基因重组对欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒生物学特性的影响

摘要

猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)是分为8个节段的负链RNA病毒，属于正黏病毒科。H1N1亚型SIV主要包括古典、欧洲类禽、重组及人源H1N1亚型SIV。欧洲类禽H1N1亚型SIV自1979年在欧洲发现后，迅速于欧洲和亚洲猪群中流行开来。特别是近年来，重组的H1N1亚型SIV在猪群中被大量地鉴定并分离到，表明不同来源的H1N1亚型SIV在猪群中广泛并复杂的分布。目前国内外关于基因重组对该种亚型的SIV生物学特性的影响尚不清楚。
　　本研究在前期国内部分地区分子流行病学调查的基础上，通过对猪流感病毒的分子进化分析，确定两株代表性毒株，分别为欧洲类禽H1N1亚型SIV(A/swine/Tianjin/6/2011(H1N1)，简称TJ6）和三源重组H1N1亚型SIV(A/swine/Tianjin/10/2013(H1N1)，简称TJ10）。通过体内及体外试验，对两株病毒在MDCK细胞、猪及小鼠体内复制和致病能力进行比较。研究结果表明:TJ6在MDCK细胞上的复制能力远远低于TJ10;TJ10在猪和小鼠体内呈现较高的致病力，引起的病理性损伤更严重，在肺脏及鼻甲骨中的病毒滴度更高。
　　为探究两种H1N1亚型SIV感染宿主后对机体产生的差异，利用RNA-seq高通量测序，对不同的病毒感染小鼠后的肺组织进行了mRNA转录组差异性分析。在对两毒株的差异表达基因检测过程中，总共筛选到4588个差异显著表达的基因。与对照组相比，TJ6、TJ10分别有1275和3871个差异基因。与TJ6相比，TJ10有2681个差异基因，包括1125个上调，1556个下调。通过对差异基因进行GO分类统计、KEGG分析及eggNOG分类发现，各个比对组中有大量的差异基因参与免疫应答、信号转导等生物学过程以及与癌症、甲型流感病毒、细胞因子受体互作相关的通路。与TJ6相比，TJ10感染小鼠后引起宿主非正常的免疫应答和炎性反应以及抗病毒感染过程，导致宿主体内细胞因子上调或下调，引发宿主免疫系统失调，从而引起小鼠的死亡。
　　为进一步解析病毒分子致病机制，本研究对强弱毒株进行序列测定及氨基酸序列差异性分析。通过测序得出，两毒株在基因片段NS、NP、PA、PB1、PB2差异较大。分别构建上述两株病毒的反向遗传操作技术平台，成功获得两毒株的拯救株rTJ6、rTJ10。实验结果表明，拯救毒株与野生毒株在MDCK细胞上以及猪及小鼠体内的复制能力几乎一致，具有相同的生物学特性。通过对单个基因片段或多个基因片段的替换，拯救并鉴定了多种重组病毒。体内外研究数据表明，组成核糖核蛋白复合物的NP、PA、PB1、PB2共同提高了聚合酶活性;NS1通过拮抗干扰素的生成来促进病毒的复制。由此推断，病毒重组后通过核糖核蛋白复合物基因与NS基因协同作用，促进了病毒的转录和复制，提高了病毒毒力。
　　基因重组是流感病毒演化的动力，它使得流感病毒获得抗原性的变异，从而可以逃避宿主的免疫应答，甚至引发新的大流行毒株的产生。本研究有助于人们了解流感病毒的进化方式，为下一次流感的大流行提供可靠的理论依据，并且进一步提高对流感病毒分子致病机制的认识。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 猪流感病毒概述

1．1．1 猪流感病毒的形态结构

1．1．2 猪流感病毒蛋白结构和功能

1．2 H1N1亚型猪流感病毒在世界范围内的流行情况

1．2．1 古典H1N1亚型猪流感病毒

1．2．2 欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒

1．2．3 重组H1N1亚型猪流感病毒

1．2．4 人源H1N1亚型猪流感病毒

1．3 SI的公共卫生学意义

1．4 核糖核蛋白复合体以及NS蛋白对病毒复制的影响

1．4．1 核糖核蛋白复合体(vRNPs)与聚合酶活性

1．4．2 非结构蛋白NS与干扰素IFN

1．5 本研究的目的和意义

第二章 强弱毒株的确立及小鼠肺组织mRNA转录组分析

2．1 材料

2．1．1 毒株与细胞

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 代表性毒株的确定

2．2．2 强弱毒株的确定

2．2．3 小鼠肺组织mRNA转录组分析

2．3 结果

2．3．1 代表性毒株的确定

2．3．2 强弱毒株的确定

2．3．3 小鼠肺组织mRNA转录组差异性分析结果

2．4 讨论

第三章 基因重组对欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒生物学特性的影响

3．1 材料

3．1．1 毒株与细胞

3．1．2 菌种与质粒

3．1．3 实验动物

3．1．4 主要试剂

3．1．5 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 病毒RNA提取及反转录

3．2．3 8片段的RT-PCR扩增

3．2．4 重组质粒的构建、鉴定及纯化

3．2．5 病毒的拯救与鉴定

3．2．6 多种重组病毒的拯救及鉴定

3．2．7 不同重组病毒生长曲线的绘制

3．2．8 不同重组病毒对小鼠的致病性试验

3．2．10 荧光定量PCR检测IFN的表达

3．3 结果

3．3．1 拯救病毒的鉴定

3．3．2 拯救病毒对小鼠致病性的影响

3．3．3 重组病毒的拯救及鉴定结果

3．3．4 不同病毒生长曲线的绘制

3．3．5 不同病毒对小鼠的致病试验的差异

3．3．6 重组病毒聚合酶活性的检测

3．3．7 荧光定量PCR检测IFN的表达情况

3．4 讨论

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历