大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定方法，属于植物抗虫性鉴定技术领域。包括以下步骤：1)苗期活体抗选性鉴定场所的选择与制作；2)抗选性鉴定大豆材料与抗感标准品种在32穴育苗盘内的种植；3)斜纹夜蛾虫源的人工繁殖；4)人工苗期均匀接虫；5)抗虫性的调查和鉴定。该方法通过温室与网室的结合巧妙地减少了非生物和生物因素的干扰，同时通过育苗盘种植大豆材料缩小了试验规模，通过苗期均匀接虫鉴定缩短了试验周期，因而能客观、准确、快速地评价大豆材料的抗选性，进而筛选出高抗和高感材料，大大缩短鉴定周期。同时，该方法简单易行，成本低廉，可操作性强，实用性非常突出，因此本方法能高效、规模化、准确地进行大豆对斜纹夜蛾幼虫抗选性评价和抗虫材料筛选。

说明书

技术领域

本发明属于植物抗虫性鉴定技术领域，具体涉及一种大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定方法。

背景技术

斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)属鳞翅目、夜蛾科，又名莲纹夜蛾，是暴食和杂食性强的一种食叶类害虫，被危害的植物包括双子叶和单子叶植物，共计109科389种。斜纹夜蛾可以取食植物的叶片、花蕾、花及果实，初孵幼虫啃食叶片下表皮及叶肉，被危害后叶片表皮呈透明斑；四龄以后进入暴食期，叶片被取食后仅留下主脉。斜纹夜蛾是我国南方大豆上的主要害虫。

害虫综合治理主要包括化学、物理和生物等防治方法，其中化学和物理方法对环境造成的影响比较大，而生物防治具有环保和可持续的特点。随着人们对无公害绿色食品的需求及环境保护意识日益增强，培育抗虫品种成为控制虫害、保护环境的重要途径。国家大豆改良中心从上世纪八十年代开始进行大豆抗虫育种工作。

植物的抗虫机制主要有三类：抗生性、抗选性和耐害性。抗生性：植物材料含有某些有害化学物质，或缺少必要的营养物质，或虽有营养物质但营养物质不平衡难以被昆虫利用，或由于产生不利于害虫的理化物质，致使害虫取食后害虫死亡率增高、繁殖率降低、生长受到抑制而不能完成发育或延迟发育和寿命缩短的现象。抗选性：由于寄主品种本身具有的形态结构和生理生化的特征，使昆虫不喜欢栖居、产卵和取食的特性。耐害性：植物材料在遭受害虫危害时，害虫能正常生长发育，但植物材料生长和繁殖机能健壮或对损伤有明显的补偿能力，可以忍受虫害而不影响或不显著影响产量。

抗虫育种的首要工作是有可靠的抗虫性鉴定方法及筛选出好的抗源。抗生性评价主要使用实验室称量饲喂不同大豆材料叶片的幼虫重和蛹重等作为抗生性指标。实验室生物测定，因为叶片被采摘后带回实验室喂食幼虫，属离体抗虫性鉴定，同时需经常更换新鲜叶片，涉及的环节多、工作量大，误差往往较大。抗选性评价主要包括田间自然虫源和网室人工接虫鉴定。田间自然虫源鉴定主要利用大田自然虫害，定期调查大豆叶面积损失值筛选抗感材料。网室人工均匀接虫鉴定主要通过人工接虫，以叶面积损失值作为抗选性鉴定指标，在网室中排除其它害虫的干扰，筛选针对某一种食叶性害虫的抗虫种质资源。田间自然虫源鉴定虽然简单便捷，但是易受斜纹夜蛾田间自然种群发生量的影响，同时也会受到其它食叶性害虫及天敌的干扰。高温、暴雨和偶然性灾害等外界环境也会影响幼虫取食、生长和发育，带来较大的误差。网室人工接虫，虽然能适当减少其它食叶性害虫和天敌等生物因素的影响，但是不能避免高温、低温、暴雨和偶然性灾害等非生物因素的干扰，同时因植株较大接虫的数目和次数相对较多。这三种抗虫鉴定方法都是在大豆处于成株期进行，从而实验周期长、工作量大，且往往误差较大。

在植物遗传改良中基因组选择模型的训练、全基因组关联分析及精细定位等都需要准确、快速的表型测定方法。目前规模化的表型测定越来越成为提高遗传分析和基因预测的主要瓶颈。发掘抗虫种质及抗虫基因需对大量的种质资源进行抗虫性鉴定。抗虫品种培育也需对大量的杂交后代进行抗虫性鉴定。因此，高通量、规模化的大豆抗虫表型鉴定越来越受到人们的重视。抗虫性鉴定涉及植物和害虫两种生物，鉴定难度大、工作量大，同时误差往往也较大。

发明内容

1、发明要解决的技术问题

田间自然虫源鉴定受斜纹夜蛾自然种群发生量限制及其它生物、非生物因素影响。网室人工均匀接虫鉴定需虫量大、幼虫存活率低、周期长、且易受天气等外界环境因素影响，不易规模化鉴定抗虫性。为克服以上两种抗选性鉴定方法的缺陷和不足，本发明提供了一种快速、高效、准确的大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定新方法。

2、技术方案

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定方法，该方法采用在温室大棚内自制封闭网室，用32穴育苗盘种植不同材料的大豆苗，在育苗盘中形成封垄后，均匀接斜纹夜蛾三龄幼虫，让其自由取食，然后用叶面积损失值评价大豆苗对斜纹夜蛾幼虫的抗选性，具体包括以下步骤：

步骤一：苗期活体抗选性鉴定场所的选择与制作：

选择或制作通风、光照好、地势高且地理位置好的大棚；同时在大棚内用纱网制作小网室作为抗选性鉴定场所；根据鉴定材料的多少确定网室的大小；鉴定材料少时，多个重复安排在一个网室；鉴定材料多时，一个重复安排在一个网室，即每个网室是一个区组；

步骤二：需要鉴定的大豆材料与抗感标准对照品种的种植：

选择需要对其进行斜纹夜蛾抗选性鉴定的大豆种质材料及抗、感虫标准对照品种在32穴育苗盘中同时种植，采用随机区组设计，设3次及以上重复；采用穴播方式种植，当大豆材料生长到子叶期，开始定苗；当大豆材料第一片复叶完全展开，在育苗盘中形成封垄后，开始向网室接虫；

步骤三：斜纹夜蛾虫源的繁殖：

在养虫室用饲料喂养、繁殖斜纹夜蛾，获得足够量的斜纹夜蛾三龄幼虫；

步骤四：人工均匀接虫：

在储物箱底铺满人工饲料，将养虫室内健康的三龄幼虫转移到储物箱中，用毛笔从饲料上拨下幼虫均匀接到大豆材料复叶正面，接虫量根据实验目的和材料抗性程度的不同进行调整，为每株0.5-2头三龄幼虫；

步骤五：抗选性的调查和鉴定：

在接虫危害3天后，开始记录各大豆材料的叶面积损失值；叶面积损失值以5％为基准递增，最小值是0％，代表植株叶片完全未被取食；最大值是100％，代表植株叶片被完全取食只剩下茎杆；将每穴定苗后的植株作为整体估计每穴的叶面积损失值，当感虫对照品种危害达80％时，即网室内材料的平均叶面积损失值约50％时，以多个重复的叶面积损失值平均数衡量某材料的抗选性，叶面积损失值30％-50％为抗性，小于30％为高抗；结合多次重复试验的多个观察期观测衡量品种抗选性的稳定性。试验后期，当网室内材料的平均叶面积损失值达85％时，可用于验证试验中期筛选出的抗虫品种的准确性。

本发明在温室大棚内的自制封闭网室中，用32穴育苗盘作为大豆材料的种植场所；温室大棚选用常见塑料薄膜大棚，靠近土壤的四周围一层100目的纱网，以便大棚两边塑料薄膜卷上去时防止其它昆虫及猫、狗等小动物的进入；温室大棚能维持网室适宜的温湿度，上午可以将大棚塑料薄膜卷上去，防止高温不利于斜纹夜蛾幼虫生长，傍晚可以将大棚塑料薄膜卷下来，防止凌晨温度过低导致幼虫死亡；同时塑料大棚可防止下暴雨等恶劣天气对斜纹夜蛾幼虫生长的影响；豆苗生长及网室内湿度可通过人工浇水控制。以多次重复试验鉴定筛选出的Lamar、PI227687和日本作为抗虫标准对照品种，以江宁老鼠豆、沔阳白毛豆和衢县秋豆A作为感虫标准对照品种，从而为大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫活体抗选性的鉴定方法提供了对照品种。

本发明所述的方法，在抗虫资源初筛时，每株接1头三龄幼虫；抗虫材料的进一步遴选，增加幼虫量与植株数的比例，每株接2头三龄幼虫；感虫材料的进一步遴选，降低幼虫量与植株数的比例，每2株接1头三龄幼虫。

3、有益效果

(1)本发明所提供的方法具有成本低、周期短、实用性强和高通量等优点，可实现在1个月左右简单高效地筛选出高感和高抗材料；同时，整个鉴定过程所需试验器材简单易得，可操作性强；

(2)本发明的方法是在苗期鉴定，苗期相对于成株期而言，叶片数较少，从而容易准确目测估计叶面积损失值；

(3)本发明的方法给斜纹夜蛾幼虫提供的生长环境接近大田自然环境，同时相对稳定，通过温室与网室的结合排除了非生物和生物因素对斜纹夜蛾幼虫生长的影响，非常适宜斜纹夜蛾幼虫生长，并且空间相对较小使幼虫能够自由选择取食不同材料的大豆叶片；通过运用本方法能提高幼虫存活率，且为苗期试验需虫量较小，大大减少了接虫数目和次数，从而保证试验快速、准确、稳定地进行。

(4)本发明可快速对当前大豆主栽品种和丰富的大豆种质资源进行斜纹夜蛾的抗选性评价，明确目前对斜纹夜蛾抗选性较好的大豆品种和种质材料，为大豆抗虫育种及综合利用大豆抗虫性防治斜纹夜蛾奠定种质基础。

(5)本发明是活体鉴定，非常接近大豆植株与斜纹夜蛾在田间生长的实际情况。而离体叶片的抗生性和抗选性鉴定，叶片由于离开植株，其生化反应可能会有所改变，且水分易蒸发，从而不易真实地反映田间大豆植株与斜纹夜蛾的互作。

(6)本方法与传统方法相比在工作量、接虫数量、数据调查时间、试验周期、鉴定网室面积和试验成本等方面都有大幅度地提高，从而提高了鉴定方法的效率。

附图说明

图1为自制封闭网室的效果图。

图2为32穴育苗盘中的大豆形成封垄的效果图。

图3为网室内材料平均叶面积损失值约为50％时的效果图。

图4为网室内材料平均叶面积损失值约为85％时的效果图。

图5为通过本发明的鉴定方法筛选出的抗感材料图。

图6为高抗和高感材料危害对比图。

图7为32穴和50穴育苗盘F值随调查日期的动态变化图。

图8为32穴和50穴育苗盘误差变异系数随调查日期的动态变化图。

图9为重组自交系群体NJRILY叶面积损失值的次数分布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：大豆抗虫核心种质苗期对斜纹夜蛾幼虫的抗选性鉴定

步骤一：苗期活体抗选性鉴定场所的选择与制作：

在南京农业大学选取通风、光照好且地势高的温室大棚一个，在棚内自制封闭网室进行大豆苗期对斜纹夜蛾幼虫的抗选性鉴定。如图1所示，该自制封闭网室结构包括：长度为150cm的不锈钢管子4根，一端切成锋利的楔形方便插入土中固定，作为支撑网室的柱子；自制两面带有拉链的100目长方体密封网室，网室上方缝有布条以便固定撑起网室；支撑网室的竹竿根据网室大小截取。

步骤二：需要鉴定的大豆抗虫核心种质种植：

大豆抗虫核心种质是国家大豆改良中心对国内外6724份大豆种质资源进行多年抗虫性鉴定基础上，增加国际上常用抗源及江淮地区的大豆育种亲本形成的，材料具有来源范围广、代表性强等特点，共包含76份国内外抗感虫大豆种质。采用随机区组设计，4次重复，4次重复全部安排在一个网室内；在32穴育苗盘中种植，每穴播种6粒种子，当大豆材料生长到子叶期，每穴定苗到2株；当大豆材料第一片复叶完全展开，在育苗盘封垄后(图2)，开始向网室进行人工均匀接虫；试验重复2次，分别记为批次1和批次2。

步骤三：斜纹夜蛾虫源的繁殖：

在养虫室用饲料喂养、繁殖斜纹夜蛾，获得足够量的斜纹夜蛾三龄幼虫；

步骤四：人工均匀接虫：

在储物箱底铺满人工饲料，将养虫室内健康的三龄幼虫转移到储物箱中，用毛笔从饲料上拨下幼虫均匀接到大豆材料复叶正面，每株接1头三龄幼虫；

步骤五：抗虫性的调查和鉴定：

在接虫危害3天后，开始记录各大豆材料的叶面积损失值，叶面积损失值以5％为基准递增，最小值是0，代表植株叶片完全未被取食；最大值是100％，代表植株叶片被完全取食只剩下茎杆；将每穴两个植株作为整体估计每穴的叶面积损失值，当感虫对照品种危害达80％时，即网室内材料的平均叶面积损失值约50％时(图3)，以多个重复的叶面积损失值平均数衡量某材料的抗选性，叶面积损失值30％-50％为抗性，而小于30％为高抗；如图4所示，试验后期，网室内材料的平均叶面积损失值达85％时，可用于验证中期筛选出的抗虫材料是否真正抗虫；另可结合多次重复试验的多个观察期观测衡量品种抗选性的稳定性。

如表1所示，第一次和第二次试验各调查日期间叶面积损失值的相关系数均达极显著水平，第一次各调查日期间的相关性系数为0.41-0.91，相邻调查日期间相关系数大。第二次试验各调查日期间的相关性系数为0.55-0.93，与第一次试验相似，相邻调查日期间相关系数大。第一次试验叶面积损失值平均数与第一试验各调查日期间叶面积损失值的相关系数为0.76-0.94，第二次试验叶面积损失值平均数与第二试验各调查日期间叶面积损失值的相关系数为0.73-0.97，说明平均数能较好地代表各调查日期。两次试验的叶面积损失值平均数间的相关系数达0.76，说明试验的重复性较好。如要减少调查次数，在危害中期(即接虫后第7-9天调查，感虫对照品种危害达80％，整个网室的平均叶面积损失值约为50％)调查最好，它与危害前期和后期的相关性都较高，且在两次试验中与各调查日期的平均数相关系数也分别达0.94和0.97，说明有较好的代表性，只在危害中期调查可大大节约试验时间和调查时间。

表1抗虫指标间的相关系数

为简化相关分析的表格以每隔1天的数据作代表分析。D后面第一个数字“1”和“2”分别代表第1次和第2次试验，第二和第三个数字代表接虫后第几天调查，如“D103”为第1次试验接虫后第3天调查。DLP1和DLP2分别指第1次和第2次试验的平均数。**代表0.01的显著水平。

如表2所示，两批次在感虫对照品种危害达80％时，筛选出的抗虫品种在批次1和批次2中的叶面积损失平均值分别是36％和30％；如表3所示，感虫品种的平均值分别是78％和87％。可见，感虫品种叶面积损失值是抗虫品种叶面积损失值的2倍以上，即该方法能鉴定出材料之间的较大抗性差异。Lamar、PI227687、日本在两批次中均表现高抗特性，因此可以作为苗期抗选性鉴定的标准抗虫对照品种；而江宁老鼠豆、沔阳白毛豆和衢县秋豆A在两批次中均表现高感特性，可作为标准感虫对照品种。如图5所示，通过本方法筛选出的高抗材料为2-PI227687、3-日本、59-Lamar；抗虫材料为42-黄皮小青豆、43-矮秆黄；感虫材料为12-监利牛毛黄、23-南农89-29、25-大浦大粒黄；高感材料为6-沔阳白毛豆。如图6所示，为高抗材料59-Lamar与高感材料6-沔阳白毛豆的危害对比图。

表2大豆抗虫核心种质苗期对斜纹夜蛾幼虫抗选性的抗虫资源遴选

表3大豆抗虫核心种质苗期对斜纹夜蛾幼虫抗选性的感虫资源遴选

实施例2：32穴与50穴育苗盘比较

用5个抗虫品种和4个感虫品种共9个品种，随机区组设计，4次重复，对育苗盘规格进行了比较分析。

32穴与50穴育苗盘相比，每穴水分、空间和营养土供给多，能保证每盘出苗整齐，而且大豆植株在32穴育苗盘生长相对健壮。

32穴相对于50穴育苗盘，由于每穴之间间距相对较大，能够容易准确调查不同品种的叶面积损失值。

如图7所示，在试验的整个调查周期内，32穴比50穴育苗盘大多数调查日期的F值高，说明品种之间叶面积损失值差异大，从而更容易区分品种之间的抗虫性。

如图8所示，在试验的整个调查周期内，随着幼虫危害的加重误差变异系数逐渐降低，大多数调查日期中32穴比50穴育苗盘的误差变异系数小，说明本鉴定方法在幼虫危害后期精确性高，且32穴育苗盘误差较小。

综合上述4个方面的比较，32穴育苗盘是作为大豆苗期对斜纹夜蛾抗选性鉴定的最佳育苗规格。

实施例3：大样本重组自交系群体(含326个家系)的抗选性评价

利用该方法评价了重组自交系群体NJRILY苗期对斜纹夜蛾幼虫活体的抗选性。该群体由高抗亲本Lamar与感虫亲本南农1138-2杂交，单粒传衍生而成，含326个家系。因该群体家系比较多，一个网室只能做一个重复，即一个区组。如图9所示，当NJRILY群体三个重复的叶面积损失值平均达到50％时，家系的叶面积损失值呈正态分布，且有超亲分离。方差分析发现家系之间叶面积损失值存在极显著差异，说明本方法可用于大群体的表型鉴定，且结果可靠、准确。

如表4所示，本案例约1000个鉴定小区，传统方法需3人工作4个月，而新方法仅需1人工作1个月；传统方法需分批次共接幼虫12000头(12头/穴*1000穴)，而新方法仅需一次性接虫2000头(2头/穴*1000穴)；传统方法每次的数据调查时间约为20小时，而新方法每次约需5小时；传统方法1年中合适的鉴定季节仅1次，从而做一次试验需1年，新方法一年中可多次试验，周期仅为1个月；传统方法每小区需0.56平方米，1000小区共需560平方米，而新方法每个32穴育苗盘需要0.15平方米，1000个小区总共仅需4.7平方米；传统方法的试验成本为租金10元/平方米*560平方米，劳务费500元/人月*12人月和化肥、农药、纸袋及水电费等农资1000元，共计12600元；而新方法的试验成本为租金10元/平方米*4.7平方米，劳务费500元/人月*1人月和营养土、育苗盘、网室零件和器具及水电费等农资，约共1000元，而且育苗盘、网室零件和器具等工具可以循环使用。

表4新方法与传统方法的效率比较

注：以1000个鉴定小区计算

从表4可以看出新方法与传统方法的所有项目效率比值都大于4，新方法与传统方法在鉴定网室面积方面的效率比值相差最大，达119.1倍；而效率比值相差最小的是调查时间，但也达到了4倍，这些项目的改进大大降低了试验成本和缩短了试验周期，从而实现了抗虫鉴定的高通量。