重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因。本发明还公开了上述重组猪流感疫苗株的制备方法及应用。本发明的重组猪流感疫苗株，在MDCK细胞上具有较高的病毒滴度，经灭活后制备的重组高产细胞灭活疫苗能对欧亚禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供完全有效的免疫保护。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株及其制备方法和应用。

背景技术

猪流感(Swine influenza,SI)是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swineinfluenza virus,SIV)感染，引起猪出现高热、咳嗽、呼吸困难等症状的高度接触性呼吸道传染病，具有发病率高，传播速度快，死亡率低等特征。有报道表明猪流感病毒感染猪群同时还极易引起其他细菌和病毒的混合感染，如猪繁殖与呼吸障碍综合症、传染性胸膜肺炎、猪链球菌等，使疫情变得更加复杂，对疾病控制造成巨大困难。目前引起猪发病的SIV亚型主要为H1N1、H1N2和H3N2，主要包括欧洲禽源H1N1亚型SIV、古典的H1N1亚型、重组H1N2亚型SIV、人源H3N2亚型SIV及重组H3N2亚型SIV等。研究表明猪的呼吸道上皮细胞表面同时存在人流感病毒受体SAα-2，3-Gal(唾液酸α-2，3半乳糖苷)和禽流感病毒(Avianinfluenza virus,AIV)受体SAα-2,6-Gal(唾液酸α-2，3半乳糖苷)，在流感病毒传播中，猪被认为是病毒基因重组的潜在“混合器”和新的流行毒株产生的“孵育器”，也是流感病毒跨越种间屏障传播的重要中间宿主之一。因此防控SIV对预防猪群爆发流感病毒及继发其他细菌和病毒感染具有重要意义的同时，同样对指导和防控人与禽的流感病毒起到积极的辅助作用。

目前，技术上成熟且应用广泛的SI疫苗主要是油佐型的H1N1亚型和H3N2亚型的单价或者多价全病毒灭活疫苗，SI全病毒灭活疫苗虽然具有高效、操作简单、成本较低等优点，但是也存在产生抗体较慢、应激反应强等不足。特别是疫苗种毒大多来自于流行毒株，一旦疫苗制备过程发生病毒泄漏，容易诱发新的疫情，给疾病防控带来很大不便。此外，目前国内外生产流感疫苗仍主要采取鸡胚接种培养法，鸡胚接种虽然操作简单，储备经验丰富，但是不可避免的带来耗时量大，消耗量多，生产过程易产生污染，质量难以保障，收毒后的鸡胚难处理等缺点，另外流感病毒在鸡胚传代接种中常会发生抗原变异，影响疫苗效果。有报道，1997年香港感染人的H5N1禽流感病毒能使鸡胚产生巨大细胞病变以至于很难用鸡胚来增殖产生疫苗。而流感病毒在普通MDCK细胞上适应性普遍较低，这阻碍其进一步发展和使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，其包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，该重组猪流感疫苗株不仅能够通过细胞培养大量生产，而且由该重组疫苗株制备的灭活疫苗能够刺激机体短时间内即产生高水平的抗体。

此外，还需要提供一种上述重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种重组猪流感疫苗株，该重组疫苗株包含：欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA和NA基因、以及PR8病毒的PA、PB1、PB2、M、NP和NS六个内部基因，

所述猪流感病毒SH1株的HA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述猪流感病毒SH1株的NA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述猪流感病毒SH1株的HA基因具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述猪流感病毒SH1株的NA基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA或NA基因，所述HA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述NA基因的核苷酸序列选自：

(1)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有98％以上同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。

所述重组载体为重组质粒载体，其空载体为PBD载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组猪流感疫苗株的制备方法，包括以下步骤：

构建分别包含欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒SH1株的HA基因和NA基因的重组载体；

将所述含HA基因的重组载体和含NA基因的重组载体，与分别包含PR8病毒PA、PB1、PB2、M、NP、NS内部基因的六个质粒一起转染293T细胞，培养转染后的细胞；

将培养的细胞上清接种于MDCK细胞，待MDCK细胞出现病变后收集病毒液，检测该病毒液的血凝效价，如果有血凝活性，并且经序列分析确定没有非预期突变后，即获得重组猪流感疫苗株。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，包含：上述重组猪流感疫苗株的灭活疫苗，以及佐剂或药用载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组猪流感疫苗株在制备预防或治疗猪流感的疫苗中的应用。

本发明重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株，与野生株病毒相比，在细胞上有更强的复制能力，能达到更高的病毒滴度，而且通过小鼠免疫和攻毒实验证实，该重组疫苗株制备的灭活疫苗首免后的第2周即能获得较高的抗体效价，并能针对欧亚禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供完全有效的免疫保护。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株SH1的NA和HA基因PCR扩增产物电泳图；

图2是本发明实施例1欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株SH1的NA和HA基因菌液PCR鉴定结果图；

图3是本发明实施例2病毒以0.001MOI接种MDCK细胞后的生长曲线图；

图4是本发明实施例2病毒以0.001MOI接种SPF鸡胚后的生长曲线图；

图5是本发明实施例2病毒蚀斑检测结果图；

图6是本发明实施例3血凝抑制(HI)抗体检测结果图；

图7是本发明实施例3中和抗体效价图；

图8是本发明实施例3的lgG抗体效价图；

图9是本发明实施例3攻毒后第3、5天小鼠肺脏组织病毒滴度柱状图；

图10是本发明实施例3攻毒14天后小鼠的体重变化图；

图11是本发明实施例3攻毒后14天小鼠的存活率图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本发明以欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料，采用RT-PCR扩增HA和NA基因，并将其克隆至PBD载体中，构建HA和NA基因的重组质粒。将该HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞，成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感疫苗株SH/PR8。该重组疫苗株SH/PR8在MDCK细胞或鸡胚上具有较高的病毒滴度，经灭活后制备的重组高产细胞灭活疫苗能对猪流感病毒SH1的攻击提供100％的免疫保护。

实施例1欧洲禽源H1N1亚型SIV重组毒株SH/PR8的构建

按照TRizol试剂盒上的说明书，提取欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒国内流行株A/swine/Shanghai/1/2014(SH1)的病毒RNA，并反转录合成cDNA，通过RT-PCR进行目的片段HA和NA的扩增，PCR反应条件：95℃，1min；95℃，20s；48℃，20s；72℃，1min；72℃，10min，30个循环。扩增后的HA和NA核酸产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图1，图1中，M：DNA分子质量标准(DL2000)；1：NA基因的PCR扩增产物(1410bp左右)；2：HA基因的PCR扩增产物(1701bp左右))，并产物回收。分别将含有HA和NA的胶回收产物经过限制性内切酶BspQΙ进行酶切反应，之后进行胶回收，再与BspQΙ酶切后的PBD载体连接。将连接后的产物转化进入DH5α大肠杆菌感受态细胞中。将转化后的产物涂在含有氨苄青霉素的LB培养平板中，经过37℃培养12-14h后，挑出单克隆菌落放入含有氨苄青霉素的LB培养基中，经过37℃，180rpm/min的水平摇床上培养14-16h。通过菌液PCR鉴定法筛选出阳性克隆(见图2，图2中，M：DNA分子质量标准(DL2000)；A图是HA菌PCR液鉴定结果，其中1-6鉴定结果为阳性；B图是NA菌液PCR鉴定结果，其中1，4，5，7鉴定结果为阳性)，并将阳性克隆送去英俊生物公司进行序列测定。将测序结果正确的阳性质粒命名为PBD-HA和PBD-NA，并按照QIANGEN Plasmid Purification Kit的说明书提取阳性质粒。取1ug PBD-HA和1ug PBD-NA与A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)的8质粒系统的其余6质粒(PBD-PR8M、PBD-PR8PB1、PBD-PR8PB2、PBD-PR8PA、PBD-PR8NS、PBD-PR8NP)各1ug混合，参照脂质体Lipofectamine2000转染试剂产品说明书进行转染。转染293T细胞经过48h后，收集上清并接种到MDCK细胞中，待细胞出现明显病变(CPE)后收集病毒液。对收集的病毒液进行血凝效价的检测，提取病毒RNA，反转录合成cDNA后，以该cDNA为模板PCR扩增拯救的病毒的八个基因片段，并进行基因片段序列的测定和比对。收集接种72h后MDCK增殖的上清液，用血凝试验检测其血凝效价，盲传三代继续检测其血凝效价。通过测序结果和血凝实验结果表明已成功拯救出重组病毒SH/PR8。

实施例2重组毒株SH/PR8与原始野生株SH1在细胞及鸡胚上复制能力的比较

配制好流感病毒感染液，加入TPCK(蛋白酶)。稀释病毒，按照10倍稀释法，用病毒感染液倍比稀释病毒，充分混匀，并将病毒从10^-1稀释到10^-11，依次将稀释好的病毒加入铺有MDCK细胞的96孔板中，放入37℃，5％的CO₂细胞培养箱培养72h，观察细胞病变(CPE)情况，并记录结果，吸出细胞上清液进行血凝检测实验复核实验结果，计算出TCID₅₀的值。

配制好流感病毒感染液，将SH/P8和原始毒株SH1病毒用病毒感染液稀释,按照每孔接种0.001MOI的病毒量无菌接种进入12孔细胞培养板中，12孔细胞培养板长满密度约90﹪的MDCK细胞，间隔12h,24h,36h,48h,60h,72h后分别无菌收集细胞上清液，检测不同时间段HA血凝效价。结果表明，重组SH/PR8病毒相比较原始株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力，在60h后HA效价达到2⁹(见图3)。

用病毒稀释液将病毒稀释成100TCID₅₀，按照100TCID₅₀的病毒滴度将病毒无菌地接种到9-11日龄的SPF鸡胚中，将鸡胚放入37℃的孵化箱中，保持合适的湿度并且间隔着相同时间段翻动鸡胚，间隔12h，24h,36h,48h,60h,72h后分别无菌收取鸡胚尿囊液，3000rpm,5min离心后收集上清液，对其进行HA血凝检测实验。结果显示，重组SH/PR8病毒相对于原始野生株SH1在SPF鸡胚上具有更高的复制能力(见图4)。

配制好2％的低熔点的(LMP)琼脂糖凝胶，高压灭菌后放入37℃细胞培养箱中。提前将MDCK细胞接种6孔细胞培养板中，当细胞培养至长满6孔细胞培养板时，配置病毒感染液并加入TPCK蛋白酶，按照10倍大小倍比稀释病毒液。用PBS磷酸盐缓冲液清洗MDCK细胞两边，再用DMEM培养基清洗一遍。将稀释好的病毒液按照每孔1ml分别加入6孔培养板中，将病毒液放入37℃，5％的CO2细胞培养箱中，让病毒吸附进入MDCK细胞中，中间每间隔30min混匀病毒稀释液，让病毒吸附1.5h左右。从6孔细胞培养板中弃去病毒液，DMEM培养基清洗一遍。按照每孔板4ml的2％LMP的量加入6孔培养板中。室温下静置2h左右，待到2％LMP完全凝固后，将6孔细胞培养板倒扣在37℃，5％的CO2细胞培养箱中。培养至48h左右观察细胞病变情况。待到出现明显且大小适宜的空斑后，终止培养并加入4％的甲醛固定1.5h-2h后。弃去甲醛溶液，无菌挑出低熔点的琼脂糖凝胶，每孔加入约2ml的龙胆紫染色液固定，约15min后回收染色液，流水清洗干净后观察空斑形态。结果显示，重组SH/PR8毒株相对于原始野生株SH1形成的病毒蚀斑大小更大，表明重组SH/PR8具有更高的复制能力(见图5)。在图5中，A:正常对照；B:原始野生株SH1；C:重组毒株SH/PR8。

实施例3欧洲禽源H1N1亚型SIV重组高产灭活疫苗的制备及其免疫保护效力的评价

将原始野生株SH1和重组毒株SH/PR8按照0.001MOI的剂量接种于MDCK细胞培养瓶中，大量扩增病毒后，收集细胞上清液，3000rpm,10min离心分离细胞碎片并收集上清液。对扩增得到的原始野生株SH1和重组病毒SH/PR8进行HA血凝检测试验，检测其病毒血凝效价。

选取法国赛比克公司生产的Montanide ISA 61VG油包水的矿物佐剂和Montanide ISA 15AVG水包油的矿物佐剂做了两组进行比较。将病毒经过0.1％甲醛溶液37℃灭活24-48h,灭活后的病毒在MDCK细胞上盲传3代后，分别检测HA血凝效价。将灭活后的病毒按照乳化说明书的要求乳化病毒，61VG的佐剂按照重量40％抗原和60％佐剂比例乳化重组的病毒，15AVG的佐剂按照重量15％和85％的重量比例乳化重组的病毒。

选取6-8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为5组，第一组和第二组分别是选取不同佐剂的疫苗油包水的61VG和水包油的15VG，第三组和第四组分别是选取不加佐剂乳化的灭活重组病毒，第五组为免疫DMEM的对照组。免疫程序为：皮下注射一免，间隔2周后皮下注射二免，间隔2周后攻毒。免疫方式为皮下多点注射接种，按照每只小鼠200ul的接种量分别免疫5组小鼠，第一组为SH/PR8+61VG组；第二组为SH/PR8+15VG组；第三组为SH/PR8+DMEM组(按照61VG的乳化要求，将抗原与DMEM质量比为40：60进行混匀)；第四组为SH/PR8+DMEM组(按照15AVG的乳化要求，将抗原与DMEM质量比为15：85进行混匀；第5组为DMEM对照组。

对小鼠进行眼眶丛采血收集各组小鼠血清，各组小鼠在首免后的四周内每间隔一周分别采集一次，将收集到血清分别进行血凝抑制实验和中和实验。将各组小鼠血清与RDE(受体破坏酶)按照体积比1：3的比例混匀，37℃孵育18-20h,56℃灭活30min-60min。参照《国家流感中心标准操作规程》进行血凝抑制(HI)实验，记录实验结果。结果表明，随着首免时间的延长，HI抗体效价逐渐提高，2免后第2周抗体效价最高达到2⁹左右，其中组一SH/PR8+61VG油包水佐剂组产生HI抗体效价最高。组二SH/PR8+15A水包油在首免第3周就能达到较高的血凝抑制(HI)抗体效价(见图6)。在图6中，横坐标为首免后间隔时间(周)，纵坐标为血凝抑制效价(Log2)；SH/PR8+61VG为添加油包水佐剂的免疫组；SH/PR8+15AVG为添加水包油佐剂的免疫组；SH/PR8+DMEM为不添加佐剂的免疫组；DMEM为非免疫组。

配制病毒感染液并加入双抗(青、链霉素混合液)，按照病毒感染液比TPCK体积比为1000：2的比例添加TPCK到感染液中。配置病毒感染液并加入双抗(青、链霉素混合液)，将收集的血清56℃热灭活30min，将灭活后的血清按照1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1:1280的比例用感染液进行稀释，每个样做2个重复，稀释原始流感病毒SH1到100TCID₅₀的病毒滴度，在96孔细胞培养板中每孔加入50ul稀释后的血清和50ul(100TCID₅₀)的病毒液，37℃孵育2h。将血清和病毒混合液滴加到长满MDCK细胞的96孔培养板中，设立只接种病毒的阳性对照和不接种病毒的阴性对照。经过48h后观察细胞病变情况，检测血清中和抗体效价，吸出细胞上清液进行血凝实验复核实验结果并记录。结果表明，随着首免时间的延长，中和抗体效价逐渐提高，2免后第2周中和抗体效价最高达到10³以上，第二组SH/PR8+15A水包油在首免第2周中和抗体效价就能达到10³左右(见图7)。

通过30％-60％蔗糖梯度超速离心纯化原始野生株SH1，参照《国家流感中心标准操作规程》，用ELISA进行lgG抗体检测，具体步骤如下。

1、包被：将纯化的病毒SH1用碳酸盐缓冲液包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，4℃过夜。

2、洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

3、封闭：5％脱脂乳(BSA)37℃孵育2小时，200μL/孔。

4、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

5、加一抗：用5％脱脂乳(BSA)梯度稀释样品血清，1：300，1：600，1：1200，2400，1：4800，1：9600，1；19200，37℃孵育2h。

6、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

7、加入二抗：用5％脱脂乳按1：10000倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。

8、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

9、显色：每孔加入50μL TMB显色液，避光室温孵育15分钟。

10、终止：每孔加入50μL 2M H₂SO₄。

11、OD值检测：酶标仪测定OD₄₅₀值IgG抗体效价。判断标准参照《国家流感中心标准操作规程》

结果显示，随着首免时间的延长，IgG抗体效价逐渐提高，2免后第2周抗体效价最高达到10⁵以上，其中组二SH/PR8+15A水包油在首免第3周达到10⁵左右(见图8)。

将扩增后的原始野生株SH1进行病毒滴度TCID₅₀的检测，按照每只小鼠1x10⁵TCID₅₀的病毒接种量攻毒，其中对照组选取6只不攻毒作为正常小鼠对照。攻毒后观察小鼠精神状态，攻毒3d和5d后取小鼠肺脏进行病毒滴定(结果见图9)。称量小鼠14天体重变化情况(见图10)及存活率(见图11)。结果表明，攻毒后非免疫组体重持续下降，6天后小鼠出现100％死亡，而免疫组，没有出现死亡，表明利用重组疫苗株制备的灭活疫苗能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒野生株SH1的攻击提供100％的免疫保护。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。