水貂阿留申病阳性血清标准品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种水貂阿留申病阳性血清标准品及其制备方法。本发明采用水貂阿留申病病毒毒VR‑870病毒提取液作为抗原，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种，采血制备血清。本发明将采血得到的血液用包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释，过夜后提取血清，使制备的阳性血清更加均匀、稳定。本发明的水貂阿留申病阳性血清标准品具有高血清抗体效价，100％的高阳性检测率，高均匀性和稳定性等特点，适合作为检测水貂阿留申病的阳性血清标准样品。

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，涉及检测用病毒阳性血清国家标准品及其制备方法，具体涉及水貂阿留申病阳性血清国家标准品及其制备方法。

背景技术

水貂阿留申病(aleutian disease of mink，AD)又称浆细胞增多症(plasmacytosis)，是由细小病毒科，细小病毒属的阿留申病毒引起的一种水貂所特有的慢性进行性衰弱的传染病。一般认为水貂AD是持续性病毒感染，即使水貂体内出现高价抗体，病毒也不被中和，并不能从宿主体内将其清除，病毒与抗体结合形成具有感染性的免疫复合物，使病貂终生带毒，形成危险的传染源。水貂阿留申病在世界各养貂国家均有发生，所有品系的水貂均能感染，本病的损失不单在于其潜伏期长，传染率、死亡率高，尤为严重的是本病可以大大增加母貂的空怀、新生仔貂死亡和降低产仔率，使生产能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，造成经济损失，是世界公认的养貂的三大疫病之一。

目前国内外均用特异性的诊断方法，检出病貂，并淘汰，达到逐步净化水貂群的目的，建立无阿留申病的水貂场。近年来，我国养貂业发展也很快，从国外引进优良品种也较多，为此加强进口水貂阿留申病检疫工作十分重要。

对流免疫电泳法(CIEP)是世界公认的水貂AD检验方法。为制备标定对流免疫电泳用的水貂阿留申病阳性血清标准品，可以由灭活的水貂阿留申病病毒抗原接种健康家兔，采血，分离血清制成。但目前国内外尚无检测水貂阿留申病的标准样品以及相关的报道，国内各级实验室自行制备标准样品用于检测，影响了检测结果的一致性以及不同实验室数据的可比性。目前实验室一般采用自行分离鉴定的阿留申病原作为抗原制备阳性血清，由于国内阿留申病存在各种亚型，可能存在检测结果不一致等问题，更需要一种具有可以和国际标准样品一致的检测用阳性血清。

发明内容

本发明的目的是提供一种国家标准的水貂阿留申病阳性血清标准品及其制备方法。本发明所述阳性血清标准品是，用纯化的水貂阿留申病病毒抗原接种健康家兔，采血，分离血清制成。该阳性血清标准品具有高血清抗体效价，100％的高阳性检测率，高稳定性等特点，适合作为检测水貂阿留申病病毒的阳性血清标准样品。

本发明所述的水貂阿留申病阳性血清标准品的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原：水貂阿留申病病毒毒株VR-870病毒提取液作为抗原；

(2)动物免疫：对体重为2-3kg、水貂阿留申病病毒阴性的成年雌性家兔，进行3～5次免疫接种：

第1次免疫接种：用弗氏完全佐剂乳化的VR-870病毒提取液，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种；

第3～5次免疫接种：距前一次免疫接种后第10～15天，用弗氏不完全佐剂乳化的VR-870病毒提取液，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种；

(3)最后一次免疫接种后第7～15天开始，采血收集血清，测定抗体效价，确定抗体效价为1：10⁴以上，采血制备血清；

(4)先后经0.45μm和0.22μm无菌滤膜加压过滤血清，滤液无菌分装，得水貂阿留申病阳性血清标准品。

在优选的技术方案中，所述VR-870病毒提取液的制备方法包括如下步骤：将水貂阿留申病病毒VR-870冻存管复苏，接种于CRFK细胞获得病毒增殖液，分离纯化，制备得到VR-870病毒提取液。

在优选的技术方案中，所述VR-870病毒提取液的制备方法包括如下步骤：将已长满单层的CRFK细胞用0.05％胰酶消化，悬浮于含10％胎牛血清的MEM培养基中，以1～2×10⁶个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层约80％面积时，倒掉培养基，加入VR-870病毒冻存液，31.8℃感作1h，再用无血清的MEM培养基清洗两次，覆盖含2％血清的MEM维持液；31.8℃，5％CO₂培养箱继续培养，测得病毒增殖液浓度TCID₅₀为10^-8.5/0.1mL，直至细胞病变达到80％时，反复冻融3次后，在4℃、10000rpm下离心10min，得上清液；将上清液在4℃、27000r/min下超速离心4h后，用0.01mol/L>

在优选的技术方案中，在步骤(3)中，采血得到的血样，通过包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释成两倍，混合均匀，置于20℃下1h，在4℃过夜，取上层液，在4℃、4000rpm下离心10min，收集上层的血清。

在优选的技术方案中，作为抗原的水貂阿留申病病毒毒株VR-870病毒提取液的TCID50为10^-8.5/0.1mL，每次动物免疫接种的病毒接种量为500μg/只。

本发明的有益效果：

本发明首次提供水貂阿留申病阳性血清标准品，该标准品抗体效价高达1：10⁴以上，适用于目前对对水貂阿留申病的主要检测方法，对流免疫电泳的应用要求(《SN/T>

本发明的水貂阿留申病阳性血清标准品，可检测出我国水貂阿留申病的各种亚型。对我国水貂阿留申病的检测具有重要意义。

本发明选择水貂阿留申病病毒株ATCC VR-870作为抗原制备阳性血清，更具有代表性，适用于各级实验室对水貂阿留申病的检测。

本发明在血清标准品的制备中，创新采取包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释提取血清的方法，使制备的阳性血清更加均匀、稳定。

根据《SN/T 1314-2003水貂阿留申病对流免疫电泳操作规程》进行均匀性、稳定性检测，本发明的方法制备得到的水貂阿留申病阳性血清标准品，符合该规程的均匀性和稳定性要求。

本发明的方法制备得到的水貂阿留申病阳性血清标准品，与犬瘟热病毒、肠炎细小病毒通过对流免疫电泳检测法检测，无特异性反应。

本实验制备的标准品，可作为代替实验室自己内部的标准样品进行检测，使实验室间的结果比对成为可能，促进实验室质量控制的标准化和一体化。对解决我国水貂阿留申病诊断具有重要意义。本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。

附图说明

图1为双向琼脂扩散试验抗体效价图。

图2为本发明水貂阿留申病阳性血清标准品特异性试验对流免疫电泳图。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

下述实施例中：

水貂阿留申病病毒毒株：毒株编号为ATCC VR-870；

猫肾传代细胞株CRFK：ATCC CCL-94猫肾传代细胞株。

细胞培养液MEM为美国Gibco公司产品；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FICA)、琼脂糖、叠氮钠(NaN₃)购自SIGMA公司；0.22μm、0.45μm尼龙无菌针头过滤器为美国Nalgene公司生产。

实施例1水貂阿留申病阳性血清的制备

1.免疫用病毒抗原的准备

本发明中用于动物免疫的水貂阿留申病病毒为ATCC标准毒株ADV ATCC VR-87，是国际公认的标准毒株。目前实验室一般采用自行分离鉴定的阿留申病原作为抗原制备阳性血清，由于国内阿留申病存在各种亚型，可能存在检测结果不一致等问题，更需要一种具有可以和国际标准样品一致的检测用阳性血清，我们选择ATCC标准毒株ADV ATCC VR-870作为抗原制备阳性血清，更具有代表性，适用于各级实验室对水貂阿留申病的检测。

(1)抗原的准备：将水貂阿留申病病毒毒株VR-870冻存管复苏，接种CRFK细胞获得病毒增殖液，分离纯化，制备VR-870病毒粗提液备用；其具体步骤是：将已长满单层的CRFK细胞用0.05％胰酶消化，悬浮于含10％胎牛血清的MEM培养基中，以1～2×10⁶个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层约80％面积时，倒掉含10％胎牛血清的MEM培养基，加入VR-870病毒冻存液，31.8℃感作1h，再用无血清的MEM培养基清洗两次，覆盖含2％血清的MEM维持液；31.8℃，5％CO₂培养箱继续培养，测得病毒增殖液浓度TCID₅₀为10^-8.5/0.1mL。直至显微镜观察细胞病变达到80％以上时，反复冻融3次后，4℃、10000rpm下离心10min，得上清液；将上清液在4℃、27000r/min下超速离心4h，用5mL，0.01mol/L>

2.动物免疫：将弗氏完全佐剂(FCA)与步骤(1)准备的ADV VR-870病毒提取液(抗原)1:1混合，混合时为了避免损失抗原，用一个注射器装抗原液，另一注射器装FCA，两注射器以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化成滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止即可完成混合。在4只成年雌家兔(体重2～3kg，经CIEP检测为ADV阴性)的头、颈、背部两侧及足部皮下免疫多点注射1.0mL佐剂-抗原混合液，每点注射约0.1mL，静脉注射0.5mL。每间隔两周再用弗氏不完全佐剂(FICA)乳化的ADV细胞毒加强免疫一次，加强免疫共两次，即第二次、第三次免疫，其方法以及病毒免疫剂量同第一次免疫。每次动物免疫接种的病毒接种量为500μg/只。从第三次免疫后第七天开始，分别从耳缘静脉取2～3mL血，制备血清，检测每只家兔血清的抗体效价。所述免疫具体过程如表1。

表1.ADV病毒家兔免疫具体过程

3.双向琼脂扩散试验检测抗体效价：

1.5g的琼脂糖加到pH 7.1的100mL磷酸盐缓冲液(PBS)内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠(NaN₃)，使其在溶液中的浓度为0.1％。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔(孔1)内加入20μL步骤(2)准备的ADV>2、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶的血清，37℃下孵育24h，观察到加入不稀释的阳性血清、稀释度为1:10、1:10²、1:10³、1:10⁴的血清的孔周围有白色沉淀线产生，说明本实施例制备的血清为水貂阿留申病病毒阳性，该阳性血清抗体效价为1：10⁴。

按上述方法检测每一只免疫家兔的血清的抗体效价，结果表明当家兔达到血清抗体效价为顶峰时，效价均高于1：10⁴，可以满足制备阳性血清的要求。

4.兔抗貂阳性血清制备：

①取免疫效价高于1：10⁴的家兔，心脏采血，放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液，通过包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释，稀释2倍，混合均匀。收集的血液置于20℃下1h左右，移入4℃冰箱摆成斜面放置过夜。凝固后，取上层血清，置4℃下4000rpm离心10min，弃残血。在无菌条件，吸出血清，按上述方法测定其抗体效价，结果表明该血清的抗体效价为1：10⁴，符合制备阳性血清的要求。

②确定抗体效价的血清，经0.45μm无菌滤膜加压过滤，滤液再经0.22μm无菌滤膜加压过滤，滤液无菌分装至2mL灭菌离心管中，0.5mL/支，贮于-40℃以下冰箱，保存，即为本发明的水貂阿留申病阳性血清标准品。

实施例2物理性状检测

观察每份样品颜色和状态，阳性血清为淡黄色、橙黄色或略带棕红色透明液体，久置后有少量白色沉淀。通过经验初步筛选出合格样品，对于保存不当出现失水的样品进行淘汰。

实施例3均匀性试验

不论制备过程中是否经过均匀性初检，凡成批制备并分装成最小包装单元的标准样品，必须进行均匀性检验。

从本发明制备的水貂阿留申病阳性血清标准品350份中，随机抽取8份样品，每组样品分为A、B两个小样。通过OD_280nm值的测定，对制备的ADV阳性血清标准品进行浓度检测。将测定结果分析统计，无显著性差异即所测样品是均匀的。

样品A和B的均匀性试样结果如表2和表3。表2或3的结果表明，分析结果A组样品间及B组样品间均无显著性差异(表4、表5)，即所测样品是均匀的。

表2.样品A组均匀性试验结果表

表3.样品B组均匀性试验结果表

表4.样品A均匀性试验方差分析结果

按α＝0.05，ν₁＝14，ν₂＝15查附表，F临界值＝2.40>2.01，表明样品间没有显著性差异。

表5.样品B均匀性试验方差分析结果

按α＝0.05，ν₁＝14，ν₂＝15查附表，F临界值＝2.35>2.01，表明样品间没有显著性差异。

实施例4稳定性试验

以两年为期，对本发明制备的水貂阿留申病阳性血清标准品分阶段每次取二份样品，按照不同保存条件做效价检测。标准样品应在规定的贮存或使用条件下，定期地进行待定特性量值的稳定性检验。

在两种温度类型条件下，根据双向琼脂扩散试验检测抗体效价对样品进行稳定性试验：一种是在贮存温度(-40℃)下的稳定性试验(表6)，每个月随机检测2份样品，共计12个月；另一种是取样品2份，在较高的温度(模拟样品的运输条件4℃，并模拟运输安检条件经过X光线照射30秒)下的稳定性试验(表7)，每1天检测一次，共计12天。将测定结果分析统计，无显著性差异即所测样品是稳定的。

表6和表7的结果表明，两个贮存条件(-40℃保存和4℃保存经过X光照射30秒)下样品之间及同一温度下样品之间均不存在显著差异，可以认为样品是稳定的。

表6.稳定性检验实验(-40℃下保存)

表7.稳定性检验实验(4℃下保存经X光照射)

实施例4特异性试验

特异性试验：与犬瘟热病毒、肠炎细小病毒通过对流免疫电泳检测法检测，无特异性反应，结果如图2。图2中上排电泳正极，孔1-6分别加入制备的水貂阿留申病阳性血清标准品，下排电泳负极，孔1加入水貂阿留申病病毒提取液，孔2、孔3加入犬瘟热病毒病毒提取液，孔4孔5加入肠炎细小病毒病毒提取液，孔6加入电泳缓冲液作为阴性对照。图2中可见，孔1的周围生成了明显的白色抗原抗体反应沉淀线，而孔2～6没有生成沉淀线，证明本发明的阳性血清与水貂易患的其他两大疫病均无特异性反应，对水貂阿留申病病毒具有特异性，可以作为水貂阿留申病检测使用。