表达高致病性禽流感H5N1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌

摘要

本发明涉及表达高致病性禽流感(AIV)HSN1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.)。经Western‑blot验证高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫可以刺激10日龄雏鸡机体产生有效的AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

说明书

一、技术领域

本发明涉及表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体包括：高致病性禽流感的血凝素HA蛋白表达性质粒pHT43的构建，高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的表达与鉴定以及重组枯草芽孢杆菌可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。

二、背景技术

1.高致病性禽流感(HPAIV)保护性抗原-血凝素(HA)

血凝素(HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一。HA在病毒吸附及病毒穿膜过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体。HA在感染过程中能否被水解为HA1和HA2两条肽链是病毒感染细胞的先决条件。近年的研究证明：HA参与病毒宿主谱的识别，在决定病毒宿主范围方面起重要作用；也是禽流感病毒抗原变异和病毒致病力的主要决定因素。HA由4个片段编码，是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构区域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。用免疫学和生物学方法研究证明，HA在细胞内质网合成，合成后由内质网运送到高尔基体，最后到达细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰，如将N-葡萄糖昔寡糖加到天门冬酞胺残基上。有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。这样形成的单体HA分布在内质网上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠形成一定的形伏，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时，还经过几个切割加工过程，包括N端信号肤的切除及HA1的产生。N端的信号肽大约有16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网，HA合成后信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链，产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基，这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为39KD和27KD，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。

HA是位于病毒囊膜表面的一种糖蛋自，可诱导机体产生中和抗体，为HPAIV中最为重要的保护性抗原。它不仅可诱导特异性抗体的产生，而且还可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染，因而它一向成为禽流感疫苗研究工作中的热点，并且在评价疫苗免疫效力时往往也是将HA抗体水平作为一项重要的参考指标。目前HA基因已成功地研制出多种类型的基因工程疫苗，并且它们在抵抗同一HA亚型的病毒攻击方面显示了良好的保护力。

2.枯草芽孢杆菌对黏膜免疫的影响

目前对黏膜抗原的细菌递送载体，尤其是能够入侵或者定植在黏膜上皮细胞的细菌，已有广泛研究。活细菌载体的种类很多，应用比较广泛的包括两类：一类为弱毒病原体能够诱导强而持久的免疫应答，如沙门氏菌和李斯特菌，但这些减毒细菌做为载体传递疫苗存在潜在的危险性，甚至是致病性。另一类是目前较为关注的安全无致病性的共生物种，如乳球菌、乳杆菌和枯草芽孢杆菌等益生菌。枯草芽孢杆菌作为一种安全的无致病性活细菌载体，是广泛存在于土壤和植物中的优势生物种群，隶属于芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，其细胞呈直杆状，大小(0.8～1.2)μm×(1.5～4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，无荚膜，能运动。枯草杆菌作为抗原的载体具有很多优点：①是人类和动物安全纪录的益生菌和食品添加剂，②成本低廉、耐热、抗干燥、便于运输和使用，③其遗传性状和细菌学水平都很容易操纵。因此，枯草芽孢杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原递送载体。同时枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的空间。

3.口服黏膜免疫研究进展

口服黏膜免疫方法简便、安全，不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性体液免疫应答，多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用，使全球小儿麻痹发病得到有效控制，为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中，口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解，疫苗很容易被破坏，影响免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗递送系统成为研究传染病防御领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向，所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中，让其表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答，又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答，使机体可以获得全面的保护力。

以前的研究表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等。国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。沙门氏菌为载体传递DNA疫苗还能存在潜在危险性。首先，减毒细菌可能存在毒力返强的危险；其次，质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组，从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。此外，减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病性。因此，选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键。理想的输送抗原的载体应该是能够在体内较长时间存在，本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物。

随着以益生菌为活载体传递抗原，刺激肠道黏膜免疫这一技术路线的提出，本发明试图在益生菌枯草芽孢杆菌中表达高致病性禽流感血凝素HA蛋白进行活菌的口服免疫。对研制高致病性禽流感口服疫苗，为预防高致病性禽流感开辟一条全新的黏膜免疫途径具有重要的意义。

三、发明内容

技术问题

本发明成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组型枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43-HA，并转化进入枯草芽孢杆菌WB800N。高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800N内可以被成功表达，并通过口服免疫可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

技术方案

本发明涉及表达高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌(B.S.-HA)，该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。检测10日龄雏鸡口服免疫该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株机体产生的黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。

1表达载体质粒构建方法：

1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：

P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCG

P2：GCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGC

以pMD19-HA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增HA蛋白基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min。将PCR产物用T4连接酶连接到pMD19-T载体上，构建的载体分别命名为T-HA。测序后获得具有高致病性禽流感的血凝素HA的DNA序列。

1.2重组表达载体pHT43-HA的构建

将T-HA质粒利用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI进行酶切得到高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因并用T4连接酶克隆至载体pHT43上，获得表达载体pHT43-HA。

1.3重组表达载体pHT43-HA的验证

采用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI，用双酶切验证重组表达载体pHT43-HA。如图2可知：1为表达载体pHT43-HA经BamHI、SmaI酶切得到1600bp高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因。

2重组质粒的转化方法：

将构建的表达质粒pHT43-HA采用电击转化的方法，取60μL枯草芽孢杆菌WB800电转化感受态细胞与1μL(50ng/μL)表达载体pHT43-HA质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击，电击条件：22KV/cm，25μF，200Ω，电击一次。加入1mL电击恢复液，37℃100rpm孵育3h，涂布于氯霉素抗性固体基础培养基LB平板，14-18h可见阳性菌落。将重组枯草芽孢杆菌WB800N，进行PCR和Westem-blot验证。

3检测雏鸡口服免疫该重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)机体产生的黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平：

3.1正常枯草芽孢杆菌WB800N菌株(遗传物质中未含有外源基因)(B.S.)和表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)分别口服免疫10日龄SPF雏鸡(口服剂量为1×10¹⁰cfu/kg)，并设立口服PBS组为空白对照以及口服灭活H5N1病毒(IAIV)为阳性对照组，每组20只。首免一周后按相同剂量进行二免。二免后三天每组随机选取5只雏鸡进行宰杀取气管和小肠组织。每周对每组雏鸡进行血清的采集。3、5、7周分别每组随机选取5只雏鸡进行宰杀取肠道、肠道涮洗液、气管涮洗液。饲养周期共7周。

3.2采用荧光定量PCR的方法对二免后三天的雏鸡肠道和气管中Toll-like受体(TLR)的mRNA表达情况进行检测，检测方法为：首先进行肠道和气管RNA的提取，组织研磨后放入Trizol中，并进行Trizol法RNA提取。对提取的RNA使用反转录试剂盒进行反转录成cDNA，然后进行荧光定量PCR检测TLR2、TLR4、TLR5mRNA表达水平。结果发现表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)可以上调雏鸡肠道和气管中TLR2、TLR4、TLR5mRNA表达水平。

3.3采用ELISA的方法对二免后三天的雏鸡肠道和气管中细胞因子蛋白表达情况进行检测，检测方法为：首先进行肠道和气管蛋白的提取和定量。组织研磨后用RIPA细胞裂解液裂解组织细胞，冰浴30min，离心取上层液体于-70℃保存。BCA法进行蛋白浓度的测量并稀释为统一浓度，然后分别应用IL-12、IL-10、IFN-γ的ELISA试剂盒检测细胞因子的表达量。结果发现表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)可以上调雏鸡肠道和气管中IL-10、IL-12、IFN-γ的表达水平。

3.4采用间接ELISA的方法进行血清中AIV特异性IgG和肠道、气管涮洗液中特异性SIgA水平变化检测，检测方法为：H5N1病毒包被过夜，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭2h，洗涤后加待检样品37℃作用1h，洗涤加适当稀释后的辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgG或IgA抗体，37℃1h，含四甲基联苯胺和H₂O₂的TMB显色液显色后酶标仪检测OD450。结果发现表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)可以刺激10日龄雏鸡机体产生有效的AIV特异性IgG和SIgA免疫应答水平。

3.6采用血凝抑制(HI)的方法检测血清中AIV中和抗体的效价，检测方法为：采用微量法在96孔V型微量反应板上，首先进行标准抗原凝集鸡1％红细胞试验，确定4个血凝单位抗原。然后常规方法检测所采免疫雏鸡血清样品的HI滴度。判断结果时，将微量反应板倾斜45度，96孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集完全抑制，以能完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释度作为HI滴度。结果发现表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.-HA)可以刺激10日龄雏鸡机体产生有效的AIV特异性血凝效价。

有益效果

1本试验构建的表达质粒pHT43-HA是目前国内外第一个高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌表达质粒。

2本发明成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组型枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43-HA，并转化进入枯草芽孢杆菌WB800N。经Western-blot验证高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800N内可以被成功表达。并通过口服免疫可以促进10日龄雏鸡机体黏膜免疫以及AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

3本发明构建了枯草芽孢杆菌递送表达系统，可插入各种抗原、活性肽和药物等，有利于开发各种重组枯草芽孢杆菌疫苗，为枯草芽孢杆菌在动物黏膜免疫以及口服基因工程活疫苗等方面的研究奠定基础。下面结合附图及具体实施技术对本发明做进一步说明。

四、附图说明：

图1：血凝素片段HA的PCR扩增结果凝胶电泳图

图2：构建的表达载体质粒pHT43-HA示意图

图3：表达载体质粒pHT43-HA酶切验证电泳图

图4：重组枯草芽孢杆菌WB800N质粒PCR验证电泳图

图5：重组枯草芽孢杆菌WB800N表达产物Western-blot图(免疫印迹图)

图6：重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡肠道和气管中TLR mRNA表达水平的影响图

图7：重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡肠道和气管中细胞因子表达水平的影响图

图8：重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡血清中AIV特异性IgG水平变化的影响图

图9：重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡气管涮洗液中AIV特异性SIgA水平变化的影响图

图10：重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡血清中AIV特异性抗体血凝抑制的变化影响图

五、具体实施方式

1表达质粒pHT43-HA的构建

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

枯草芽孢杆菌WB800N菌株由南京农业大学植物保护学院高学文惠赠；

pMD19-HA质粒由江苏省农科院兽医所王志胜惠赠；

高致病性禽流感H5N1毒株由青岛天邦生物有限公司范根成惠赠；

E.coli JM109菌株、质粒pMD19-T购自Takara；质粒pHT43购自LifeTechnologies；

试剂：Q5高保真酶购自NEB公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，限制性内切酶，T4连接酶、Trizol、RNA反转录试剂盒、荧光定量试剂盒等均购自Takara公司；氯霉素，氨苄青霉素，细菌质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgG和IgA抗体购自BETHYL公司；含四甲基联苯胺和H₂O₂的TMB显色液、组织RNA提取试剂盒、RIPI蛋白裂解液、溶菌酶等均购自TIANGEN公司；鸡源IL-12、IL-10、IFN-γELISA试剂盒均购自BD公司。

1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：

P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCG

P2：GCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGC

以上引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成；

以pMD19-HA质粒为模板，分别用合成的P1、P2引物常规PCR克隆高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min。如图1可知：1为PCR成功克隆1600bp的HA。切取目的条带，经DNA纯化试剂盒回收后，用T4连接酶连接到pMD19-T载体上，构建的载体分别命名为T-HA，经菌落PCR及酶切验证后测序。所获得的序列经BLAST及DNAstar与GenBank上已发表的序列比对。所克隆的高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因序列与已经在GenBank上发表的序列的同源性为100％。

1.2重组表达载体pHT43-HA的构建

如图2可知：将T-HA质粒利用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI进行酶切得到高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因并用T4连接酶克隆至载体pHT43上，获得表达载体pHT43-HA。

1.3重组表达载体pHT43-HA的验证

采用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI，用双酶切验证重组表达载体pHT43-HA。如图3可知：1为表达载体pHT43-HA经BamHI、SmaI酶切得到1600bp高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因。

2重组高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因枯草芽孢杆菌WB800N的验证

将构建的表达质粒pHT43-HA采用电击转化的方法，取60μL枯草芽孢杆菌WB800N电转化感受态细胞与1μL(50ng/μL)表达载体pHT43-HA质粒混合加入电击杯中冰浴5min后进行电击(型号：BTX ECM630)，电击条件：22KV/cm，25μF，200Ω，电击一次。加入1mL电击恢复液，37℃孵育3h，氯霉素抗性固体基础培养基LB平板筛选电击恢复液，14-18h可见阳性菌落，培养阳性菌落并提取基因组，经PCR验证，重组高致病性禽流感血凝素HA蛋白枯草芽孢杆菌WB800N内均含有高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因(1600bp)。如图4可知：1、2、3、4均为含有高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的阳性重组高致病性禽流感血凝素HA蛋白枯草芽孢杆菌WB800菌株基因组。

3重组高致病性禽流感血凝素HA蛋白枯草芽孢杆菌WB800N的Western-blot分析

对重组枯草芽孢杆菌WB800N溶菌酶处理，对表达产物进行Western-blot分析，结果与H5N1血凝素多克隆抗体呈现阳性反应，如图5可知：3、4、5、6为重组枯草芽孢杆菌WB800N与1、2为枯草芽孢杆菌WB800N(基因组中未整合外源基因)相比，在63kD处有一条明显的蛋白印迹带，且无非特异性条带出现，证明高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌WB800N内可以被成功表达。

4雏鸡口服免疫重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)机体免疫应答水平的检测

4.1正常枯草芽孢杆菌WB800N菌株(遗传物质中未含有外源基因)和表达高致病性禽流感的血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株分别口服免疫10日龄SPF雏鸡(口服剂量为1×10¹⁰cfu/kg)，并设立口服PBS组为空白对照以及口服灭活H5N1病毒(IAIV)为阳性对照组，每组20只。首免一周后按相同剂量进行二免。二免后三天每组随机选取5只雏鸡进行宰杀取气管和小肠组织。每周对每组雏鸡进行血清的采集。3、5、7周分别每组随机选取5只雏鸡进行宰杀取肠道涮洗液、气管涮洗液。饲养周期共7周。

4.2重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡肠道和气管中TLR mRNA表达水平的影响

采用荧光定量PCR的方法对二免后三天的雏鸡肠道和气管中Toil-like受体(TLR)的mRNA表达情况进行检测，检测方法为：首先研钵研磨肠道和气管组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状放入Trizol中；然后涡旋混匀，室温静置5min。12000g 4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。向匀浆液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖振荡15s，待溶液充分乳化后，在室温静置5分钟。12000g 4℃离心15min；吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min。12000g 4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。小心丢弃上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1mL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5min，加入加入适量的RNAase-Free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃。用微量紫外分光光度计Nanodrop ND-1000UV测定RNA浓度，用超纯水调整RNA浓度为1μg/μL。RNA反转录采用20μL体系：1μg总RNA，1μLOligo dT mixture，RNase Free dH2O至体积10μL于64℃作用5min立即降到4℃接着将mixtureII(4μL 5×PrimeScript buffer，0.5μL RNase inhibitor，0.5μL PrimeScriptRT Enzyme，5μL RNase Free dH2O，总体积10μL)加入到以上体系中，37℃50min，70℃15min一个循环进行反转录反应。对提取的RNA反转录成cDNA后进行荧光定量PCR检测TLR2、TLR4、TLR5mRNA表达水平。定量引物为：

β-actin F：ATGAAGCCCAGAGAGCAAAAGA

β-actin R：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

TLR2 F：GATTGTGGACAACATCATTGACTC

TLR2 R：AACGCTGCTTTCAAGTTTTCCC

TLR4 F：TGACCTACCCATCGGACACT

TLR4 R：CTCAGGGCATCAAGGTCTCC

TLR5 F：TGCAACCTCACAGGTGTTCC

TLR5 R：GAACCCCAGGTCCAAGACAC

以上引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成；

荧光定量PCR的反应体系和程序为：SYBR green PCR扩增反应用20μL体系：2×SYBR Green，0.4μL ROX，0.4μL上下游引物，2μL DNA(20ng/μl)模板，加上无菌超纯水至体积20μL，空白对照以同体积水代替DNA模板，反应于ABI 7500进行，反应程序用两步法：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s执行40个循环。

如图6可知：肠道组织中与其他组相比重组枯草芽孢杆菌WB800N免疫后能极显著的增强TLR2和TLR5mRNA的表达(P＜0.01)；在气管组织中与空白组相比重组枯草芽孢杆菌WB800N免疫后能极显著的增强TLR2、TLR4mRNA的表达(P＜0.01)，显著的增强TLR5mRNA的表达(P＜0.05)。

4.3重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡肠道和气管中细胞因子表达水平的影响

采用ELISA的方法对二免后三天的雏鸡肠道和气管中细胞因子蛋白表达情况进行检测，检测方法为：首先研钵研磨肠道和气管组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状放入RIPA细胞裂解中；然后涡旋混匀，冰浴30min。12000g 4℃离心5min；小心吸取上清液，移入新的离心管中于-70℃保存。BCA法进行蛋白浓度的测量并稀释为统一浓度，然后分别应用IL-12、IL-10、IFN-γ的ELISA试剂盒检测细胞因子的表达量。如图7可知：在小肠组织中与空白组相比重组枯草芽孢杆菌WB800N免疫后能极显著的增强IL-12和IFN-γ的表达(P＜0.01)，显著的增强IL-10的表达(P＜0.05)；在气管组织中与空白组相比重组枯草芽孢杆菌WB800N免疫后能极显著的增强IL-12、IL-10的表达(P＜0.01)，显著的增强IFN-γ的表达(P＜0.05)。

4.4重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡血清中AIV特异性IgG和肠道、气管涮洗液中特异性SIgA水平的影响

采用间接ELISA的方法进行血清中AIV特异性IgG和气管涮洗液中特异性SIgA水平变化检测，检测方法为：H5N1病毒包被过夜，PBST洗涤3次每次5min，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭2h，PBST洗涤3次每次5min，加待检样品37℃作用1h，PBST洗涤3次每次5min，加适当稀释后的辣根过氧化物酶标兔抗鸡IgG或IgA抗体，37℃1h，PBST洗涤3次每次5min，加入含四甲基联苯胺和H₂O₂的TMB显色液显色，加入终止液并且酶标仪读取OD450数值。最终数据用S/N法进行计算后统计。如图8可知：口服免疫重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)，首免2周后，血清中AIV特异性抗体显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01或P＜0.05)，此后时间内抗体水平维持稳定直至第6周随后开始出现下降。图9可知：口服重组枯草芽孢杆菌WB800N组(B.S.-HA)组，首免后第3周气管中特异性IgA抗体水平均显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01)，第5周的时候有所下降但仍显著高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01)，随后降至较低水平。

在试验过程中，由于肠道涮洗液的杂质过多颜色较重，严重影响的检测的准确，所以放弃对肠道涮洗液中特异性SIgA的检测。

4.5重组枯草芽孢杆菌WB800N(B.S.-HA)对雏鸡血清中AIV特异性抗体血凝抑制水平的影响

采用血凝抑制(HI)的方法检测血清中AIV中和抗体的效价，检测方法为：采用微量法在96孔V型微量反应板上，首先进行标准抗原凝集鸡1％红细胞试验，确定4个血凝单位抗原。然后常规方法检测所采免疫雏鸡血清样品的HI滴度。判断结果时，将微量反应板倾斜45度，96孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒的为凝集完全抑制，以能完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释度作为HI滴度。图10可知：与其他组相比口服免疫重组枯草芽孢杆菌WB800N组产生了较高的HI效价，在5周达到最高。

5数据分析

采用SPSS 17.0软件的单因素ANOVA方差试验结果，并对试验数据进行统计分析，统计结果以平均数±标准误(Mean±SE)表示误差。差异显著性判断标准为：P＜0.05，差异显著(*)；P＜0.01，差异极显著(**)。

应用

本发明涉及表达高致病性禽流感血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌WB800N菌株，有望成为一种高致病性禽流感口服枯草芽孢杆菌基因工程疫苗；同时为开展枯草芽孢杆菌黏膜免疫递送活载体的研究提供了技术方案。