基于双重扩增阻滞突变系统PCR检测PML‑RARA基因突变的引物、探针及应用

摘要

本发明公开了基于双重阻滞扩增突变系统PCR检测PML‑RARA融合基因点突变的方法及其引物和探针。本发明提供了一种检测白血病样本中PML‑RARA基因的A216V点突变的成套DNA分子，由PCR检测引物对、探针和阻断序列组成；所述PCR检测引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3；所述阻断序列的核苷酸序列为序列表中序列4。本发明提供的检测PML‑RARA基因A216V突变所用的引物、探针和检测方法，检测灵敏度高、特异性强。本发明能快速、准确的对急性早幼粒细胞白血病样本的PML‑RARA基因A216V突变进行检测，临床应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及基于双重阻滞扩增突变系统PCR检测PML-RARA融合基因点突变的方法及其引物和探针。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病是一种有特异性基因与染色体核型改变的一类急性髓系细胞白血病，FAB分类中属于M3亚型，是一种比较常见的成人急性髓系细胞白血病，约占成人急性髓系细胞白血病的10％-15％。而且，98％以上的急性早幼粒细胞白血病患者具有特征性的染色体核型异常t(15；17)(q22；q12)，造成15号染色体上的PML基因与17号染色体上的RARα发生断裂重排，形成PML-RARA融合基因。

PML-RARA融合基因是APL的典型分子特征和关键发病因素。其中，RARA是受维甲酸调控的核受体：在缺少维甲酸配体时，RARA与RXR受体形成二聚体抑制细胞分化相关基因的转录。PML是抑癌基因，通过形成PML核小体调控细胞凋亡和自我更新等功能。PML-RARA的致癌作用主要通过两方面实现，一方面通过募集RXR和HDAC等共抑制子，即使存在生理水平维甲酸配体，仍然可以抑制RARA调控的细胞分化基因的表达；另一方面通过与正常PML蛋白形成复合体，破坏PML核小体的形成，抑制细胞凋亡。因此，PML-RARA蛋白是APL治疗的关键分子靶点。

三氧化二砷通过直接靶向PML-RARA蛋白的PML结构域治疗急性早幼粒细胞白血病。三氧化二砷单药治疗急性早幼粒细胞白血病的治愈率达到70％以上，联合维甲酸、化疗可使APL的5年无病生存率达到90％以上。三氧化二砷通过靶向PML结构域降解PML-RARA蛋白，从而诱导APL细胞分化和凋亡。三氧化二砷可以直接和PML结构域的半胱氨酸结合，募集SUMO化依赖型泛素连接酶RNF4对PML-RARA进行多聚泛素化，随即通过蛋白酶体途径将其降解。

随着三氧化二砷临床应用的越来越广泛，发生三氧化二砷耐药的急性早幼粒细胞白血病逐渐增多。通过测序发现，耐药患者的PML蛋白部分的B2结构域存在耐药突变。急性早幼粒细胞白血病患者发生三氧化二砷耐药的PML-RARA基因突变后，缺乏有效的治疗药物，患者预后差、死亡率非常高，是临床治疗棘手的问题。在报道的三氧化二砷耐药点突变中，位于PML基因的A216V突变的耐药性最强、发生率最高，在95％以上。因此，在急性早幼粒细胞白血病患者中检测PML-RARA基因热点突变A216V具有重要的临床意义，是决定患者是否能够应用三氧化二砷治疗的关键条件。更早、更灵敏的检测出A216V突变，可判断患者的预后，并及时调整治疗方案。目前检测PML-RARA突变主要通过直接测序法，该方法检测灵敏度低，检测流程复杂繁琐，检测周期长。

扩增阻滞突变系统是基于PCR技术基础开发的用于检测点突变的技术。其原理是根据PCR扩增时使用的Taq DNA聚合酶缺少3’到5’外切酶活性，无法修复引物3’端碱基错配，因此引物3’端与模板1个及以上碱基不配对，就无法扩增特异性产物。因此，根据基因的突变序列设计引物，可以使突变型模板得到扩增，野生型模板无法扩增，从而放大了突变型信号，用于各种突变检测。

基于MGB探针的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、需要样本少，适用用微量样本的检测。目前利用扩增阻滞突变系统与MGB探针PCR结合进行检测突变，只是单一的在探针或引物上设计突变位点，无法完全消除对野生型模板的扩增，特异性较低。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测白血病样本中PML-RARA基因的A216V点突变的成套DNA分子。

本发明提供的成套DNA分子，由PCR检测引物对、探针和阻断序列组成；

所述PCR检测引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；

所述探针的核苷酸序列为序列表中序列3；

所述阻断序列的核苷酸序列为序列表中序列4。

上述成套DNA分子中，所述探针的5’端连接报告基团，且3’末端连接淬灭基团；

或，所述阻断序列3’末端磷酸化修饰；

或所述引物1、所述引物2、所述探针和所述阻断序列的摩尔比为3：3：2：2。

本发明另一个目的是提供一种检测白血病样本中PML-RARA基因的A216V点突变的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括上述的PCR检测引物对、探针和阻断序列；

上述PCR试剂还包括Taq酶预混液(ABI公司的Mix Premix试剂)和水；

上述PCR试剂由上述的PCR检测引物对、探针、阻断序列、Taq酶预混液和水组成。

所述PCR检测引物对中各条引物在所述PCR试剂中的终浓度为0.3μmol/L；

所述PCR检测引物对中探针在所述PCR试剂中的终浓度为0.2μmol/L；

所述PCR检测引物对中阻断序列在所述PCR试剂中的终浓度为0.2μmol/L。

本发明第三个目的是提供一种检测白血病样本中PML-RARA基因的A216V点突变的PCR试剂盒。

本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂。

上述试剂盒还包括记载如下检测方法1)或2)的载体：

方法1)、用上述的成套DNA分子对急性早幼粒细胞白血病样本进行实时荧光PCR，检测PCR扩增产物；

若所述PCR扩增产物有扩增曲线，则所述样本中含有或候选含有A216V突变的PML-RARA基因；若述PCR扩增产物没有扩增曲线，则所述样本中不含有或候选不含有A216V突变的PML-RARA基因；

方法2)包括如下步骤：(1)用上述的成套DNA分子对所述含有A216V突变的PML-RARA基因急性早幼粒细胞白血病样本和不同浓度的标准品均进行实时荧光PCR，得到样本PCR扩增产物的荧光强度和不同浓度的标准品PCR扩增产物的荧光强度；

(2)以所述不同浓度的标准品PCR扩增产物的荧光强度为纵坐标，所述标准品的不同浓度为横坐标制作标准曲线；

(3)将所述样本PCR扩增产物的荧光强度代入所述标准曲线中，计算得到所述样本中A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数；

所述标准品为表达具有A216V突变的PML-RARA基因的质粒；

或所述实时荧光PCR扩增的模板为cDNA；

或所述实时荧光PCR扩增的退火温度为61℃；

或所述样本为离体外周血；

或所述白血病为急性早幼粒细胞白血病或PML-RARA融合基因阳性的白血病。

上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测白血病样本中是否含有PML-RARA基因的A216V点突变中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测白血病样本中是否含有PML-RARA基因的A216V点突变产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测含有PML-RARA基因的A216V点突变白血病样本中具有A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测含有PML-RARA基因的A216V点突变白血病样本中具有A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第四个目的是提供一种检测急性早幼粒细胞白血病样本中是否含有PML-RARA基因的A216V点突变的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤:

用上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对急性早幼粒细胞白血病样本进行实时荧光PCR，检测PCR扩增产物；

若所述PCR扩增产物有扩增曲线，则所述样本中含有或候选含有A216V突变的PML-RARA基因；若述PCR扩增产物没有扩增曲线，则所述样本中不含有或候选不含有A216V突变的PML-RARA基因。

本发明第五个目的是提供一种检测含有A216V突变的PML-RARA基因急性早幼粒细胞白血病样本中A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤:

1)用上述的成套DNA分子或上述的PCR试剂或上述的试剂盒对所述含有A216V突变的PML-RARA基因急性早幼粒细胞白血病样本和不同浓度的标准品均进行实时荧光PCR，得到样本PCR扩增产物的荧光强度和不同浓度的标准品PCR扩增产物的荧光强度；

2)以所述不同浓度的标准品PCR扩增产物的荧光强度为纵坐标，所述标准品的不同浓度为横坐标制作标准曲线；

3)将所述样本PCR扩增产物的荧光强度代入所述标准曲线中，计算得到所述样本中A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数；

所述标准品为表达具有A216V突变的PML-RARA基因的质粒。

上述方法中，所述实时荧光PCR扩增的模板为cDNA；

或所述实时荧光PCR扩增的退火温度为61℃。

上述方法中，所述样本为离体外周血；

或所述白血病为急性早幼粒细胞白血病或PML-RARA融合基因阳性的白血病。

本发明提供了针对急性早幼粒细胞白血病样本PML-RARA基因A216V突变，进行实时荧光定量PCR检测的引物和MGB探针。本发明采用双重扩增突变系统PCR进行设计探针、引物，显著提高了检测基因点突变的特异性和灵敏度。本发明一方面在引物3’端根据突变序列设计引物；一方面根据突变序列设计MGB探针，该探针只与突变模板结合，不与野生型模板结合；而且在PCR体系中设计了针对野生型模板的阻断核酸序列，可与野生型模板结合，进一步提高对突变型模板的扩增特异性。

本发明的实验证明，本发明提供的检测PML-RARA基因A216V突变所用的引物、探针和检测方法，检测灵敏度高、特异性强。本发明能快速、准确的对急性早幼粒细胞白血病样本的PML-RARA基因A216V突变进行检测，临床应用前景广阔。

附图说明

图1为梯度稀释表达A216V点突变PML-RARA基因的质粒标准品进行荧光PCR的扩增曲线。

图2为检测野生型和A216V突变型早幼粒细胞白血病样本的扩增曲线。

图3为不同探针序列的筛选与扩增曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测PML-RARA基因A216V突变的引物和MGB探针及方法的建立

一、检测PML-RARA基因A216V突变的引物和MGB探针

本发明通过设计和筛选得到检测PML-RARA基因A216V突变的引物和MGB探针，其核苷酸序列如下表1所示：

表1为检测PML-RARA基因A216V突变的引物和MGB探针

其中，探针5’端连接报告基团FAM，3’端连接淬灭基团MGB。

其中，引物工作液浓度为7.5μmol/L，探针工作液浓度为5μmol/L。

二、检测PML-RARA基因A216V突变的方法建立

检测步骤如下：

(1)使用常规Trizol法提取肿瘤样本的RNA，使用商业试剂盒，按照说明书步骤进行提取；

(2)将提取的RNA反转录为cDNA,使用商业试剂盒，优选的使用ABI公司试剂盒，按照说明书步骤进行操作。

(3)标准品制备：

将具有A216V突变的PML-RARA基因(氨基酸序列为序列5，核苷酸序列为序列6)插入克隆表达载体T-Vector pMD19(购自大连宝生物公司)得到的质粒作为标准品。

根据提取质粒的OD值，计算质粒的拷贝数。将质粒梯度稀释成10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²拷贝/μL的浓度，在PCR反应时用来制作标准曲线，计算检测样本的拷贝数。

(4)实时荧光PCR反应体系(25μL)包括：Taq酶预混液12.5μL，样品cDNA2μL，上游引物1μL(终浓度0.3μmol/L)，下游引物1μL(终浓度0.3μmol/L)，探针1μL(终浓度0.2μmol/L)，阻断序列1μL(终浓度0.2μmol/L)，超纯水6.5μL。其中，所用试剂为本领域常规的PCR试剂，优选地，Taq酶预混液为ABI公司的Mix Premix试剂。

(5)实时荧光PCR反应条件为：预变性95℃10分钟，1个循环；95℃15秒，61℃1分钟，40个循环，在每个循环延伸结束时进行荧光信号检测。

(6)结果分析：

若实时荧光PCR反应产物有扩增曲线，则样本中含有或候选含有A216V突变的PML-RARA基因；若实时荧光PCR反应产物没有扩增曲线，则样本中不含有或候选不含有A216V突变的PML-RARA基因。

以不同浓度的标准品PCR扩增产物的荧光强度为纵坐标，标准品的不同浓度为横坐标制作标准曲线；将样本PCR扩增产物的荧光强度代入标准曲线中，计算得到样本中A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数。

实施例2、对产生耐药的急性早幼粒细胞白血病患者的外周血标本进行A216V突变检测

与实施例1的二的方法基本相同，具体如下：

1、待测样本cDNA的获得

提取产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者(患者知情，且已经鉴定含有A216V突变的PML-RARA基因)和不耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者(患者知情，且已经鉴定含有野生型PML-RARA基因)的外周血标本的的RNA，反转录得到cDNA；

(1)外周血标本要EDTA抗凝。在50ml离心管中加入25ml红细胞裂解液(含NH₄Cl1.44mmol/L，NH₄HCO₃>2HPO₄>2PO₄>7个细胞。1600转3分钟离心，弃上清液。加1mlTrizol，充分吹吸混匀，冻存至-80℃冰箱或直接提取RNA。

(2)RNA的提取：向加好Trizol的样本，加200μl氯仿，先颠倒混匀，再剧烈振荡混匀，静置3min，离心12000转，10min，4℃。吸上层水相400μl加至对应的新的1.5ml管中，再加入等体积异丙醇。颠倒混匀，静置10min，之后离心12000转，4℃离心10min。弃上清液，加1ml预冷75％乙醇，颠倒混匀，使RNA弹起，离心7500转，4℃离心10min。弃上清，晾干后，根据沉淀体积加DEPC水，溶解RNA。将RNA浓度控制在500ng/μl左右。

(3)反转录cDNA：RNA变性，每个PCR管加8μl DEPC水，2μl RNA。65度5min，冰上5min。配置2×反转录RT mix buffer(使用ABI反转录试剂盒)：DEPC水4.2μl，10×RTbuffer 2μl，25×dNTP 0.8μl，10×Random Primers 1μl，RNase inhibitor1μl，ReverseTranscriptase 1μl。取10μl配置好的2×RT mix buffer加入变性RNA管中，混匀。反转录条件：25℃，10min；37℃，90min；85℃，5min。

2、标准品制备：

利用全基因合成合成具有A216V突变的PML-RARA基因。

将具有A216V突变的PML-RARA基因(序列6)插入克隆表达载体T-Vector pMD19(购自大连宝生物公司)得到的质粒作为标准品。

根据提取质粒的OD值，计算质粒的拷贝数。将质粒梯度稀释成10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²拷贝/μL的浓度，在PCR反应时用来制作标准曲线，计算检测样本的拷贝数。

3、PCR反应

PCR反应体系(ABI公司的Mix Premix试剂)：Taq酶预混液12.5μL，样品cDNA或标准品质粒2μL，上游引物1μL(终浓度0.3μmol/L)，下游引物1μL(终浓度0.3μmol/L)，探针1μL(终浓度0.2μmol/L)，阻断序列1μL(终浓度0.2μmol/L)，超纯水6.5μL。

将配好的PCR反应体系加入96孔PCR板中，贴膜，封闭，离心混匀。

实时荧光PCR反应条件为：预变性95℃10分钟，1个循环；95℃15秒，61℃1分钟，40个循环，在每个循环延伸结束时进行荧光信号检测。

定性检测：若实时荧光PCR反应产物有扩增曲线，则样本中含有或候选含有A216V突变的PML-RARA基因；若实时荧光PCR反应产物没有扩增曲线，则样本中不含有或候选不含有A216V突变的PML-RARA基因。

定量检测：标准品的PCR扩增结果如图1所示。

标准曲线方程为Log10拷贝数＝(Ct值-39.136)/-3.394，根据标准曲线，计算样本中具有A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数。

产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者(PML-RARA基因A216V突变型样本)外周血和不耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本(PML-RARA基因A216V野生型样本)的扩增结果如图2所示，可以看出，产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血(PML-RARA基因A216V突变型样本)有扩增曲线，表明本发明方法证明产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血含有A216V突变的PML-RARA基因；不耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血(PML-RARA基因A216V野生型样本)没有扩增曲线，表明本发明方法证明不耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血不含有A216V突变的PML-RARA基因。

进一步根据扩增结果和标准曲线计算产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血(PML-RARA基因A216V突变型样本)中含有A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数，结果产生耐三氧化二砷的急性早幼粒细胞白血病患者外周血(PML-RARA基因A216V突变型样本)中含有A216V突变的PML-RARA基因的拷贝数为46520个。

实施例3、灵敏度检测

将上述构建的PML-RARA A216V质粒标准品用磷酸盐缓冲液进行10倍梯度稀释，得到质粒标准品稀释液(浓度分别为每微升含有10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰个拷贝的PML-RARA>

PCR反应体系和PCR反应条件同实施例1和2。根据标准曲线方程Log10拷贝数＝(Ct值-39.136)/-3.394，计算得到，计算得到检测A216V点突变PML-RARA基因的灵敏度至少为10个拷贝。

实施例4、探针序列筛选

针对PML-RARA A216V点突变设计多个探针序列，筛选可特异识别PML-RARA A216V点突变的探针序列。所设计探针序列包括序列3(实施例1的一)、序列7、序列8和序列9(表2)。

分别利用上述几种探针与实施例1中表1所示的上游引物、下游引物和阻断序列检测实施例2获得的PML-RARA野生型和A216V突变型急性早幼粒细胞白血病患者样本的cDNA。

检测方法、PCR反应体系和PCR反应条件同实施例2。

不同探针的扩增结果如图3所示，针对PML-RARA A216V突变患者的cDNA样本，序列3、序列7、序列8和序列9均有扩增曲线，但是序列3起峰最早，扩增效率最高；针对PML-RARA野生型患者的cDNA样本，序列7、序列8和序列9有扩增曲线，说明这3个序列针对突变型和野生型PML-RARA的选择性和特异性较差；而序列3针对PML-RARA野生型患者的cDNA样本没有扩增曲线，说明具有高选择性和特异性。

表2为探针序列筛选

探针序列探针1(序列表中序列3)5’-FAM-CTGCTCGTGCGTGC-MGB-3’探针2(序列表中序列7)5’-FAM-CGTGCTCCTTGACA-MGB-3’探针3(序列表中序列8)5’-FAM-TGCGTGCTCCTTGAC-MGB-3’探针4(序列表中序列9)5’-FAM-CTCGTGCGTGCTCCTT-MGB-3’

序列表

<110>徐州医科大学

<120>基于双重扩增阻滞突变系统PCR检测PML-RARA基因突变的引物、探针及应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ccctacgctg accagcatct ac 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tggctgctgt caaggagca 19

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ctgctcgtgc gtgc 14

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

gctgctcgtg cgtgctcctt gacag 25

<210> 5

<211> 96

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 5

Gln Trp Phe Leu Lys His Glu Ala Arg Pro Leu Ala Glu Leu Arg Asn

1 5 10 15

Gln Ser Val Arg Glu Phe Leu Asp Gly Thr Arg Lys Thr Asn Asn Ile

20 25 30

Phe Cys Ser Asn Pro Asn His Arg Thr Pro Thr Leu Thr Ser Ile Tyr

35 40 45

Cys Arg Gly Cys Ser Lys Pro Leu Cys Cys Ser Cys Val Leu Leu Asp

50 55 60

Ser Ser His Ser Glu Leu Lys Cys Asp Ile Ser Ala Glu Ile Gln Gln

65 70 75 80

Arg Gln Glu Glu Leu Asp Ala Met Thr Gln Ala Leu Gln Glu Gln Asp

85 90 95

<210> 6

<211> 288

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cagtggttcc tcaagcacga ggcccggccc ctagcagagc tgcgcaacca gtcggtgcgt 60

gagttcctgg acggcacccg caagaccaac aacatcttct gctccaaccc caaccaccgc 120

acccctacgc tgaccagcat ctactgccga ggatgttcca agccgctgtg ctgctcgtgc 180

gtgctccttg acagcagcca cagtgagctc aagtgcgaca tcagcgcaga gatccagcag 240

cgacaggagg agctggacgc catgacgcag gcgctgcagg agcaggat 288

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 7

cgtgctcctt gaca 14

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 8

tgcgtgctcc ttgac 15

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ctcgtgcgtg ctcctt 16