丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术

摘要

本发明涉及一种丝状真菌质谱鉴定蛋白提取方法，包括用75％乙醇灭活洗脱丝状真菌的菌丝；再用磁珠加上合适比例的甲酸和乙腈结合旋涡震荡充分乳化和碾磨其细胞壁；最后用超声波超声破碎细胞，从而有利于真菌蛋白的完全析出，即可用于质谱的鉴定。通过这样富集提取的蛋白纯度和产量较高，可以使得大多数临床常见丝状真菌如曲霉菌属、暗色真菌、接合菌属、镰刀菌属、尖端赛多孢子菌、双相真菌的质谱鉴定到种的水平。

说明书

技术领域

本发明涉及临床标本病原性真菌的蛋白检测，属于医学分子生物学领域。

背景技术

近几年来基质辅助激光解析飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)已越来越多的用于临床上病原微生物的鉴定。其在普通细菌的鉴定能力上已完全能够和传统的生化反应鉴定技术和金标准的序列测定技术相媲美。但在少见病原如分支杆菌、诺卡菌、真菌的鉴定方面由于这些病原菌自身的生长结构特点导致其蛋白提取效果不甚理想。因而不能达到满意的鉴定效果。

目前临床上常用的化学提取丝状真菌蛋白的方法只能提取临床上常见丝状真菌的少数菌属，对多数丝状真菌提取效果不甚理想，因此需要开发出一种新的提取方法解决存在的问题。本发明通过大量富集丝状真菌的菌丝，借助乙醇的洗脱沉淀纯化、磁珠的碾磨、超声波的破碎和甲酸乙腈的提取能够得到高纯度的丝状真菌蛋白，将能够使质谱鉴定丝状真菌的技术得到更好的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种临床标本丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术。所涉及的临床标本丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术采用7步法。是在临床常用的化学提取法基础上改进而来。在甲酸乙腈化学提取的基础上加入磁珠研磨和超声破碎步骤，通过反复提取，丝状真菌的蛋白能够充分释放出来，即可用于后续的高质量的质谱鉴定。具体作法为：

（1）液体沙保弱培养基垂直旋转培养临床丝状真菌，直至培养出足够多的丝状真菌，静止10分钟，待其沉淀；

（2）弃上清培养液，收集1.5ml的沉淀转移至eppendorf管中，13000rpm 离心2分钟，弃上清；再用75%的乙醇1ml 13000rpm 离心灭活洗脱3分钟。重复用75%的乙醇1ml洗脱沉淀2次，待沉淀充分干燥；

（3）沉淀中加入等量的0.1mm磁珠，视沉淀多少加入20~100µL的70%甲酸水溶液（要求加入的甲酸水溶液没过沉淀），充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；

（4）再加入等体积的乙腈溶液，充分研磨，漩涡震荡混匀作用5分钟；

（5）超声波超声破碎2分钟；

（6）13000rpm离心2分钟，吸取 1 µL 上清液添加到 MALDI靶板上，并在室温下自然晾干；

（7）在上述样品点上覆盖 1 µL HCCA 基质溶液并在室温下自然晾干。即可上机质谱鉴定。

本发明具有快速、灵敏度高、蛋白提取纯度高、产量高的特点，能够使质谱鉴定丝状真菌的能力从属的水平提高到种的水平。