灵芝多糖体用于抑制脂肪肝形成的用途及其制备方法

摘要

本发明提供一种灵芝(Ganoderma lucidum)多醣体用于抑制脂肪肝的用途及其制备该灵芝多醣体的方法。本发明的灵芝多醣体在个体中可降低肝脏重量及肝脏脂肪的含量，故可用于脂肪肝疾病的治疗与预防。

说明书

技术领域

本发明是关于一种灵芝多糖体的用途。进一步而言，本发明是提供一种灵芝多糖体的制备方法及其作为抑制脂肪肝形成的用途。

背景技术

脂肪肝是一种三酸甘油酯大液泡累积于肝脏所形成的状况。这个情况大多发生在酗酒或是肥胖个体的肝脏上。脂肪肝通常与发炎相关，称作脂肪肝炎(steatohepatitis)。长期来说，脂肪肝疾病可能导致数种并发症，包括肝硬化、肝肿瘤以及死亡。目前脂肪肝的高普遍度使其成为大众健康的主要威胁，其全球人口的普遍度约为10至24％。因此，在现代社会中，脂肪肝的预防及治疗成为一个主要的目标。

传统中药在亚洲国家中有着悠久的历史，可追溯至几千年前。通常使用的一类传统药物是由药用蕈类组成，例如牛樟芝(Antrodia cinnamomea)、巴西蘑菇(Agaricus blazei Murrill)、灵芝(Ganoderma lucidum)以及冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)，这类药物具有包含免疫调节作用在内的广泛生物活性。药用蕈类灵芝(G.lucidum)在亚洲国家中是用于促进健康以及增长寿命。然而，此蕈类是否能够在脂肪肝疾病上产生有益的效果，仍然是未知的。

综观人类脂肪肝发生率的升高及其于预防及治疗上的困难，人们需要一种替代性的方法来预防、治疗或是控制脂肪肝，尤其是一种新的方法可直接导入日常饮食中，而不会大幅改变生活方式且不会产生毒性或不良的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的一方面是提供一种灵芝(Ganoderma lucidum)多糖体用于制备治疗或预防脂肪肝的药物的用途，其中该灵芝多糖体的分子量是大于135kDa；且其中该灵芝多糖体至少包含甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)及半乳糖(galactose)。在本发明的一实施例中，其中该本发明的灵芝多糖体可进一步包含岩藻糖(fucose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)及葡萄糖胺 (glucosamine)。在本发明的一实施例中，该灵芝多糖体中岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖的质量百分比的比例是为2:2:2:1:16:26:47至3:3:3:1:17:27:48。在本发明的一实施例中，其中该灵芝多糖体的重量平均分子量是846kDa，以及范围是介于135kDa至5,364kDa之间，分子量分布指数(Mw/Mn)是6.25。本发明所提供的灵芝多糖体是降低一个体的肝脏重量及肝脏脂肪的含量。在本发明的一实施例中，该灵芝多糖体的有效剂量是0.001mg/kg至1g/kg。

本发明的另一方面是提供一种灵芝多糖体的制备方法，包含：由灵芝菌丝以水萃取，并续以醇类沉淀，再经离心分离与滤膜过滤而得，其中(a)将灵芝菌丝与水混合并以低转速萃取一预定时间，取上清液并将该上清液浓缩，以获得灵芝萃取浓缩物；(b)将该灵芝萃取浓缩物加入醇类静置一段时间以沉淀出灵芝多糖体粗萃取物；以及(c)将该灵芝多糖体粗萃取物离心后获得沉淀物；以切向流过滤系统(tangential flow filtration,TFF)过滤该沉淀物，以获得灵芝多糖体。

在本发明的一实施例中，步骤(a)的该上清液是以蒸发方式浓缩且步骤(a)该灵芝菌丝与水混合的比值为5％(w/v)；步骤(b)中该醇类是95％酒精、该灵芝萃取浓缩物的浓度比值为20％(w/v)、该灵芝萃取浓缩物与95％酒精混合的比例为1:5、而该一段时间是至少16小时；步骤(c)的切向流过滤系统由0.2μm中空纤维膜过滤及10-300kDa超限滤膜(50cm²，PES)的组合进行划分过滤。

本发明的灵芝多糖体是可用于在动物体或人体中降低肝脏重量及肝脏脂肪的含量，因此，可提供作为治疗或预防脂肪肝相关疾病的医药品、补充品、或饮食品。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，以下所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1为本发明灵芝多糖体的萃取流程图；

图2为本发明使用高效能阴离子交换色层分析仪装配脉冲式安培检测器 (high-performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)分析灵芝多糖体分馏液(G1)中的单糖组成；移动相为16mM NaOH，流速为1毫升/分钟。

滞留时间(分钟)单糖5.038岩藻糖(Fuc)9.031鼠李糖(Rha)9.966阿拉伯糖(Ara)11.638葡萄糖胺(GlcN)12.639半乳糖(Gal)13.937葡萄糖(Glc)15.851甘露糖(Man)

图3为本发明的灵芝多糖体分馏液(G1)的凝胶渗透图谱(gel permeation chromatogram)；

图4为本发明的灵芝多糖体分馏液(G1)的分子量取对数(Log molecular weight)对重量分布/微分分子量取对数(weight fraction/dLogMW)的曲线图；

图5为本发明灵芝多糖体分馏液(G1)的分子量取对数(Log molecular weight)对累积重量分布(cumulative weight fraction)的曲线图；

图6为灵芝多糖体在高脂饮食小鼠的肝脏上的效果。8周C57BL/6NCrlBltw公小鼠随机分为10组，每组5只。小鼠喂食标准chow饲料(能量来源13.5％为脂肪)或是高脂肪含量饲料(能量来源60％为脂肪)，每天藉由胃内灌食的方式灌入100μL的灵芝多糖体分馏液(G1至G4)或蒸馏水处理，持续二个月。之后牺牲小鼠并称其肝脏重量如图6A。图6中，肝脏组织以油红O(oil red O，简称ORO)将脂质染色(图6B)并以Image J软件量化被染色的程度(图6C)，显示灵芝多糖体分馏液G1与G2降低高脂饮食(HFD-fed)小鼠的肝脏重量与脂肪含量。以学生t检定分析统计上的显著差异(**P<0.01,***P<0.001)。比例尺：30μm。

具体实施方式

定义

本文所述的有效剂量是用以表示能降低动物及人类肝脏重量及肝脏脂肪 的含量并抑制脂肪肝形成的灵芝多糖体剂量。适当的有效剂量可依施予生物体或个体的不同而有所差异，但可以包含剂量递增的研究方式的各种实验技术决定有效剂量。

如于本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本发明提供一种能抑制脂肪肝形成的灵芝多糖体，经由实验显示本发明的灵芝多糖体能有效降低个体的肝脏重量及肝脏脂肪含量。概括而言，每日给予哺乳动物或人类本发明的多糖体0.001至1,000mg/kg(体重)剂量可有效降低该哺乳动物或人类肝脏脂肪的含量，详细说明如下。

首先，将灵芝多糖体定性，之后经由实验显示该分离的灵芝多糖体对于脂肪肝的效果实验。

实施例1

本发明灵芝多糖体的制备方法

本发明的灵芝多糖体具有大于135kDa的分子量能有效用于降低肝脏重量及肝脏脂肪的含量。本发明的灵芝多糖体可加入至饮食中，其可为饮品、日常补充品或食品，不需要在生活方式有太大的改变，且不会引起毒素或对健康造成不良的影响。

1.1本发明灵芝水溶性萃取浓缩液的制备步骤

图1是显示从灵芝菌丝分离多糖体的方法。首先，将10L蒸馏水混合由长庚生物科技股份有限公司(台北，台湾)取得的干燥液态发酵的灵芝菌丝(500g)形成混合液(50g/L)，其中固体与液体比值为5％(w/v)，以20公升搅拌式反应器，转速为150RPM(revolution per minute)、121℃高温的条件下萃取30分钟。接着，离心该萃取后混合液以去除固体物质以获得灵芝水萃取物，并以蒸发方式浓缩该萃取物至体积为2.5公升，并分装至20mL暗色玻璃安瓶，接着经高压高温灭菌处理二十分钟，以获得固体与液体比值为20％(w/v)的灵芝萃取浓缩液，保存于4℃备用。

1.2本发明灵芝多糖体粗萃取物的制备步骤

如图1所示，取120mL、20％(w/v)的灵芝萃取浓缩物(代号为W1，含有总水溶性碳水化合物6.03g；详见表1)，加入600mL(五倍灵芝水萃取浓缩物 体积)、95％酒精混合均匀，在4℃静置16小时以沉淀出灵芝多糖体酒精粗萃取物，接着续以离心去除上清液，并以120mL、70％冰酒精清洗及离心沉淀灵芝多糖体粗萃取物三次。接着，将三次的上清液混合为酒精沉淀上清液，体积为1,050mL(代号为G4，含有总水溶性碳水化合物2.82g；详见表1)。取1,000mL蒸馏水复溶酒精沉淀灵芝多糖体粗萃取物，并浓缩至体积为700mL以去除残留酒精，接着加入蒸馏水定量此灵芝多糖体粗萃取物体积至2,400mL(代号为W2，含有总水溶性粗多糖3.21g；见表1与表2)。

1.3本发明灵芝多糖体粗萃取物的分离纯化

取2,400mL灵芝多糖体粗萃取物至50℃水浴槽，接着以切向流超限过滤系统TFF(Spectrum公司，KrosFLo型号)组合0.2μm中空纤维膜(1,500cm²，polyethersulfone，PES)进行划分过滤并将过膜压力(transmembrane>

取上述3,600mL、0.2μm中空纤维膜过滤液至50℃水浴槽，接着以切向流过滤系统组合300kDa超限滤膜(50cm²，PES)进行划分过滤，将过膜压力控制在16-18psi。当回流液体积剩余1,000至1,200mL时补入蒸馏水600mL，继续操作过滤。得到950mL的G1-2分馏液(总水溶性粗多糖0.60g)及3,600mL过滤液。合并G1-1分馏液与G1-2分馏液得到1,600mL的G1分馏液(总水溶性粗多糖1.86g；详见表2)。

另取上述步骤3,600mL过滤液至50℃水浴槽，接着以切向流过滤系统组合10kDa超限滤膜(50cm²，PES)进行划分过滤，将过膜压力控制在16-18psi。当回流液体积剩余1,000至1,200mL时补入蒸馏水600mL，继续操作过滤。得到970mL的10kDa至300kDa的G2分馏液(总水溶性粗多糖1.01g；详见表2)，3,600mL的10kDa过滤液，该10kDa过滤液即为小于10kDa的G3分馏液(总水溶性粗多糖0.34g；详见表2)。

将划分收集到的四个G1-G4分馏液，进行浓缩至少量体积并复溶蒸馏水至体积110mL。每一分馏液分装至五瓶20mL暗色玻璃安瓶，接着经121℃ 灭菌二十分钟，保存于4℃备用。

1.4本发明的灵芝多糖体总水溶性碳水化合物或总水溶性粗多糖含量分析

本发明使用酚-硫酸法分析20％(w/v)的灵芝水萃取浓缩物(代号为W1，120mL)、灵芝多糖体粗萃取物(代号为W2，2,400mL)、G1分馏液(1,600mL)、G2分馏液(970mL)、G3分馏液(3,600mL)、与G4分馏液(1,050mL)的总水溶性碳水化合物或总水溶性粗多糖含量。配制0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.18与0.20mg/mL的葡萄糖标准溶液。每一浓度的葡萄糖标准溶液分别取200μL至1.5mL微量离心管，再加入200μL、5％苯酚并混合均匀。接着加入1mL硫酸，混合均匀。待静置二十分钟，以分光亮度计(spectrophotometer)在波长490nm下测定其读值，并以此读值建立检量线，检量线的R²>0.99。待测样品经适当稀释后，取200μL至1.5mL微量离心管，再加入200μL、5％苯酚混合均匀。接着加入1mL硫酸，混合均匀。待静置二十分钟，以分光亮度计在波长490nm下测定其读值，将读值带入检量线可以计算获得总水溶性碳水化合物或总水溶性粗多糖的浓度。

灵芝多糖体粗萃取物的总水溶性碳水化合物与总水溶性粗多糖含量分析结果如表1及表2所示，其中在表2的20％(w/v)灵芝萃取浓缩液的总水溶性粗多糖含量分布分析中，灵芝多糖体粗萃取物(W2)的总水溶性粗多糖中含有1.86克截留分子量大于300kDa的本发明的灵芝多糖体(G1)，其占总灵芝多糖体萃取物(W2)的57.9％。

表1 灵芝多糖体粗萃取物的总水溶性碳水化合物与总水溶性粗多糖含量分析

表2 20％(w/v)灵芝萃取浓缩液的总水溶性粗多糖含量分布分析

1.5本发明的灵芝多糖体的单糖组成分析

图2显示使用高效能阴离子交换色层分析仪装配脉冲式安培检测器(Dionex ICS-5000 System)分析分馏液(G1)的单糖组成。岩藻糖(L-fucose)、鼠李糖(L-rhamnose)、半乳糖胺(D-galactosamine)、阿拉伯糖(D-arabinose)、葡萄糖胺(D-glucosamine)、半乳糖(D-galactose)、葡萄糖(D-glucose)与甘露糖(D-mannose)的标准混合溶液浓度为0.1、0.5、1、2与5mg/L。分析条件是注射体积为25μL、分析管柱为CarboPac PA1(4×250mm)、移动相为纯水(92％)与200mM氢氧化钠水溶液(8％)经混合后组成比例为16mM氢氧化钠水溶液、流速为1mL/min以及管柱烘箱温度为30℃。注射入单糖标准品，经过三十分钟的分析时间，可获得单糖标准品在0.1、0.5、1、2与5mg/L的峰形积分面积，以此积分面积建立各别单糖的检量线，检量线的R²>0.99。

取0.21mL的分馏液(G1)(总水溶性粗多糖3mg)加入2.79mL蒸馏水以及1.33mL三氟醋酸(trifluoroacetic acid)，在112℃下加热12小时进行酸水解。接着将此混合物浓缩并反复复溶于蒸馏水以除酸，最后复溶于蒸馏水至1mg/mL。此水解产物经稀释4倍(0.25mg/mL)后取25μL，利用高效能阴离子交换色层分析仪搭配脉冲式安培检测器与分析管柱分析，移动相为纯水(92％)与200mM氢氧化钠水溶液(8％)经混合后组成比例为16mM氢氧化钠水溶液、流速为1mL/min以及管柱烘箱温度为30℃。经过30分钟的分析时间，将样品分析所得峰形的滞留时间与积分面积与上述8个标准品相比对，可经由标准品检量线计算出分馏液(G1)的各别单糖浓度，进而获得单糖组成的百分比。分馏液(G1) 经高效能阴离子交换色层分析仪搭配脉冲式安培检测器分析单糖组成比例，岩藻糖占2.8％，鼠李糖占2.5％，阿拉伯糖占2.9％，葡萄糖胺占1.1％，半乳糖占16.9％，葡萄糖占26.3％以及甘露糖占47.5％(详见第2图、表3与表4)。

表3 高效能阴离子交换色层分析仪-脉冲式安培检测器分析300kDa分馏液(G1)的单糖组成比例

表4 300kDa分馏液(G1)的单糖组成摩尔比率(molar ratio)分析

1.6本发明的灵芝多糖体的多糖分子量分布分析

本发明使用分子筛渗透层析法(size-exclusion chromatography，SEC)搭配折射(refractive index，RI)、微差黏度(differential viscosity，DV)、以及光散射(light scattering，LS)三合一侦测器的高效液相色谱分析仪(high performance liquid chromatography，配有Waters 2410折射率检测器index detector，Viscotek 270双检测器)来分析分馏液(G1)中的多糖分子量分布。制备浓度为1.5mg/mL的分子量标准品葡聚糖(Dextran 670)进行系统校正。分析条件是为注射体积100μL、分析管柱为串接2组GPC管柱TSKgel G5000PWxL(7.8×300mm)与TSKgel G6000PWxL(7.8×300mm)、移动相为纯水添加0.02％NaNO₃、流速为0.8mL/min、管柱分析温度为22℃。

取分馏液(G1)(总水溶性粗多糖7.5mg/mL)并以上述条件进行分析。将样品分析所得的RI-DV-LS数据(如第3图所示)经ViscotekOmniSEC系统进行分析计算，计算公式如下：

Mn：数目平均分子量

Mw：重量平均分子量

Mz：较高平均分子量

Mp：最高波锋分子量，为分子量分布最高重量分布点的分子量

Mi：单链分子量(molecular weight of a chain)

Ni：单链的数目(number of chains of that molecular weight)

将分馏液(G1)分析所得的RI-DV-LS数据(图3)经OmniSEC软件进行分析计算之后，得到多糖分子量分布图如图4所示，其中Mn(数目平均分子量)为135,395Da、Mw(重量平均分子量)为846,622Da、Mz(z-平均分子量)为5,364,000Da，与峰值分子量Mp(最高波锋分子量)为309,436Da。多糖分子重 量累积如图5所示，Mn与Mw的累积重量分率(cumuLative weight fraction)为0.79与0.18，换算多糖分子量介于Mn为135,395Da至Mw为846,622Da之间约占总多糖重量的61％。

因此，本发明的分馏液(G1)虽为截留分子量300kDa超限滤膜所截留，但是由于多糖类的生物高分子特性在一般的情况下会产生团聚现象，因此多糖实际分子量会有小于滤膜截留分子量现象，如图4所示分馏液(G1)分子量分布，证实本发明的分馏液(G1)的分子量是大于135kDa的灵芝多糖体分馏物。

实施例2

本发明的灵芝多糖体对高脂饮食小鼠(High-Fat Diet-fed，HFD-fed)的治疗脂肪肝疾病的效果

图6显示灵芝多糖体分馏液(G1、G2、G3及G4)在高脂饮食小鼠的肝脏上的效果。8周C57BL/6NCrlBltw公小鼠随机分为10组，每组5只。小鼠喂食标准chow饲料(能量来源13.5％为脂肪)或是高脂肪含量饲料(能量来源60％为脂肪)，每天藉由胃内灌食的方式灌入100μL的灵芝多糖体分馏液(G1、G2、G3、以及G4)或蒸馏水处理，持续二个月，分别为HFD+G1、HFD+G2、HFD+G3、HFD+G4、HFD、Chow+G1、Chow+G2、Chow+G3、Chow+G4及Chow组。之后牺牲小鼠并秤其肝脏重量如图6A。图6中，肝脏组织以油红O(oil red O，简称ORO)将脂质染色(图6B)并以Image J软件量化被染色的程度(图6C)，显示灵芝多糖体分馏液G1与G2降低高脂饮食(HFD-fed)小鼠的肝脏重量与脂肪含量。

在肝脏重量方面，如图6A所示，相较于其他HFD组，HFD+G1组的肝脏重量较低，显示不同分子量的灵芝多糖体对降低肝脏重量的效果不同，其中又以大于135kDa分子量的灵芝多糖体的效果最佳。在肝脏脂肪方面，如图6B所示，HFD+G1组较其他多糖体处理HFD组降低肝脏脂肪的效果最佳，显示不同分子量的灵芝多糖体对降低肝脏脂肪的效果不同，其中又以大于135kDa分子量的灵芝多糖体的效果最佳。

在所有灵芝多糖体分馏液中，对高脂饮食小鼠来说，多糖体分馏液G1与G2有达到统计上的显著差异，多糖体分馏液G3与G4则无。而多糖体分馏液G1与G2又以G1差异更大，所以效果最好。因此，本发明的灵芝多糖体分馏 液G1有最佳降低肝脏重量(图6A)以及肝脏脂肪的含量(图6B)。灵芝多糖体分馏液G1的多糖体含量为1.94g/100mL，故用以处理小鼠(体重为30g)的灵芝多糖体的剂量为0.0019g/小鼠体重。经由换算，可得用以处理人个体(体重为70kg)的灵芝多糖体分馏液(G1)的剂量为4.53g/人个体体重，亦即用于人体的灵芝多糖体的剂量为0.0646g/kg(G1)。

本发明所提供的分离与纯化的灵芝多糖体，在喂食HFD哺乳动物上可降低脂肪肝疾病的症状。因此，本发明提供一个预防与治疗人类脂肪肝疾病的新颖方法。这个方法有显著商业潜力，可以广泛地用于设计治疗此疾病的商品及治疗方法。前述结果仅代表本发明的一个示例性的应用。本发明的修饰与改良将成为本发明相关领域者的努力成果。这些修饰仍然落入本发明的范围以及本专利的专利范围内。