丹诊断标准中的高雄激素血症诊断标准不适用于亚洲人群，95.5％的亚洲PCOS女性FG评分均≤5分，应将FG评分>4分作为亚洲女性多毛的诊断标准。

PCOS涉及的病理机制非常复杂，目前对于PCOS已有体内代谢方面的研究，研究发现PCOS主要与甾体激素代谢(Jedel E,Gustafson D,Waern M,et al.Psychoneuroendocrinology,2011,36(10):1470-1479.)、脂肪酸代谢(Zhang X J,Huang L L,Su H,et al.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2014,95:85-92.)和氨基酸代谢(Zhang C,Zhao Y,Li R,et al.BMC pregnancy and childbirth,2014,14(1):11)有关。虽然在这几类代谢中都有定性定量分析，但是有的研究只关注部分化合物，还有的研究仅仅是涉及到一些化合物的变化，并没有重点关注，说明已有的研究存在碎片化的倾向，而PCOS是非常复杂的代谢紊乱疾病，需要从整体和系统上来探讨，并将探索的结果加以整合，建立整合生物标志物系统，从而来探讨发病机制以及指导临床诊断和治疗。

发明内容

本发明的一个目的在于针对目前多囊卵巢综合征诊断复杂、成本高的临床问题，提供一组标志物，可以联合辅助诊断多囊卵巢综合征和/或对其分型。

本发明的第二个目的是提供一组检测试剂在制备用于诊断和/或分型多囊卵巢综合征的试剂中的用途，为多囊卵巢综合征的诊断和/或分型提供更加便捷高效的试剂。

具体地，根据本发明的第一个目的，本发明提供了环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮、棕榈鞘磷脂联合高密度脂蛋白胆固醇和左卵泡数目作为多囊卵巢综合征的诊断和/或分型标志物的用途。

根据本发明的第二个目的，本发明还提供了环磷酸鸟苷检测试剂、硫酸脱氢表雄酮检测试剂联合棕榈鞘磷脂检测试剂，在制备用于诊断和/或分型多囊卵巢综合征的试剂中的用途。这三种检测试剂，可以直接使用现有市售商品，也可以自行制备，本发明并不对其进行任何限制。

优选地，上述用途中，所述环磷酸鸟苷检测试剂检测生物样本中环磷酸鸟苷的浓度；所述硫酸脱氢表雄酮检测试剂检测生物样本中硫酸脱氢表雄酮的浓度；所述棕榈鞘磷脂检测试剂检测生物样本中棕榈鞘磷脂的浓度。

优选地，上述用途中，所述生物样本为血清、血浆或血液。

优选地，上述用途中，所述环磷酸鸟苷的浓度标记为X₁，硫酸脱氢表雄酮的浓度标记为X₂，棕榈鞘磷脂的浓度标记为X₃，按照诊断方程Y＝0.408X₁+0.017X₂+0.011X₃-16.535，

当Y≤-5.20时，该样本判定为正常样本；当-5.20<Y≤2.29时，该样本为PCOS患者样本，且判定分型为亚组一；当Y＞2.29时，该样本为PCOS患者样本，且可判定分型为亚组二；

所述亚组一为激素代谢异常为主的亚型；

所述亚组二为激素代谢异常伴有显著的脂代谢异常为主的亚型。

优选地，上述实现第二个目的的其中几个用途中，还联合有高密度脂蛋白胆固醇检测试剂。4中标志物的检测试剂联合，可以用于制备成试剂盒。

优选地，上述用途中，所述高密度脂蛋白胆固醇检测试剂检测生物样本中高密度脂蛋白胆固醇的浓度，所述生物样本为血清、血浆或血液。

优选地，上述用途中，还联合左卵泡数目进行多囊卵巢综合征诊断和/或分型。

优选地，上述用途中，所述环磷酸鸟苷的浓度标记为X₁，硫酸脱氢表雄酮的浓度标记为X₂，棕榈鞘磷脂的浓度标记为X₃，高密度脂蛋白胆固醇的浓度标记为X₄，左卵泡数目标记为X₅，按照诊断方程Y＝0.402X₁+0.009X₂+0.034X₃+15.775X₄+2.906X₅-42.597，

当Y≤11.34时，该样本判定为正常样本；当11.34<Y≤33.23时，该样本为PCOS患者样本，且判定分型为亚组一；当Y＞33.23时，该样本为PCOS患者样本，且可判定分型为亚组二；

所述亚组一为激素代谢异常为主的亚型；

所述亚组二为激素代谢异常伴有显著的脂代谢异常为主的亚型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过联合多个小分子代谢物共同作为标志物，实现了简单快速诊断多囊卵巢综合征的目的，同时降低了检测成本。另外，申请人研究首次发现多囊卵巢综合征患者具有两个亚型，本发明提供的组合的小分子代谢物也可在多囊卵巢综合征分型诊断中应用，为疾病的科学治疗奠定了基础。通过本发明筛选出的小分子代谢物，选用其检测剂制备诊断和/或分型试剂，配合分析检测方法，有效解决了多囊卵巢综合征诊断复杂、成本高的临床问题。

附图说明

图1是PCOS患者和正常组的代谢组学数据OPLS-DA分析图。

图2是PCOS患者和正常组代谢数据Loading图。

图3是3个聚焦代谢物在各组变化情况，其中，*表示与正常组相比，P＜0.05；^△表示与亚组一相比，P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下仅为本发明的其中一个示例性实施例：

一、PCOS患者血浆样本的代谢组学研究

1材料

1.1病例选择

所有观察病例为北京协和医院就诊的患者血浆共49例，健康志愿血浆50例。PCOS诊断标准参照2003年的Rotterdam统一的国际标准，具备以下3项指标中的两项：①排卵障碍，具有月经异常(稀发、闭经)和不孕等；②高雄，多毛和痤疮等高雄表现；或高雄血症，即月经第3～5d或闭经期血总睾酮水平≥2.2nmol/L；③多囊卵巢形态学，经直肠超声检查，至少在一个卵巢的一个截面见直径3～8mm的10个及以上的卵泡。

1.2仪器与试剂

液相检测：采用Waters ACQUITY超高效液相色谱系统，配自动进样器；质谱检测：采用Waters Xevo G2Q-TOF高分辨质谱仪，配ESI电离源；振动和旋涡混合：采用江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司的VORTEX-5涡旋混合器；旋转式水浴氮吹仪；离心：采用美国Beckman Coulter的AllegraTM X-22台式高速冷冻离心机。

HPLC级乙腈、甲醇：购自德国Merck公司；甲酸：购自瑞士Fluka公司；超纯水(18.2MΩ)：法国Millipore公司Milli-Q超纯水系统制备；其他试剂均采用市售分析纯。

2方法

2.1临床样本的收集

所有观察对象于月经干净后5～7d(闭经者经B超检查无优势卵泡时，日期不限)，清晨空腹采集肘静脉血8mL，留置于EDTA抗凝管中，4℃、3000转/分钟离心15min后收集血浆分装于1.5mL Eppendorf管中，放入-80℃冰箱储存。

2.2临床指标测定

物理检查：受试者脱鞋，着单衣，分别测量身高(m)、体质量(kg)，计算BMI，公式如下：BMI＝体质量/身高2(kg/m²)。

测量受试者的腰围(cm)、臀围(cm)，计算WHR，公式如下：WHR＝腰围/臀围；右卵泡数目、右卵泡大小/cm、左卵泡数目、左卵泡大小/cm。

激素检查：受试者测定FSH(IU/L)、LH(IU/L)、PRL(ng/ml)、E2(pg/ml)、P(ng/ml)、T(ng/ml)、Ds(μg/dl)、TC(mmol/L)、TG(mmol/L)、HDL-C(mmol/L)、LDL-C(mmol/L)、ApoA1(g/L)、ApoB(g/L)、Lp(a)(mg/L)、hsCRP(mg/L)、FFA(μmol/L)、GLU(mmol/L)、INS(μIU/ml)、HbA1c(％)。

2.3血液样品前处理

将保存的血浆4℃冻融后，振荡混合均匀，吸取100μL血浆样本，加入甲醇400μL，涡旋振荡2min沉淀蛋白，离心(4℃，12000rpm，20min)，取上清400μL，转移至1.5mL离心管中，N2挥干溶媒。加入120μL(所含血浆的3倍量)复溶溶剂乙腈-水(1:4v/v)复溶，涡旋振荡2min，使溶解，离心(4℃，12000rpm，30min)，取上清，置于2mL进样小瓶中，进样10μL分析。

2.4UPLC-Q-TOF/MS分析

色谱分析：

负离子模式下的色谱条件：色谱柱为BEH C18柱(2.1×100mm)柱温：40℃进样10μL，流动相：A为高纯水(0.1％甲酸水溶液)，B溶剂为乙腈溶液，流速为0.4m L/min.梯度洗脱条件见表。

表1.色谱流动相梯度洗脱条件

质谱分析：

质谱为Waters公司Q-TOF串联四极杆飞行时间质谱仪配有电喷雾离子源(ESI).质谱采用负离子两种模式进行检测。负离子条件为：电喷雾气流量(脱溶剂气流量)600L/h、锥孔气流量50L/h、电喷雾气(脱溶剂气)温度350℃、离子源温度110℃、毛细管电压3000V、锥孔电压30V、扫描时间0.1S,扫描间隔0.02S。数据采集范围m/z 100～1000。

2.5数据预处理与多维统计分析

血样经色谱分离、质谱采集后生成原始质谱数据RAW文件，数据导入MarkerLynx(美国Waters公司)软件包，通过滤噪峰检测和峰匹配，生成包含保留时间、质荷比、峰面积的三维数据矩阵，运行得到Markerlist表格，将该矩阵表存成Excel文件。将Markerlynx软件处理结果导入SIMCA-P 12.0进行多元统计分析。

2.6潜在标志物的筛选

采用无监督分析方法，进行主成分(PCA)分析，查看各组之间的聚类效果，同时为了更有效的找出各组间差异，在对样本信息及分组已知的基础上采用正交信号校正结合偏最小二乘聚类分析方法(OSC-PLS-DA)对数据进行分析，从模型得到的变量权重值(Variable important in projection，VIP)中来选择贡献较大的差异变量，并结合T检验，获得显示保留时间、质荷比以及响应强度等信息的代谢物列表。然后使用Masslynx软件中的元素匹配(i-Fit)功能，对所筛选的化合物进行判别，推断其可能的化学式。综合考虑与实际化学式的质量偏差(用mDa或者ppm表示)、合理的双键数(DBE)以及i-FIT值来评判为该化学式可能性的大小，计算其可能的分子式。将分子式导入HMDB数据库、KEGG LIGAND数据库进行检索鉴定。最终得到与PCOS疾病相关的潜在生物标志物

2.7临床指标的筛查

临床激素与诊断指标，使用SPSS进行T检验，筛选出具有差异的特症指标，将差异指标结果导入SIMCA-P 12.0进行多元统计分析。

2.8特征指标聚焦

人工神经网络技术(ANN)通过预先提供的一批相互对应的输入-输出数据，分析掌握两者之间潜在的规律，最终根据这些规律，用新的输入数据来推算输出结果。在模糊逻辑系统中，基于输入与输出之间的规律，以多值逻辑为基础得出隐含在数据中的有用信息，找到对因变量有影响的自变量数据，其结果结合神经网络的学习能力和模糊逻辑的表达能力，使神经网络的模型由黑箱变灰箱，从而表达出其中的规律性。建立多样本的分类模型，以代谢标志物、临床指标、整合临床代谢指标为基础，利用模型聚焦样本，寻找潜在重点标志物。

2.9聚焦指标ROC分析

受试者工作特症曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)，其将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。将聚焦指标进行ROC分析，根据曲线下面积观察其对疾病识别能力强弱。

3结果与讨论

3.1代谢指纹谱的建立

在液相色谱条件优化方面，考察了流速、进样体积、柱温等对样品分离的影响，在质谱条件优化方面，考察了正、负离子模式，脱溶剂气流量，温度等因素。使用选定分析方法对99例血浆样本进行分离检测。典型的志愿者和PCOS患者血浆代谢指纹谱的基峰离子流如图1所示。

将来自PCOS患者和正常人的血浆样品进行混合作为质量控制标样，将质控样本按照选定方法进行分析，连续进样5次，随机选取代谢指纹谱中的10个峰进行方法学考察，统计其保留时间及峰强度值的变化，结果表明，本方法具有较好的精密度(峰面积的相对标准偏差(RSD小于10％)，满足研究的要求。

3.2代谢数据聚类分析结果

正交信号校正方法(OSC)可以滤掉与类别判断不相关(正交)的变量信息,只保留与类别判断有关的变量信息，从而使模式聚类分析可以集中在这些与类别的判别相关的变量上，提高了分型判别的准确性。采用OPLS-DA对PCOS和正常组的代谢组学数据进行模式识别(PCOS患者和正常组的代谢组学数据OPLS-DA分析结果见图1)。49例患者和50例正常人可以得到明显的区分，且患者组分为两个亚组，对于所建立的模型，其Q2为0.836(R2X＝0.21，R2Y＝0.95)，即其中21％的变量作为建立模型的主要成分，95％的样本符合模型判别，模型的预测能力达到83.6％，可见，研究中建立的模型能够很好地对数据进行拟合和预测。

从样本的代谢指纹谱聚类分析可知，因正常组和疾病组可以完全分开，说明了PCOS患者体内代谢过程发生异常，并且PCOS患者完全分离为两个亚组，说明同样是PCOS患者，其体内代谢变化也并不一致，预示可能有两种发病机制。PCOS患者组依据自身不同的代谢状态明显的分为两个亚组，命名为亚组一和亚组二，通过鉴定的34个潜在代谢标志物(见表2)。通过对34个潜在代谢标志物的生物信息学分析发现，亚组一激素代谢发挥主要作用，亚组二在激素代谢异常的同时，脂代谢也起到了重要作用。

表2鉴定的PCOS相关的34种体内潜在代谢标志物

在PCOS患者和正常组的代谢组学数据OPLS-DA分析图图1中，编号为N49、N50两例样本为PCOS疑似病例，后因其临床生化指标与正常值接近，最终确诊为正常样本，但通过代谢组学检测结果显示，N49、N50两例样本体内代谢状态已经发生变化，应属于PCOS患者或者疾病前期，预示代谢指标的变化比临床生化指标的变化更灵敏。

3.3潜在代谢标志物鉴定

OPLS-DA的荷载图(参见图2)，那些距离原点远的变量对各组的分类起到显著的作用。结合标志物在模型中的VIP值以及S-plot分析，结合质谱同位素匹配与数据库检索系统进行鉴定，最终确定了对于样品分类起决定性作用的34个特症代谢变量，并将其作为PCOS疾病导致人体代谢状态变化的潜在生物标志物，其中包括磷脂、脂肪酸、嘧啶、固醇类等小分子化合物。表中列举了这34种体内代谢产物在正常组与PCOS患者组的变化情况，这些代谢物两组相比均具有显著性差异(P<0.05)。

3.4临床指标

正常与患者各组重要临床生化指标(表3)，临床研究表明体质指数、腰臀比患者组均显著上升，说明患者体内的脂代谢异常从而导致体型较正常人偏胖。同时患者体内性激素、血脂分泌紊乱，且胰岛素、谷氨酸、炎症因子显著升高。这些指标的异常变化从侧面说明了多囊卵巢疾病的综合性会引发整个机体的代谢功能发生紊乱。

表3正常与患者各组重要临床生化指标

*表示与正常组相比，P＜0.05；△表示与亚组一相比，P＜0.05。

3.5潜在代谢标志物和临床指标的聚焦分析结果

聚焦采用的是模糊神经逻辑，将99例样本根据正患不同类型分为三部分，以潜在34个生物标志物(代谢标志物)、临床指标、整合临床代谢标志物(整合标志物)为基础，分别建立模糊神经网络模型(NeuroFuzzy logic model)。通过不断的训练，使模型达到过拟合的状态，即模型的R²值无限接近或大于1，通过这个模型寻找到对模型建立贡献最大变量，从而得到聚焦后的变量集合，具体信息见表4。

表4模糊神经逻辑聚焦的变量结果

将99个样本随机分成训练集(83个样本点)和测试集(16个样本点)，利用训练集数据的所有变量，使用人工神经软件，训练神经网络模型，利用测试集的数据对训练结果进行预测，经过参数调整后，最终得到真实值和预测值的拟合直线的R²值，即预测准确率。

利用训练集数据的聚焦变量，同样的方法建立并训练人工神经网络模型，利用测试集的数据进行预测，经过参数调整后，最终得到预测准确率，具体结果见表5。

表5人工神经网络对聚焦的变量分组预测结果

从结果来看，三组聚焦变量对各个分组的贡献度均大于80％，且各聚焦变量预测准确率与所有变量集预测准确率相当，说明各聚焦变量可以表征所有变量的含量信息。这些模型的预测准确率虽都未能达到100％，但聚焦整合标志物的结果已经达到95％以上，并且聚焦代谢标志物及整合标志物的诊断准确率均明显高于目前采用的临床指标的诊断准确率。

3.6ROC曲线分析

根据ANN分析的结果，聚焦得到5个临床指标、3个代谢标志物、5个整合标志物。在此基础上，进行ROC曲线分析，评价上述三种标志物组合用于PCOS诊断和疾病分型的准确率、特异性和灵敏度。

依据判别分析将各组聚焦变量整合为多因素方程，根据该方程所得三组因变量Y值，利用该Y值分别对正常组-患者亚组一、正常组-患者亚组二，两患者亚组进行ROC分析，聚焦临床指标、聚焦代谢标志物及聚焦整合标志物的分析结果分别见表6-表8。

表6聚焦临床指标ROC曲线分析结果

表7聚焦代谢标志物ROC曲线分析结果

表8聚焦整合标志物ROC曲线分析结果

在筛选测试中一般要求有高灵敏度以排除没有疾病的人；特异性(specificity)，或真阴性率，指示其在正确选择没有疾病的人中的能力。在诊断中一般要求有高特异性以获得较低的假阳性率。单用临床指标，其诊断亚组一和亚组二的诊断准确率只有62.1％；单用代谢指标各组之间的诊断准确率均能达到87.4％以上，已经具有比较好的疾病诊断和分型能力，3个潜在代谢标志物在各组的含量变化如图3所示；而结合3个聚焦代谢标志物和2临床指标：HDL-C与左卵泡数目，则对正常、亚组一和亚二的诊断准确率均能达到90％以上，可提高PCOS的诊断率，并达到病人的准确分型，为临床个体化治疗提供诊断依据。

3.7诊断阈值

由于左卵泡数目与HDL-C是临床常用诊断指标，已有比较成熟的诊断阈值，本研究发现的3个代谢标志物可以实现对PCOS的诊断和分型，结合HDL-C与左卵泡数目联合诊断可以提高PCOS的诊断准确率，并实现疾病的精准分型。

聚焦代谢标志物的诊断阈值：

应用含有3个代谢标志物的检测试剂的试剂盒检测时，对检测得到的3个代谢物的血清浓度建立诊断方程：Y＝0.408X₁+0.017X₂+0.011X₃-16.535，其中，X₁为血液中环磷酸鸟苷的测定浓度；X₂为血液中硫酸脱氢表雄酮的测定浓度；X₃为血液中棕榈鞘磷脂的测定浓度。将每个样本测定得到的环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮及棕榈鞘磷脂含量带入诊断方程，计算诊断因子Y值。当Y≤-5.20时，该样本可判定为正常样本；当-5.20<Y≤2.29时，该样本为PCOS患者样本，且可判定分型为亚组一(激素代谢异常为主)；当Y＞2.29时，该样本为PCOS患者样本，且可判定分型为亚组二(激素代谢异常伴有显著的脂代谢异常)。

聚焦整合标志物的诊断阈值：

应用含有3个代谢标志物的检测试剂及高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的试剂盒检测时，对检测得到的3个代谢物的血清浓度联合高密度脂蛋白胆固醇和左卵泡数目建立诊断方程：Y＝0.402X₁+0.009X₂+0.034X₃+15.775X₄+2.906X₅-42.597，其中，X₁为血液中环磷酸鸟苷的测定浓度；X₂为血液中硫酸脱氢表雄酮的测定浓度；X₃为血液中棕榈鞘磷脂的测定浓度；X₄为高密度脂蛋白胆固醇的浓度；X₅为左卵泡数目。将每个样本测定得到的环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮及棕榈鞘磷脂含量及高密度脂蛋白胆固醇的浓度、左卵泡数目带入诊断方程，计算诊断因子Y值。当Y≤11.34时，该样本判定为正常样本；当11.34<Y≤33.23时，该样本为PCOS患者样本，且判定分型为亚组一(激素代谢异常为主)；当Y＞33.23时，该样本为PCOS患者样本，且可判定分型为亚组二(激素代谢异常伴有显著的脂代谢异常)。

相比现有PCOS诊断的临床指标而言，本发明发现的三个代谢标志物环磷酸鸟苷、硫酸脱氢表雄酮和棕榈鞘磷脂联合诊断即可达到区分正常、PCOS亚组一和亚组二的效果。而结合HDL-C与左卵泡数目联合诊断，可提高其对正常、PCOS患者亚组一和亚组二的诊断准确率(均达到90％以上)。本发明为临床疾病诊断提供了准确有效的指标体系。

4结论

综上所述，本研究发现PCOS患者存在两种主要代谢异常：脂质代谢与激素代谢异常，可能的作用机制为患者体内高脂与高雄激素相互影响；并且亚组一激素代谢发挥主要作用，亚组二在激素代谢异常的同时，脂代谢也起到了重要作用。在此基础上通过人工神经网络和ROC曲线分析，得到了聚焦整合标志物体系：3个代谢物标志物结合两个临床指标，可用于PCOS的疾病诊断和两个亚组的分型，并且预测诊断率可达到90％以上。这也说明临床指标和代谢标志物各有优势，两者结合可以弥补各自的不足，达到更高的诊断效率，对疾病的发生和分型做出更精准的诊断

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。