一种区分大白猪和中国地方猪品种的结构变异SV177及其检测技术

摘要

本发明公开了一种区分大白猪和中国地方猪品种的结构变异SV177，其特征在于：SV177位于猪参考基因组Sscrofa 10.2的chrX:100561156‑100562159，SV177缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为A。应用本发明所述的检测技术，检测样品的SV177基因型，发现大白猪三个基因型都有并以不缺失的A基因为主，地方猪种则没有杂合的基因型(DA)而且以缺失的D基因为主，可应用结构变异SV177作为分子标记区分大白猪和中国地方猪品种。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分大白猪和中国地方猪品种的结构变异及其检测技术。

技术背景

我国历代祖先均以选育纯种作为生猪品种的培育思路。由于地域环境气候的多样性、复杂性，不同地区的劳动人民坚持不懈地开展当地猪品种的选种配种，经历漫长的岁月，培育出适合当地环境、气候等自然条件的地方猪品种，形成了我国丰富多样的地方猪品种资源。例如贵州地区的香猪、柯乐猪、江口萝卜猪等猪品种，都是经过长期的人工选育形成的，具有性成熟早、耐粗饲、适应性强、肉质好等特点。然而随着我国人口的增长，养猪业发展转为集约化、规模化模式，为了追求经济利益，提高猪肉的产量，大型猪场长期、经常引进大白猪等欧洲猪品种，部分猪场用大白猪与地方猪品种进行杂交，得到的内二元杂交品系既有较快的生长速度又有较好的环境适应性，然而杂交导致的直接后果就是，地方猪种群中被掺入了大量的欧洲猪血统，地方猪品种的纯度呈快速下降趋势，我国大部分地方猪品种的优良基因被污染甚至丢失。

结构变异(SV)包括基因组水平的片段插入/缺失、重复、倒位和易位，是全基因组范围内的遗传变异，涉及的基因组区域较广泛。畜禽基因组学研究表明结构变异可直接影响表型。例如，鸡的SOX5基因的第一个内含子存在重复型变异引起豆状冠；牛的MIMT1基因中110Kb的片段缺失会导致牛流产和死胎。IL1RAPL2是白介素1受体辅助蛋白，属于白细胞介素受体1家族，在固有免疫和适应性免疫系统中具有重要的作用。IL1RAPL2基因编码的蛋白与IL1RAPL1编码的蛋白极其相近，二者共同定位于X染色体上与非特异X连锁MR(精神发育迟滞)相关的区域上。这两个X染色体连锁的基因享有共同的区域，相同的外显子-内含子结构，在中枢神经系统中特异性表达(贺波，2008年)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供结构变异SV177的检测技术，用于区分大白猪和中国地方猪品种。

本发明的技术方案是：一种区分大白猪和中国地方猪品种的结构变异SV177，位于猪参考基因组Sscrofa 10.2的chrX:100561156-100562159，结构变异SV177的三种基因型分别命名为AA、DA和DD型，其中AA为正常基因型、DD为纯合缺失的基因型、DA为杂合缺失的基因型。

本发明还提供用于检测猪品种结构变异SV177类型的一组引物，所述的引物分别为：上游引物F1：5’-GTAGCAGATTCCCTCAGCATCC-3’，下游引物R1：5’-CGGCTCTGATTTATGGGCTTG-3’，目的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

本发明还提供所述结构变异SV177基因型的检测技术。

该技术包括以下步骤：

(1)提取待测大白猪、香猪、柯乐猪、荣昌猪和江口萝卜猪这五种猪品的基因组DNA；

(2)以上述5个猪品种的基因组DNA为模板，分别利用引物F1、R1，进行PCR检测；

(3)1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断SV177的基因型。

步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，即：2×Taq PCR Master Mix 10μL，10μmol/L的引物F1、R1各0.3μL，ddH₂O>

本发明进一步提供所述结构变异在区分大白猪和中国地方猪品种中的检测技术。

前述的检测技术包括以下步骤：

(1)采用PCR技术检测结构变异SV177的基因型；

(2)应用SPSS v20.0进行卡方检验，分析大白猪和其它4个猪品种的SV177分布频率，进行差异显著性检验。

(3)根据结构变异SV177的基因型和等位基因频率区分大白猪和中国地方猪种。

本发明所述结构变异SV177可作为区分大白猪和中国地方猪品种的分子标记。

本发明的有益效果：(1)本发明提供的分子标记可不受猪的年龄、性别和饲养等因素的限制，可用于大白猪和中国地方猪品种的个体选择。

(2)本发明所选的检测地方猪种的结构变异SV177方法准确可靠，操作简便。

附图说明

图1为本发明实施例1中SV177基因型检测结果；A.1-4泳道为DD型；B.5-7泳道为AA型；C.8、9泳道为DA型；

图2为本发明实施例2中5个猪品种SV177的等位基因频率。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1区分猪品种的结构变异SV177的检测技术，步骤如下：

1、基因组DNA的提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

1)处理材料

提取材料为血液时，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。

提取材料为动物组织时(脾组织用量应少于10mg)打碎处理为细胞悬浮液，然后10，000rpm(11，200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

注意：去除RNA，可加入4μL RNaseA溶液，振荡15sec，室温放置5min。

2)提取血液基因组时，加入20μL蛋白酶K，混匀，即可继续进行下一步；提取组织基因组时，加入蛋白酶K并混匀后，于56.0℃水浴2-4h(每小时混匀样品2～3次)直至组织块完全溶解；

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70.0℃水浴10min，可见溶液变清亮；

4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；

5)将步骤4)所得的溶液和沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

8)重复操作步骤7)一次；

9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附柱中部悬空滴加50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min,12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；

12)基因组DNA放于4.0℃备用或-20.0℃保存。

2、目标序列的扩增

本发明中SV177位于chrX:100561156-100562159，参考NCBI Genbank收录的相应序列，使用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性引物，上游引物F1：5’-GTAGCAGATTCCCTCAGCATCC-3’，下游引物R1：5’-CGGCTCTGATTTATGGGCTTG-3’，组合进行PCR检测，目的片段长度为1986bp或982bp，测序后得出目标序列分别为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

PCR所使用的扩增体系为20μL，包括：2×Taq PCR Master Mix10μL，10μmol/L的上、下游引物取各取0.3μL，ddH₂O取8.4μL，10ng/μL基因组DNA取1μL。

进行PCR采用的反应条件：1)预变性：94.0℃5min；2)扩增反应：变性：94.0℃30sec，退火：56℃30sec，延伸：72.0℃45sec，35个循环；72.0℃10min；4℃保存。

3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断

PCR结束后，取4μL PCR产物经1.0％的琼脂糖电泳检测，0.5μg/mL溴乙锭染色，凝胶成像系统记录条带。

每个基因组，以引物F1、R1组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为1986bp，将基因型定义为AA型；若扩增两条带，一条带大小为1986bp而另一条带为982bp，则基因型定义为DA型；若扩增出单条带而且大小为982bp，将基因型定义为DD型(图1)。

实施例2结构变异SV177基因型的检测应用

按照实施例1所述的方法，以采自贵州从江县和清镇的香猪共299头、铜仁市江口县的江口萝卜猪41头、毕节市的柯乐猪34头和大白猪52头以及重庆市荣昌县的荣昌猪44头为试验材料，以chrX:100561156-100562159为候选SV177，利用PCR技术检测该SV177基因型在5个群体中的分布情况，应用SPSS v20.0软件中的卡方检验分析SV177基因型的差异关系。结果显示，(表1，图2)大白猪具有三个基因型，而其它四个地方猪种最多只有两个纯合基因型(AA、DD)，没有杂合基因型(DA)；大白猪和4个地方猪品种SV177基因型的分布频率之间的差异极显著(P<0.001)。

结构变异SV177位于基因的第一个内含子中，利用预测软件(http://www.gene-regulation.com/cgi-bin/pub/programs/match/bin/match.cgi)分析，得出SV177缺失片段1004bp中存在两个转录因子结合位点。

表1 SV177的基因型和基因频率

备注：P<0.01表示差异极显著。