ZnO@PMAA‑b‑PHPMA 量子点纳米材料及其制备和作为药物载体的应用

摘要

本发明公开了一种ZnO@PMAA‑b‑PHPMA量子点，是以亲水性的N‑(2‑羟丙基)‑甲基丙烯酰胺(HPMA)为起始原料，在引发剂的作用下，通过RAFT聚合法制得大分子RAFT试剂，再使大分子RAFT试剂与甲基丙烯酸锌共聚得到聚合物配体分子，然后加入氢氧化锂形成以聚甲基丙烯酸‑b‑聚(N‑(2‑羟丙基)‑甲基丙烯酰胺为外壳，ZnO纳米颗粒为核的水溶性量子点纳米材料，具有很高的pH敏感性，在pH值小于5.5时立即分解，释放负载的抗癌药物。药物体外释放实验表明，该纳米材料可以对细胞内酸性环境作出响应，实现细胞内药物的可控释放，同时有利于提高药物在肿瘤细胞中的累积，减少药物毒副作用。

说明书

技术领域

发明涉及一种水溶性的ZnO量子点纳米材料，尤其涉及一种ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料及其制备方法；本发明同时涉及该ZnO量子点纳米材料为药物载体的应用在制备抗肿瘤药中的应用，属于纳米材料制备和生物医学领域。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，是引起死亡的主要原因之一。发展抗肿瘤药物的新型靶向载体，增加药物靶向性，提高生物利用度，降低毒副作用，是目前备受关注的课题。近年来，随着纳米科学技术的飞速发展，纳米药物载体应运而生，将药物包封于纳米药物载体中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布以及提高生物利用度等，并逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。

相比传统的量子点如碲化镉或硫化镉，ZnO量子点由于具有宽禁带（3.37 eV）、高激子束缚能（60 meV）、无毒性，良好生物相容性，价格低廉等优点，作为新型纳米材料日益受到研究者的重视。众所周知，肿瘤细胞外环境（pH 6.0-7.2)）比血液和正常组织（pH 7.4）低而显酸性，核内体及溶酶体中的pH甚至低达5.0-5.5，而氧化锌量子点在pH值为7.4时是稳定的，但当pH值小于5.5时立即分解，转换成可被人体吸收的锌离子。阿霉素可通过与锌离子配位负载到量子点表面，量子点通过细胞内吞作用跨过细胞膜，在核内体或溶酶体内分解以释放阿霉素分子，并最终进入细胞核杀灭细胞。

聚HPMA是一种对身体无害的生物相容高分子，且水溶性好。将阿霉素，喜树碱等药物和HPMA共聚药物的临床试验已进行到三期，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物在体内的稳定性，同时增加药物在肿瘤部位的富集，使药效得到更好的发挥等特点，被作为肿瘤靶向药物载体已应用于临床试验。

甲基丙烯酸（MAA）是一种生物相容性良好的双功能有机分子，通过羧基键合吸附在量子点表面，并且利用双键键合长链的疏水基团，对量子点表面有效地进行修饰。同时长链基团的另一端的羟基,羧基等亲水性基团，可以与生物大分子，如蛋白质和核酸上的官能团发生偶联，对生物分子进行分析。

因此，水溶性好的聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA与聚甲基丙烯酸（PMAA）共聚后包覆ZnO量子点表面，使量子点表面钝化，避免了量子点间的团聚，且消除表面缺陷，从而得到水溶性良好的量子点。另外这使三者的抗肿瘤活性进行叠加，以促进聚合物对肿瘤的抑制作用，同时体现出良好的生物相溶性，以减少对正常组织的伤害，有望为抗癌药物的制备提供更多的选择。

发明内容

本发明的目的是利用N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和甲基丙烯酸(MAA)的性质，提供一种具有水溶性的ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料；

本发明的另一目的是提供一种具有水溶在制备抗肿瘤药中的应用性的ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料的制备方法；

本发明更重要的一目的，就是提供一种具有水溶性的ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料作为药物载体在制备抗肿瘤药中的应用。

一、具有水溶性的ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料的结构

本发明具有水溶性的ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料，是将甲基丙烯酸(MAA)通过RAFT聚合方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）形成的一种生物相容性良好的高分子嵌段共聚物，然后加入氢氧化锂形成聚合物包覆的量子点材料，记为ZnO@PMAA-b-PHPMA，其结构如下：

式中，m=52~60 mol%，n=40~48 mol%；数均分子Mn=4.2×10³~4.9×10³。

高分子载体HPMA，使共聚物体现出良好的生物相容性，从而减少了对正常组织的损害；氢氧化锂的加入促使ZnO晶核的形成，加入的量会影响ZnO的大小和结构；形成的ZnO量子点表面有大量锌离子，对DOX有富集作用；在pH小于5.0时ZnO量子点可以被酸化破坏水解，使得其负载药物到达病灶部位，引发抗肿瘤药物从载体中释放，不仅降低了药物毒性，还能在肿瘤细胞内智能释放抗癌药物，提高药物的生物利用度， 有望应用于肿瘤诊断和治疗方面的研究。

二、ZnO@PMAA-b-PHPMA 量子点纳米材料的制备

（1）甲基丙烯酸锌的制备

将甲基丙烯酸溶于蒸馏水中，加入氧化锌（甲基丙烯酸与氧化锌的摩尔比为1:1.4），于55~60℃反应0.5~1小时，冷却后过滤，并收集澄清溶液；于75~80℃旋蒸澄清溶液得到白色固体，依次用蒸馏水、乙醇洗涤，真空干燥，得到无水白色粉末，即为甲基丙烯酸锌。

（2）RAFT大分子试剂的制备

以N’N-二甲基甲酰胺为溶剂，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)为反应底物，偶氮二异丁腈为引发剂，在RAFT试剂作用下，氮气保护，于60~65℃搅拌反应24~26 小时；产物用无水乙醚中沉淀，干燥，得淡黄色固体，即为RAFT大分子试剂。

所述RAFT试剂为2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸（DMP）其结构式为：

N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺与RAFT试剂的摩尔比为38:1~39:1，引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）的用量为反应物质量总和的5%~20%。

RAFT大分子试剂的结构式如下：

（3）ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的制备：以N^，N-二甲基甲酰胺为溶剂，以甲基丙烯酸锌、RAFT大分子试剂为反应底物，偶氮二异丁腈为引发剂，在RAFT试剂作用，氮气保护下，于60~65℃搅拌反应24~26小时；再加入氢氧化锂的乙醇溶液，继续反应1~2小时，产物用正己烷沉淀，离心后溶于蒸馏水得到澄清溶液，然后转移到透析袋中，用蒸馏水透析48~72小时；透析后的溶液经过冷冻干燥，即得ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点纳米材料。

甲基丙烯酸锌与RAFT大分子试剂的摩尔比为15:1~16:1；引发剂偶氮二异丁腈的用量为反应物质量总和的5%~20%。氢氧化锂的用量为甲基丙烯酸锌摩尔量的1.4~1.6倍。

ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的结构如下：

式中：m=52~60 mol%，n=40~48 mol%；数均分子Mn=4.2×10³~4.9×10³。

图1为上述方法制备的ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，化学位移在3.78 ppm和2.94 ppm左右会出现HPMA上的特征峰-CH-（和-OH相连）和-CH₂（和-NH-相连），在1.72>2-），0.75~1.0>3)。核磁共振氢谱说明成功合成了聚合物PMAA-b-PHPMA，即量子点的亲水外壳。

图2为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的红外吸收光谱图。图2中，在3401cm^-1出现了PHPMA中H-O羟基伸缩振动吸收峰，在1552>-1为PHPMA上N-H的弯曲振动吸收峰，1435cm^-1附近出现了聚甲基丙烯酸-COOH与锌离子配位的伸缩振动吸收峰，2878>-1 和2931>-1处为C-H的伸缩振动吸收峰，485>-1处为Zn-O晶格的特征吸收峰，说明ZnO量子点的形成，同时也表明HPMA和甲基丙烯酸成功聚合到ZnO量子点表面。

图3为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的透射电镜图。通过图3透射电镜观察量子点的形貌与大小，在水溶液中量子点呈现球状结构且均匀分布，显示出了良好的分散性，没有出现大的聚集体，粒径平均粒径约为4 nm。

三、ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点性能测试

1、紫外-可见光谱测试

为了评价该ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的水溶性，测试ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点在水溶液中保存35天的紫外-可见光谱图。如图4所示，在340 nm左右处出现明显的激子吸收峰，340 nm之后，没有明显的吸收峰，说明没有较大粒径ZnO颗粒出现，并且在连续5周内无变化，表明此ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点粒径均匀，且其稳定性和水溶性良好。

2、荧光光谱测试

利用荧光光谱测试制备的ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点水溶液（1 mg/mL）的荧光性能，如图5所示：荧光激发光谱约为340 nm，荧光发射光谱约为520 nm，呈现绿色荧光，这是经典的氧化锌缺陷发光，表明该量子点荧光性能良好。

3、ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的载药性能

（1）载药ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的制备

将ZnO@ PMAA-b-PHPMA量子点的水溶液与阿霉素溶液混合，避光并于室温下搅拌24 h，然后将混合溶液装入透析袋（MWCO=3000）置于蒸馏水中透析3天，得到载药量子点。量子点与蒸馏水的质量体积比为1.0~1.2 mg/mL，量子点和阿霉素的质量比为3.0:1~3.5:1。

（2）载药ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的紫外-可见光谱

图6为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点、阿霉素、载药ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点以及载药量子点分解后的紫外-可见光谱图。从图6可以看出，阿霉素的紫外激发波长位于480 nm处，ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点水溶液和阿霉素混合后，阿霉素从橙红色变成紫色，且激发波长发生红移，说明阿霉素被很好的修饰到ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点表面；而量子点被酸解后，阿霉素从量子点表面脱附，溶液颜色重新变成橙红色，说明阿霉素可以得到很好的释放。

4、体外药物释放性能

通过紫外分光光度计测定阿霉素在480nm处的吸光强度计算载药胶束的药物释放率。以水溶性的ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点为药物载体，选用小分子抗癌药物（盐酸阿霉素），考察了其体外药物释放性能。在人体温度（37℃）下，考察不同pH值下载药ZnO@PMAA-PHPMA量子点的释放性能：取两份3 mL载药量子点水溶液，分别置于100 mL的pH 7.4 （100 mM）的磷酸盐缓冲溶液 与pH 5.0（100 mM） 的醋酸缓冲溶液中透析48小时，按照一定的时间间隔取样，分别测试紫外吸收。结果表明，pH 5.0时，在48 h内阿霉素的累积释放率高达92.5%，而pH 7.4 时，阿霉素的累计释放率仅为10.1 %（见图7），表明在酸性环境下会更好的释放出阿霉素，此ZnO@PMAA-PHPMA 量子点对pH具有高度敏感性。

综上所述，本发明以亲水性的N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺(HPMA)为起始原料，在引发剂的作用下，通过RAFT聚合法制得大分子RAFT试剂，再使大分子RAFT试剂与甲基丙烯酸锌共聚得到聚合物配体分子，然后加入氢氧化锂形成以聚甲基丙烯酸-b-聚(N- (2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺为外壳，ZnO纳米颗粒为核的水溶性量子点纳米材料，一方面可发挥ZnO量子点安全无毒，廉价易得等优点，而在ZnO量子点外表面修饰高分子聚合物，既能对ZnO量子点内核进行很好的保护，同时又能使ZnO量子点稳定存在且易溶于水，很容易进入细胞；另一方面由于ZnO量子点在弱酸性条件下容易分解，从而实现智能释放药物，加上锌离子相对于其他量子点毒性较低，对细胞的杀伤力较小。因此，载药量子点体现出良好的生物相容性，减少对正常组织的伤害，作为药物载体具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的核磁共振氢谱；

图2为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的红外吸收光谱图；

图3为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的透射电镜图；

图4为ZnO@PMAA-b-PHPMA的紫外-可见光谱图；

图5为ZnO@PMAA-b-PHPMA荧光光谱图；

图6为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点、阿霉素、载药ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点以及载药量子点分解后的紫外-可见光谱图；

图7为ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点在pH=5.0和pH=7.4时对药物（盐酸阿霉素）的模拟体外释放曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明具有水溶性ZnO@PMAA-PHPMA 量子点的制备和药物释放性能作进一步说明。

实施例1

（1）甲基丙烯酸锌的制备：将5 mL 的甲基丙烯酸MAA溶于20 mL 蒸馏水中，于60℃搅拌2 小时，然后缓慢加入3300 mg（0.04 mmol）氧化锌，搅拌1 小时，冷却后过滤处理，并收集澄清溶液；将澄清溶液于80℃旋转蒸发，得到白色固体，依次用蒸馏水和乙醇洗涤3次，60℃真空干燥24 小时，得到2.7 g无水白色粉末，即为甲基丙烯酸锌，产率为73%。

（2）RAFT大分子试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将436.0 mg（3.04 mmol）HPMA，25.0 mg （0.15 mmol ） AIBN和30.0 mg （0.08 mmol） DMP溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，即得1.5 g淡黄色固体，即得产物，产率为80%。¹H>6,>2-CH₂-CH₂-)，2.88(s，2H，-NH-CH₂-)，3.65(s，1H，-NH-CH₂-CH-)，7.15(s，1H，-NH>2-)，1.40-2.08>H₂- of polymer backbone)，0.61–1.24>H₃)，1.73(s，6H，-C-CH₃)。

（3）ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的制备：取70 mg（0.02 mmol） RAFT大分子试剂，25.0 mg（0.15 mol） AIBN和71 mg （0.30 mmol） 甲基丙烯酸锌，溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时。然后在氮气保护下缓慢滴加5 mL 氢氧化锂（2 mg，0.47 mmol）的乙醇溶液，继续反应2 小时。产物于正己烷中沉淀，离心后溶于蒸馏水，得到澄清溶液；然后转移到透析袋中，用蒸馏水透析3天。透析后的溶液经过冷冻干燥，得1.35 g ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点，产率为 82.1%。¹H>2O,>2-CH-)，2.94(s，2H，-NH-CH₂-)，1.40-2.08>H₂-of polymer backbone)，0.61–1.24>H₃)。

实施例2

（1）甲基丙烯酸锌的制备：同实施例1；

（2）RAFT大分子试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将438.0 mg（3.06 mmol）HPMA，25.0 mg（0.15 mmol）AIBN和30.0 mg （0.08 mmo l） DMP溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，即得1.7 g淡黄色固体，即为RAFT大分子试剂，产率为83.2 %；

（3）ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的制备：取70 mg （0.02 mmo l）RAFT大分子试剂，25.0mg（0.15 mmol） AIBN和71 mg（0.30 mmol） 甲基丙烯酸锌溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时。然后在氮气保护下缓慢滴加5 mL氢氧化锂（2 mg，0.47 mmol）的乙醇溶液，继续反应2 小时。产物于正己烷中沉淀，离心后溶于蒸馏水，将得到的澄清溶液转移到透析袋中，用蒸馏水透析3天。透析后的溶液经过冷冻干燥，即得1.37 g干燥的ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点，产率为82.6%。

实施例3

（1）甲基丙烯酸锌的制备：同实施例1；

（2）RAFT大分子试剂的制备：在 Schlenk 瓶中，将436.0 mg（3.04 mmol） HPMA，25.0mg （0.15 mmol） AIBN和30.0 mg（0.08 mmol）DMP溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时，产物于无水乙醚中沉淀三次，即得1.6 g淡黄色固体，产率为85.3%；

（3）ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点的制备：取70 mg （0.02 mmol）RAFT大分子试剂，25.0 mg（0.15 mmol）AIBN和74 mg（0.31 mmol）甲基丙烯酸锌溶于5 mL DMF中，抽真空-通氮气反复3次后，密封 Schlenk 瓶，于65℃搅拌反应24 小时。然后在氮气保护下缓慢滴加5 mL 氢氧化锂（2 mg，0.47 mmo l）的乙醇溶液，继续反应2 小时。产物于正己烷中沉淀，离心后溶于蒸馏水，将得到的澄清溶液转移到透析袋中，用蒸馏水透析3天。透析后的溶液经过冷冻干燥，即得 1.2 g干燥的ZnO@PMAA-b-PHPMA量子点，产率为79.5%。