OsFTL12基因在控制水稻生殖生长转变及株型建成方面的应用

摘要

本发明涉及OsFTL12基因在控制水稻由营养生长向生殖生长转变上的应用，其特征在于OsFTL12基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1,OsFTL12所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2。同时本发明更进一步公开了水稻反成花素基因OsFTL12核苷酸序列在控制株型建成方面的应用。本发明的结果发现过量表达OsFTL12导致水稻由营养生长向生殖生长转变延迟，并伴随株高变矮，表明OsFTL12抑制了水稻由营养生长向生殖生长转变，具有反成花素的作用。本发明对于全面揭示植物的成花转变研究有重要的科学研究价值。同时对水稻育种及产量提高具有重要意义及应用前景。

说明书

本研究得到天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目（No. 16JCZDJC33400）及天津市中青年骨干教师创新培养计划（No. ZX110GG017）的资助。

技术领域

本发明属于水稻整体生长发育情况改进的技术领域，涉及水稻反成花素基因OsFTL12核苷酸序列在控制水稻由营养生长向生殖生长转变及株型建成方面的应用，对水稻育种及产量提高具有重要意义及应用前景。

背景技术

水稻由营养生长向生殖生长转变对水稻的抽穗至关重要，对水稻产量有重要影响；水稻过早抽穗使水稻营养生长受限，制约了水稻产量的提高；而过晚抽穗会大大影响水稻的正常生育期，甚至在北方高纬度长日照地区水稻不能正常抽穗使水稻绝产。尤其在籼粳杂交水稻生产和育种中，常常受到籼粳杂种超亲晚熟问题的制约。水稻抽穗不但对营养生长和生殖生长至关重要，而且可以影响库－源平衡关系，从而影响水稻的产量。水稻由营养生长向生殖生长转变受成花素（Florigen）及反成花素（Anti-florigen）的控制，二者的平衡可以调节水稻抽穗的早晚，进而影响水稻的发育进程及产量构成因素，从而影响水稻的产量及其它性状。近年来水稻的成花素基因已成功克隆，并揭示了其精确功能，然而水稻反成花素基因及其功能还不清楚。因此揭示水稻反成花素基因并研究其精确功能及调控机理，探索其与成花素之间的关系及相互作用机制，解析成花素及反成花素的分子调控网络，对于全面揭示植物的开花机理研究有重要的科学研究价值。同时对水稻育种及产量提高具有重要意义及应用前景。本研究揭示了一个水稻反成花素基因OsFTL12在水稻由营养生长向生殖生长转变及株型建成中的功能，结果发现过量表达OsFTL12导致水稻由营养生长向生殖生长转变延迟，并伴随株高变矮，表明OsFTL12抑制了水稻由营养生长向生殖生长转变，具有反成花素的作用。发明内容

本发明公开了水稻反成花素基因OsFTL12核苷酸序列，其特征在于OsFTL12基因的核苷酸序列为SEQ>>所编码的氨基酸序列为SEQ>

本发明进一步公开了水稻反成花素基因OsFTL12核苷酸序列在控制水稻由营养生长向生殖生长转变方面的应用。以及水稻反成花素基因OsFTL12核苷酸序列在控制株型建成方面的应用。

本发明公开的OsFTL12的基因序列如下：

ATGGCAAATGACTCATTGACAAGGAGCCATATAGTTGGAGATGTGTTAGACCAATTTTCAAACTCAGTGCCTCTAACTGTGATGTATGATGGGAGGCCTGTGTTTAATGGCAAGGAGTTCCGTTCCTCGGCAGTCTCGATGAAACCTAGAGTTGAGATTGGTGGCGATGATTTTCGATTTGCCTATACCCTAGTAAGCCCATTAAATTAATTACTTCATACCCGATCCAAAAGAGTCATATTGATAGATGCATGGGTAGGCCATGCATATATATACATTGTCCATGGTGTTGGCAATGCACTTTTTCTCTTAATCTTAGGAGCTCTTGAGGTTGGACAGACCAAGAAAACAACAGCTTCACTAGCCATGATAAACCTTGGCCTAGCTCTTGTTGCAATGTGTTTGCCTCAACTAGATGGTGCTCTCTGCCAGCTGGTTAAGCTAATTGAGCAATATTACTAACCTAAATTAATTAGGCATTTTCAGCCCAGACCAAAAAAATACTCAGGTTTATTTTAATCCCTTTCATGTTGACCATGTGTTTGTGTGAATTGTTAATAAAAATTAGGTTATGGTGGATCCTGATGCTCCTAATCCCAGCAACCCAACCTTGAGGGAATACCTGCACTGGTAAGCTATGCTCTTGCAATTGTTGTGATTTCTATCATATGTCTCACATTGATTAGTGATCTAACTACCTACTTTTCAATATGACAGGATGGTGACTGATATCCCATCATCGACGGACGATAGCTTTGGTGAGTATATTCATATTGTATCCAGGGTCTCAAGCATACACAACTACTCTGCTGCATTAGCTTTTACTTGCTGTCTTCAAATGCTTGTCACTAGCTAGCAAATACTGATCATCGATCCTTCAACTTTGATTACTTTTTTTAAAAAAAAGTATAAATACTTAAAAATATTTCATATTAACAAAGTATACATCCTAATTAAATGCATATAGTCATGAAACTTTTGTGCATCATGATCCAACAATGAAAAAAAAATTGATGTCCAAAGTTAAAATTCATTGGTTTCAAATAATGAACAGTTATATATTTGAAACCCGAGGGAGTCACAATATTGGAGTGTTCCTTCATATGGCCAGTACAAGTTTGGAAAATGGTTAAGTTGATAGATAATTAAGTAGGTATGTTTAACCAAAATGTTGCATGCTTGGTGTGATTGATTTAAAATTCATACATCACAAATCCGGTTTCTTTTGTGCTGGTCCAAAATTCAGAAATATCAAGTAGGAGTATATGATTGTAACTTTTGTTGTTATATTTGGAAAAAAAATTGCAGTACAACTACAAAGTAGATCTAATTAAGCCAGTTACTCGCAAGGTGCATTTCTATTGATATTGAAATAGTGCAAAATTGTTCTACAAAACTGCTGTCTGTAAAATTTCAACTACAGGTTCAATTCGTCTCAATGACTCCAAAATAAAATTCTTGCAAACAGTAGGATCGAAGAAAAATAAAATAAAAACTTGCTAGACACAACAAATCTTATTCTCTCCCTTCTTTTCACACTTGATGTCAAATAAGTTGGACGTAAAATCTTACAGAATTATTTTTCTCCTCAAACTAGCTTGGTTCATATTTTTAAAAAAGAACATGATTTATAGCACCGTTCAACATAAATATGGTATTTAGTTGTATTCCCCCCTTATACCATACTAAGTTCGAATTAATAATCTGAACATGAATAAAAACAGTAGAAATATATACTATGTTGCATCTCTGCATATGGTATAGCACATACACCGGCGGATCCACCGCCCAGCGACCCGATCGAGCAGTCACCCGGGCTTATCGGTGGAAGATCCTTTTGAAATTCTATGCAATTTAACAAATTGAAATTGAACATTATAAGCAAATGTTAGCTATAATTAAGTATGTCCAAGGCTTTAAAATTTTACTGAGCACATATCATATATAAATTAAATTAATGCAGGGCGGGAGATCGTAACATACGAAAGCCCAAGCCCCACCATGGGCATCCACCGCATCGTGATGGTGTTGTATCAGCAGCTTGGGCGCGGCACGGTGTTCGCGCCGCAGGTGCGTCAGAACTTCAACCTGCGCAGCTTCGCGCGCCGTTTCAACCTCGGCAAGCCGGTGGCCGCCATGTACTTCAACTGCCAGCGCCCGACAGGCACAGGTGGGAGGAGGCCAACCTGA

OsFTL12所编码的氨基酸序列为：

MANDSLTRSHIVGDVLDQFSNSVPLTVMYDGRPVFNGKEFRSSAVSMKPRVEIGGDDFRFAYTLVMVDPDAPNPSNPTLREYLHWMVTDIPSSTDDSFGREIVTYESPSPTMGIHRIVMVLYQQLGRGTVFAPQVRQNFNLRSFARRFNLGKPVAAMYFNCQRPTGTGGRRPT*

附图说明：

图1为：OsFTL12转基因植株的表型分析图；其中注：>

图2为OsFTL12基因的表达模式分析图；其中注：A：转基因分化瓶中的幼苗；B：幼嫩的叶鞘；C：第二节间的茎；D：茎顶端分生组织；E：成熟的叶片；F：0.9cm的幼穗；G：2cm的幼穗；H：7cm的幼穗；I：14.5cm的穗；J、K：23cm的穗；L：幼嫩的愈伤组织；M：幼根；N：叶耳；O：带有叶耳的成熟叶鞘；>OsFTL12在水稻不同组织器官中的实时定量PCR分析，根是30天幼苗的根，分蘖时期叶、叶鞘，茎为第一节间的茎；T，U：OsFTL12>OsFTL12>

图3为OsFTL12基因的亚细胞定位图；其中注：A-C, pCAMBIA35S::GFP空载体在烟草表皮细胞中的瞬时表达；D-F: pCAMBIA35S::GFP-OsFTL12重组载体在烟草表皮细胞中瞬时表达；标尺为20μm。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

1.材料与方法

1.1 材料

本研究以水稻品种中花11（水稻公开常规品种）为实验材料，转基因材料通过农杆菌介导的遗传转化方法获得（Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficienttransformation of rice (Oryza>L.) mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6(2): 271-282），所有材料种植于天津师范大学试验田和海南陵水南繁基地。

1.2 过表达载体构建及水稻遗传转化

总RNA从40天大小的水稻叶片中提取，反转录后，以cDNA为模板扩增OsFTL12的全长ORF，将扩增的片段酶切回收后，连入过量表达空载体中，获得重组载体，通过酶切鉴定及测序确认后转入农杆菌中，用农杆菌介导的遗传转化法导入野生型中花11中，获得过表达转基因植株。PCR扩增条件为：1>

1.3 OsFTL12的表达模式分析

提取野生型中花11在不同器官组织的总RNA，分别为幼嫩的分生组织，根、茎、叶、成熟的叶鞘、不同时期的穗；同一时期不同叶片（还未完全展开的叶片、倒二叶、倒三叶和倒四叶），总RNA用TRIzol(Invitrogen, USA)试剂提取后用DNase I (Invitrogen, USA)处理消化基因组DNA。1µg的总 RNA用M-MLV 反转录酶 (Vazyme, Nanjing, China)反转录合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，用OsFTL12特异性引物进行实时定量PCR分析，Real-time>OsActin1作为内参相对分析。

1.4 OsFTL12在过表达转基因植株中的表达分析

总RNA从60天转基因植株及其对照的叶片中提取后用DNase I (Invitrogen, USA)处理消化基因组DNA。1 µg的总 RNA用M-MLV 反转录酶 (Vazyme, Nanjing, China)反转录合成cDNA。所用引物序列及扩增程序同1．3所用的序列。每个反应进行3次重复，并用水稻OsActin1作为内参相对分析。反应体系及反应条件同上1．3中所述。

1.5 OsFTL12亚细胞定位

总RNA从40天水稻叶片中提取，反转录后，以cDNA为模板扩增OsFTL12的全长ORF（去除终止密码子），将扩增得到的目的片段经酶切回收后与空载体pCAMBIA35S::GFP进行连接，使OsFTL12读码框与GFP融合，>

3 结果与分析

3.1 OsFTL12过表达转基因植株的表型分析

为了研究OsFTL12基因的功能，我们构建了它的过表达载体，然后通过农杆菌介导的遗传转化法得到了转基因植株。在大田中观察表型发现过表达OsFTL12延迟了水稻由营养生长向生殖生长的转变，使水稻抽穗期延迟（图2>OsFTL12的过表达转基因植株做了抽穗期的统计，结果表明，不同株系的OsFTL12过表达转基因植株的抽穗期对比野生型中花11分别推迟了32、28、16、7、3天(图2>OsFTL12的表达进行了分析，结果表明不同株系的过表达转基因植株中，OsFTL12基因的表达都有特别显著地提高，表明过表达载体正常工作，起到了过量表达的效应（图2>

3.3 OsFTL12的时空表达规律

收集转基因植株的不同组织和器官（茎顶端分生组织、根、茎、叶、叶鞘、叶耳、幼嫩的愈伤组织和不同时期的穗）进行GUS染色实验。结果表明OsFTL12在不同的组织器官均有表达，在叶、叶鞘及内外稃中有较高的表达(图3>OsFTL12>OsFTL12>OsFTL12>

同时我们分别从茎顶端分生组织、幼根、成熟叶片、叶鞘、第一节间的茎和不同生长期的幼穗(穗1-3)中提取RNA，用实时定量PCR对OsFTL12表达模式进行分析，结果显示在OsFTL12在不同组织器官中均有表达，在茎、叶鞘和叶片中有较高表达(图3>OsFTL12>在不同叶龄的叶片（不完全伸展的叶、倒二叶、倒三叶和倒四叶）中的表达，结果显示OsFTL12>在幼嫩叶片中的表达高于老的叶片(图3 T,U)，与上述GUS染色结果一致。上面的结果表明OsFTL12>主要在绿色组织中有表达，尤其在茎、叶、叶鞘中表达量高，这与它的表型和功能相符。

3.4>的亚细胞定位

为了研究OsFTL12与起作用的部位，我们将OsFTL12与绿色荧光蛋白GFP融合以示综OsFTL12在细胞中起作用的部位。将构建好的的融合载体和GFP空载体转入农杆菌后，分别注射到烟草的叶片中进行瞬时表达。结果发现融合表达载体在烟草表皮细胞的细胞膜周边和细胞核都有明显的的荧光信号，但在GFP空载体对照中，细胞的各个部分均有GFP信号，无特异性。由于在成熟的植物表皮细胞中央有一个大液泡，大液泡把细胞质挤压到细胞边缘，所以我们推测OsFTL12可能位于细胞质和细胞核中。表明OsFTL12可能在细胞质和细胞核中起作用。

SEQUENCE LISTING

<110>天津师范大学

<120>OsFTL12基因在控制水稻生殖生长转变及株型建成方面的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2190

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atggcaaatg actcattgac aaggagccat atagttggag atgtgttaga ccaattttca60

aactcagtgc ctctaactgt gatgtatgat gggaggcctg tgtttaatgg caaggagttc 120

cgttcctcgg cagtctcgat gaaacctaga gttgagattg gtggcgatga ttttcgattt 180

gcctataccc tagtaagccc attaaattaa ttacttcata cccgatccaa aagagtcata 240

ttgatagatg catgggtagg ccatgcatat atatacattg tccatggtgt tggcaatgca 300

ctttttctct taatcttagg agctcttgag gttggacaga ccaagaaaac aacagcttca 360

ctagccatga taaaccttgg cctagctctt gttgcaatgt gtttgcctca actagatggt 420

gctctctgcc agctggttaa gctaattgag caatattact aacctaaatt aattaggcat 480

tttcagccca gaccaaaaaa atactcaggt ttattttaat ccctttcatg ttgaccatgt 540

gtttgtgtga attgttaata aaaattaggt tatggtggat cctgatgctc ctaatcccag 600

caacccaacc ttgagggaat acctgcactg gtaagctatg ctcttgcaat tgttgtgatt 660

tctatcatat gtctcacatt gattagtgat ctaactacct acttttcaat atgacaggat 720

ggtgactgat atcccatcat cgacggacga tagctttggt gagtatattc atattgtatc 780

cagggtctca agcatacaca actactctgc tgcattagct tttacttgct gtcttcaaat 840

gcttgtcact agctagcaaa tactgatcat cgatccttca actttgatta ctttttttaa 900

aaaaaagtat aaatacttaa aaatatttca tattaacaaa gtatacatcc taattaaatg 960

catatagtca tgaaactttt gtgcatcatg atccaacaat gaaaaaaaaa ttgatgtcca1020

aagttaaaat tcattggttt caaataatga acagttatat atttgaaacc cgagggagtc1080

acaatattgg agtgttcctt catatggcca gtacaagttt ggaaaatggt taagttgata1140

gataattaag taggtatgtt taaccaaaat gttgcatgct tggtgtgatt gatttaaaat1200

tcatacatca caaatccggt ttcttttgtg ctggtccaaa attcagaaat atcaagtagg1260

agtatatgat tgtaactttt gttgttatat ttggaaaaaa aattgcagta caactacaaa1320

gtagatctaa ttaagccagt tactcgcaag gtgcatttct attgatattg aaatagtgca1380

aaattgttct acaaaactgc tgtctgtaaa atttcaacta caggttcaat tcgtctcaat1440

gactccaaaa taaaattctt gcaaacagta ggatcgaaga aaaataaaat aaaaacttgc1500

tagacacaac aaatcttatt ctctcccttc ttttcacact tgatgtcaaa taagttggac1560

gtaaaatctt acagaattat ttttctcctc aaactagctt ggttcatatt tttaaaaaag1620

aacatgattt atagcaccgt tcaacataaa tatggtattt agttgtattc cccccttata1680

ccatactaag ttcgaattaa taatctgaac atgaataaaa acagtagaaa tatatactat1740

gttgcatctc tgcatatggt atagcacata caccggcgga tccaccgccc agcgacccga1800

tcgagcagtc acccgggctt atcggtggaa gatccttttg aaattctatg caatttaaca1860

aattgaaatt gaacattata agcaaatgtt agctataatt aagtatgtcc aaggctttaa1920

aattttactg agcacatatc atatataaat taaattaatg cagggcggga gatcgtaaca1980

tacgaaagcc caagccccac catgggcatc caccgcatcg tgatggtgtt gtatcagcag2040

cttgggcgcg gcacggtgtt cgcgccgcag gtgcgtcaga acttcaacct gcgcagcttc2100

gcgcgccgtt tcaacctcgg caagccggtg gccgccatgt acttcaactg ccagcgcccg2160

acaggcacag gtgggaggag gccaacctga 2190

<210>2

<211>173

<212>PRT

<213> OsFTL12所编码的氨基酸序列

<400>2

Met Ala Asn Asp Ser Leu Thr Arg Ser His Ile Val Gly Asp Val Leu

1 5 1015

Asp Gln Phe Ser Asn Ser Val Pro Leu Thr Val Met Tyr Asp Gly Arg

202530

Pro Val Phe Asn Gly Lys Glu Phe Arg Ser Ser Ala Val Ser Met Lys

354045

Pro Arg Val Glu Ile Gly Gly Asp Asp Phe Arg Phe Ala Tyr Thr Leu

505560

Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Asn Pro Ser Asn Pro Thr Leu Arg

65707580

Glu Tyr Leu His Trp Met Val Thr Asp Ile Pro Ser Ser Thr Asp Asp

859095

Ser Phe Gly Arg Glu Ile Val Thr Tyr Glu Ser Pro Ser Pro Thr Met

100 105 110

Gly Ile His Arg Ile Val Met Val Leu Tyr Gln Gln Leu Gly Arg Gly

115 120 125

Thr Val Phe Ala Pro Gln Val Arg Gln Asn Phe Asn Leu Arg Ser Phe

130 135 140

Ala Arg Arg Phe Asn Leu Gly Lys Pro Val Ala Ala Met Tyr Phe Asn

145 150 155 160

Cys Gln Arg Pro Thr Gly Thr Gly Gly Arg Arg Pro Thr

165 170

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