基于LAMP快速检测抗苯并咪唑类杀菌剂的灰霉病菌的方法

摘要

本发明公开了一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的环介导等温扩增引物，LAMP引物组合物由以下4条引物组成：F3、B3、FIP和BIP。上述引物由含灰霉病菌β‑tubulin基因198位点突变区域，错配碱基设计的引物组构成，环介导等温扩增反应用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌。本发明还同时提供了一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的环介导等温扩增方法及所用的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及环介导等温扩增技术(LAMP)检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的引物组及其使用方法，属于植物病害检测、鉴定、防治及抗药性病原菌早期预警的技术领域。

背景技术

灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)属于半知菌类丝孢纲丝孢目葡萄孢属，腐生性强，寄主专化性不强，寄主范围广，可侵染230多种植物。不同寄主植物间的灰霉病菌可交互侵染，属坏死型植物病原真菌，是最早被描述的一类真菌。灰霉病菌主要破坏双叶植物的成熟组织和衰老组织，但也可以在寄主生长初期侵入寄主组织，经过一段长时间的潜伏期后，在环境条件适宜的情况下或者寄主植物生理状况发生变化时，引起组织的迅速腐烂，因此可引起看似健康的作物在收获时或长距离运输时的大量损失。

灰霉病菌因具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，使其极易对杀菌剂产生抗性。以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂是一类作用于真菌微管蛋白的一类杀菌剂，能够抑制孢子芽管分隔和菌丝生长。多菌灵具有高度的选择性和广谱杀菌活性，但随着该类杀菌剂的大量使用，我国已发现了对多菌灵产生高度耐药性的灰霉菌株，并且发现该抗性可稳定遗传。

大量研究结果表明，病原真菌对苯并咪唑类药剂抗性的产生主要是因为第VII连锁群上的β微管蛋白基因(BENA)的点突变，该基因转录翻译的蛋白的第198位谷氨酸点突变成丙氨酸(E198A)，会导致灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂高度抗药性的产生。因此，建立灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性的快速检测技术，在灰霉病菌抗药性治理中显得尤为重要。

植物病原菌的抗药性检测能为植物病害抗药性流行预警、抗药性治理提供重要的参考依据。传统的杀菌剂抗性检测或监测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中常存在杂菌污染，给试验结果带来误差；同时，还需投入大量的人力资源，增加检测成本。聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)也是体外快速扩增特定基因或DNA序列来检测抗药性突变体的最常用方法，灵敏度高，特异性强，但检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的实验过程，且检测时间长，检测成本高昂，不能满足经济、高效、快速检测的需求。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是于2000年由Notomi等首次发明、报道的一种新型、方便快捷、灵敏度极高且廉价的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的个区域设计条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作下，60～65℃恒温扩增，60min左右即可观察结果，具有操作简单、快速、特异性强、产检测便捷等特点。在反应液中添加适当的染料和金属离子，通过指示反应液颜色变化来判断反应结果，加入羟基萘酚蓝(HNB)，在日光灯下通过肉眼即可观察到颜色变化，阳性反应结果会由蓝紫色变成天蓝色。从扩增原理可知，扩增过程中会产生大量大小不一的片段(即茎环DNA、若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构)，当用的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测时，会出现一系列呈梯状的电泳条带。因此，可以利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，来判断是否进行扩增。待测样品为阳性时，会出现呈梯状的电泳条带，反之，不出现呈梯状的电泳条带。

LAMP技术由于简便、快速、准确、廉价、以及不需要特定实验仪器就能快速完成检测，因此特别适合用于田间种植基地等基层部门快速抗药性突变病原菌的检测，为生产中病原菌对药剂抗药性群体发展的动态监测、抗药性植物病害的流行预测及植物病害的综合防控提供用药指导。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的环介导等温扩增方法及所用引物和试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3，SEQ ID NO.2所示的反向外引物TB3，SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP，SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP组成。

本发明的用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的环介导等温扩增引物，由含灰霉病菌β-tubulin基因198位点突变区域，错配碱基设计的引物组构成，环介导等温扩增反应用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌。

本发明还同时提供了一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌环介导等温扩增试剂盒：包含上表所述的LAMP引物组合物。

作为本发明的试剂盒的改进：引物组合浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。

作为本发明的试剂盒的进一步改进：试剂盒还包含环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、4mM MgCl₂、0.6M甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μL>2O。

备注说明：10×ThermoPol Buffer，即，10X ThermoPol Reaction Buffer。

本发明还同时提供了一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型灰霉病菌的环介导等温扩增方法：

25μL反应体系由以下成分组成：8U/μLBst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer 2.5μL、20μMFIP 2.0μL、20μM BIP 2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mMMgCl₂>

即，本发明中，检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系。

作为本发明的环介导等温扩增方法的改进：

利用所述25μL检测反应体系进行LAMP反应，选择以下任一方法：

方法一、在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂，以羟基萘酚蓝(HNB)的颜色变化做为结果判定标准，反应结束后，显色结果观察到天蓝色判断为阳性，即显示检测到苯并咪唑抗药型E198A灰霉病菌(E198A突变型灰霉菌)，蓝紫色判断为阴性，即显示检测菌株为敏感型灰霉病菌，或所含灰霉菌未达检测限；

方法二、取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到苯并咪唑抗药型E198A灰霉病菌，无扩增条带则判断为阴性，即显示检测菌株为敏感型灰霉病菌，或所含灰霉菌未达检测限。

作为本发明的环介导等温扩增方法的进一步改进，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min；80℃灭活10min。

综上所述，本发明提供了检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)引物组合物；本发明还提供该引物组合的应用；本发明还提供一种检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP试剂盒。

本发明的发明方案具体如下：

1、引物的设计和筛选

引物的筛选是LAMP检测的关键因素，首先从灰霉病菌数据库中下载β-tubulin的基因组序列进行比对分析，在包含突变位点的200～300bp序列中，利用在线软件PrimerExplore V4设计突变体LAMP引物，合理设置各组引物的含量、发夹结构形成倾向、自身配对倾向等指标，选择比较优化的组合进行设计，确定正向外引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，再根据突变位点错配正向外引物FIP的3’端碱基，共6条FIP引物，与其他引物组合成六套引物组，然后对这六套引物组进行了筛选。

表1初筛引物信息表

以筛选出能与E198A突变型灰霉病菌反应的LAMP引物为目的，使用未突变的敏感型灰霉病菌DNA为模板，作为阴性对照，以E198A突变型灰霉病菌DNA为模板，作为阳性对照，取1μL DNA溶液，加入24μL由不同LAMP引物所配制反应液进行LAMP反应，反应温度设为64℃，60min；反应后观察反应液颜色变化，常光下，显色结果观察苯并咪唑抗药型E198A灰霉病菌的反应液变成天蓝色，加入敏感型灰霉病菌DNA的反映管呈蓝紫色，则该引物符合实验要求，可继续下一步反应条件优化实验；取5μL扩增产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到苯并咪唑抗药型E198A灰霉病菌，无扩增条带则判断为阴性，即显示检测菌株为敏感型灰霉病菌，或所含灰霉菌未达检测限。若不能区分抗多菌灵的E198A突变型和敏感型灰霉病菌，则该引物不符合实验要求，废弃。

筛选过程为：

设置引物组合为：

所得结果如图1所述，具体为：使用六套引物组S1-S6分别以野生型灰霉菌株(WT)和E198A突变型菌株(E198A)的DNA为模板进行LAMP实验。结果发现，引物组S1以野生型灰霉菌株DNA为模板的反应液仍为蓝紫色，凝胶电泳未检测到条带。以E198A突变型DNA为模板的反应液变为天蓝色，凝胶电泳检测到了梯形条带；引物组S2两个反应液都未变色，仍为蓝紫色，凝胶电泳未检测到条带；引物组S3，S4，S6的两个反应液都变为天蓝色，凝胶电泳都检测到了梯形条带；引物组S5，两个反应液都未变色，但以E198A突变型DNA为模板的反应液凝胶电泳检测到了梯形条带。因此，引物组S1符合我们的要求。

最终筛选出一套稳定性和特异性相对最好的引物组S1，如下述表2所示。

表2、本发明中检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP引物组合物

2、反应程序的优化

以建立能检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP最佳反应温度为目的。利用上述筛选出的相对最佳引物组合，同反应预混液构成检测液，加入E198A突变型灰霉病菌DNA模板1μL，将反应温度分别设置为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，扩增反应结束后，观察反应液颜色变化，近一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。反应结果显示(图3)，在反应温度为65℃时，反应液颜色变化最明显，电泳LAMP条带最清晰。

以建立能检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP最佳反应时间为目的。利用用上述筛选出的相对最佳引物组合，同反应预混液构成检测液，加入E198A突变型灰霉病菌DNA模板1μL，将反应时间设置为15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min，扩增反应结束后，观察反应液颜色变化，近一步用2％琼脂糖凝胶电泳检测作为验证。

反应结果显示(图4)，在反应时间达到60min及更长时，反应液颜色变化明显，电泳LAMP条带清晰，为节省检测时间，即60min为扩增时间。

根据上述反应程序优化结果所述，本发明中反应程序为65℃，60min。

本发明通过对灰霉病菌β-tubulin基因中包含198位突变的200～300bp序列进行LAMP引物错配设计，筛选出特异性强、灵敏度高、适用于LAMP快速分子检测的引物，进而建立可供该菌快速分子检测的技术。本发明以β-tubulin基因错配设计并筛选特异性LAMP引物并进行快速分子检测技术体系和反应条件优化，对E198A突变型灰霉病菌进行LAMP检测，反应过程简便(65℃恒温)、检测周期短(仅需60min)、特异性强、灵敏度高可用肉眼观察检测结果。

本发明与现有技术相比，具有以下技术优势：

1)、实用性好。传统的杀菌剂抗性检测的方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴定是否为抗药性菌株，该方法检测周期较长，从分离到鉴定长达1周，耗时长。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳，需要溴化乙锭(EB)染色并在紫光灯下观察才可判别结果，且检测时间长，检测成本高昂，不能满足经济高效检测的需求。而LAMP反应只需在恒温(65℃)下进行，反应结束后可通过肉眼在常光下直接判断结果，能快速检测出病原菌抗药性，从而增加了其在田间检测的应用价值。

2)、恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，因而便于基层农业生产单位推广应用。LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

3)、准确性高。传统的灰霉病菌抗药性检测技术是在含药培养基上培养鉴定，鉴定方法耗时长、易受人为及环境等诸多因素的干扰。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于普通PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都显著提高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是引物筛选图；

A：引物组合信息；B：LAMP显色变化图C：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；

M表示DL2000DNA Marker；1、3、5、7、9、11代表敏感型灰霉病菌菌株；2、4、6、8、10、12代表E198A突变型灰霉菌株。

图2是LAMP检测不同抗药性灰霉菌株；

A：LAMP显色变化图；B：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL2000DNA Marker；1：敏感型灰霉菌株、2：E198A突变型菌株、3：ddH₂O。

图3是反应温度优化图；

A：LAMP显色变化图；B：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL2000DNA Marker；1：59℃、2：60℃、3：61℃、4：62℃、5：63℃、6：64℃、7:65℃、8：66℃。

图4是反应时间图；

A：LAMP显色变化图；B：琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL2000DNA Marker；1：15min、2：30min、3：45min、4：60min、5：75min、6：90min、7：105min、8：120min。

图5是LAMP灵敏度和PCR灵敏度比较图；

A：LAMP显色变化图；B：LAMP琼脂糖凝胶电泳图；C：普通PCR琼脂糖凝胶电泳图；M表示DL2000DNA Marker；1～13分别表示E198A灰霉菌株DNA浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg、10^-3fg、10^-4fg、10^-5fg。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方法做进一步详细描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、MgCl₂(Sigma)，dNTPs，甜菜碱、ddH₂O、分子质量标准DNA>

实施例1、一种用于检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的LAMP试剂盒：

该试剂盒包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPol Buffer、1mM dNTPs、4mM MgCl₂、0.6M甜菜碱、150μM羟基萘酚蓝(HNB)、8U/μL>2O。

检测溶液共24μL，加入待测DNA模板1μL，构成25μL检测反应体系。体系中含有8U/μL Bst DNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPol Buffer 2.5μL、20μM FIP 2.0μL、20μM BIP2.0μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、25mM MgCl₂>2O补足至25μL。

实施例2、本发明试剂盒通用性考察

选择E198A突变型灰霉菌株，以及敏感型灰霉菌株DNA模板作为阴性对照，ddH₂O作为空白对照，取1μLDNA溶液(浓度为1ng/μL)，加入24μL实施例1中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应液颜色变化，常光下，含有E198A突变型灰霉菌株的样品在常光下应变为天蓝色，敏感型灰霉菌株样品的阴性对照和ddH₂O空白对照的反应液均程蓝紫色，结果见图2。说明本发明引物组合物及由此制备的试剂盒具有很好的通用性。

实施例3、本发明试剂盒灵敏度检测

以检测本试剂盒检测抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的灰霉病菌的灵敏度，将E198A突变型灰霉菌株DNA模板稀释为不同的浓度梯度，分别为：10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL、0.01fg/μL、10^-3fg/μL、10^-4fg/μL、10^-5fg/μL。分别取不同浓度E198A突变型的DNA>

实施例4、本发明试剂盒对不同寄主E198A突变型灰霉菌株特异性检测

用本发明试剂盒对不同寄主E198A突变型灰霉菌株DNA进行检测，取不同灰霉菌株DNA 1μL作为模板(浓度为1ng/μL)，加入24μL实例1中的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min；80℃灭活10min。反应后观察反应液颜色变化。1和2管的模板DNA来自寄主为草莓和番茄的E198A的突变型灰霉菌株，使用本试剂盒能够使反应液由蓝紫色变为天蓝色。3-5管的的模板DNA来自草莓以及6-8管的来自番茄的的敏感型灰霉菌株，使用本试剂盒检测均未变色。结果表明，本发明试剂盒对寄主为草莓和番茄的E198A突变型灰霉菌株具有较好的特异性。

对比例1-1、将F3、B3改成如下内容：

F3-1：CAACTCTCTCTGTCCATCTT

B3-1：GGAGATCTGAGTTAAGTTGAGG

其余内容等同于实施例2。

所得结果为：以模板为E198A突变型灰霉菌株进行试验，不能使反应液变色。即使将DNA模板的浓度增加至1μg/μL，仍然无法有效区分。

对比例1-2、将F3、B3改成如下内容：

F3-2：GTACTCTCTCTGTCCATCAA

B3-2：TTAGATCTGAGTTAAGTTGACC

其余内容等同于实施例2。

所得结果为：以模板为E198A突变型灰霉菌株进行试验，不能使反应液变色。即使将DNA模板的浓度增加至1μg/μL，仍然无法有效区分。

对比例2-1、将BIP改成如下内容：

BIP-1：CAGCAACCCATCTTACGGAGAAAACGGAGACAGGTGGGT

其余内容等同于实施例2。

所得结果为：以模板为E198A突变型灰霉菌株进行试验，不能使反应液变色。即使将DNA模板的浓度增加至1μg/μL，仍然无法有效区分。

对比例2-2、将BIP改成如下内容：

BIP-2：GTGCAACCCATCTTACGGAGAAAACGGAGACAGGTGGTA

其余内容等同于实施例2。

所得结果为：所得结果为：以模板为E198A突变型灰霉菌株进行试验，不能使反应液变色。即使将DNA模板的浓度增加至1μg/μL，仍然无法有效区分。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江农林大学

<120> 基于LAMP快速检测抗苯并咪唑类杀菌剂的灰霉病菌的方法

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F3

<400> 1

caactctctc tgtccatcaa 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物B3

<400> 2

ggagatctga gttaagttga cc22

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物FIP

<400> 3

tctcatgcaa atatcgtaaa gagcctggtt gagaactctg accc44

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物BIP

<400> 4

cagcaaccca tcttacggag aaaacggaga caggtggta39