组蛋白去乙酰化酶‑4抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及组蛋白去乙酰化酶‑4(HDAC4)抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。本发明首先发现HDAC4可能是治疗MM的靶点。然后本发明针对HDAC4基因设计了抑制其表达的siRNA，所述的siRNA可以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，可以诱导细胞凋亡，发生自噬，并导致下游转录因子上调。本发明为多发性骨髓瘤疾病的防治提供了新的靶点，也提供了稳定、有效、低毒的抑制HDAC4表达的、治疗多发性骨髓瘤的生物靶向制剂或药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及组蛋白去乙酰化酶-4抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。

背景技术

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种恶性血液疾病，其特征是骨髓(bonemarrow,BM)中浆细胞异常克隆增殖，分泌大量的单克隆免疫球蛋白或其片段，导致肾脏、骨骼等组织或器官的损伤。MM发病率约占所有恶性血液病的10％，好发于老年人，随着我国人口老龄化的进展，MM发病人数有增加的趋势。常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全或免疫力低下等。目前治疗MM的主要手段有激素、免疫调节剂、烷基类药物、蛋白酶抑制剂等。

在多发性骨髓瘤中，浆细胞恶性增殖产生大量的免疫球蛋白，引起内质网应激，错误折叠蛋白增多，细胞需要自噬来清除这些蛋白质以维持生存，此外骨髓瘤细胞的快速增殖以及免疫球蛋白大量合成，机体能量需求增多，也使得自噬增加，这时自噬可起到保护细胞的作用，但是当外界刺激作用过强时，过度自噬可能会导致细胞凋亡，当错误折叠蛋白超过蛋白酶体和自噬的处理能力时，则造成错误折叠蛋白堆积，出现过度自噬，使得自噬由抑制凋亡向诱导死亡转换(Grandér D,Kharaziha P,Laane E,et al.Autophagy as themain means of cytotoxicity by glucocorticoids in hematologicalmalignancies.Autophagy.2009Nov；5(8):1198-200.)。因此，促进过度自噬可以导致细胞死亡增多，增强临床治疗效果，这提示我们调控细胞自噬(autophagy)及其所诱导的细胞死亡也是MM临床治疗的方向之一。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近来发展日趋成熟的一门基因沉默技术，是内源性或外源性的双链RNA在基因转录后水平上，介导细胞内信使RNA(mRNA)发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制靶基因表达的过程，具有高效性、特异性的特点。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制重要基因的表达，从而达到基因治疗的目的，其对靶基因具有很好特异性及对目的基因抑制作用是其它药物难以匹敌的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对病理性新生血管的RNAi具有广阔的应用前景。

中国专利文献CN104531706A、CN103320444A、CN103882020A分别公开了针对miR-92a、miR-21、miR-155设计的微小反义寡聚核苷酸，可作用于多发性骨髓瘤RPMI-8266细胞株，使其细胞生长显著受到抑制，细胞凋亡明显增加；可用于制备抗多发性骨髓瘤的药物。

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)通过去除组蛋白上的乙酰基调节肿瘤发生进展过程，它们的功能紊乱是肿瘤发生发展的重要分子机制之一，HDAC已经成为包括多发性骨髓瘤在内的多种临床疾病治疗的重要靶点之一。调控细胞的凋亡是组蛋白去乙酰化修饰调控及功能的研究热点，HDAC抑制剂可诱导细胞发生线粒体途径的凋亡，HDAC抑制剂活化caspase-9导致细胞凋亡，还可以上调Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bim等，下调抑凋亡蛋白Bcl-2等。此外，在乳腺癌细胞中，当敲除HDAC时，可以导致自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达增加。

HDAC有很多种类，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3……HDAC12。中国专利文献CN104324025A公开了一种HDAC抑制剂在治疗骨髓瘤中的用途，HDAC抑制剂是N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺或其可药用盐；这个化合物的作用靶点是HDAC6。

HDAC4，也是重要的组蛋白去乙酰化酶之一，在MM中，HDAC4表达水平是否存在异常，调控的下游分子以及HDAC4在细胞自噬及所导致的凋亡中的作用还不是特别清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供组蛋白去乙酰化酶-4(HDAC4)抑制剂的新用途，具体是在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。

本发明的主要技术方案如下：

本发明首先选择多发性骨髓瘤患者外周血浆中进行microRNAs表达谱的分析，结果发现，在MM患者中芯片技术筛选表达差异明显的miRNA，并经qPCR进行验证，发现miR-145-3p在MM中显著低表达，通过进一步的临床应用价值分析，发现miR-145-3p与MM临床重要参数存在显著的相关性，并且具有一定的预后价值。通过miR-145-3p过表达、miR-145-3p沉默等技术进一步发现，在MM细胞中miR-145-3p过表达后，MM细胞凋亡水平增加，自噬水平增加。而转染miR-145-3p的反义RNA 72h后，结果表明：与对照组相比，MM细胞的凋亡水平受到明显抑制，自噬水平降低，这些结果提示miR-145-3p可能通过某种机制参与调控细胞的凋亡与自噬。为进一步了解miR-145-3p的作用机理，本发明发现：过表达miR-145-3p可抑制HDAC4的mRNA和蛋白表达，而后者通过去除组蛋白上的乙酰基调节肿瘤发生，调控细胞凋亡等多种生物学现象；生物信息学及报告基因结果提示HDAC4为miR-145-3p的潜在靶基因，提示HDAC4可能是治疗MM的靶点。

本发明的第一方面，提供了组蛋白去乙酰化酶-4(HDAC4)抑制剂在制备治疗多发性骨髓瘤疾病药物中的应用。

所述的HDAC4抑制剂是包括但不限于：

特异性结合HDAC4的蛋白；

特异性干扰HDAC4基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、反义核苷酸等；

HDAC4的拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的HDAC4抑制剂是指任何可降低HDAC4的活性、降低HDAC4的稳定性、抑制HDAC4的表达、减少HDAC4的有效作用时间、或抑制HDAC4的转录和加工的物质等。

优选的，所述的HDAC4抑制剂选自特异性干扰HDAC4基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸。

本发明的第二方面，提供了一种特异性抑制组蛋白去乙酰化酶4的siRNA，以及该siRNA在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人组蛋白去乙酰化酶4(histonedeacetylase 4,HDAC4)的cDNA序列(GenBank:AB006626.2)，根据siRNA靶序列的基本原则，针对HDAC4设计了三条21个核苷酸的siRNA，其序列如下：

将上述干扰RNA转染进多发性骨髓瘤细胞后发现，HDAC4-siRNA2抑制HDAC4基因表达的干扰效果最明显。

本发明所提供的一种抑制人组蛋白去乙酰化酶的干扰序列HDAC4-siRNA2(简写为siRNA2)，其序列如下：

正义链：5’-GGUUUAUUCUGAUUGAGAATT-3’(SEQ ID NO:3)

反义链：5’-UUCUCAAUCAGAAUAAACCGT-3’(SEQ ID NO:4)

本发明还提供了siRNA2在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。

在本发明的优选例中，所述的药物为药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的HDAC4抑制剂(特别是siRNA)，以及药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明的有益效果是：

本发明针对HDAC4基因表达的siRNA可以抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖，可以诱导细胞凋亡，发生自噬，并导致下游转录因子上调。

本发明siRNA可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制HDAC4表达的、治疗多发性骨髓瘤的生物靶向制剂或药物。

本发明为多发性骨髓瘤疾病的防治提供了新的靶点。

附图说明

图1：hdac4是miR-145-3p发挥调控作用的靶基因。A为结合生物信息学预测分析结果，B为通过荧光素酶报告基因方法验证结果，通过构建野生型和突变型，这些结果发现hdac4是miR-145-3p的潜在靶基因。

图2：HDAC4的siRNA转染MM细胞后转染效率的验证。MM细胞株LP-1转染3个HDAC4-siRNA后，采用定量PCR方法检测HDAC4的mRNA表达水平，结果显示，相对于阴性对照组，设计的3个siRNA分子扰后HDAC4的表达水平显著降低，两者存在显著性差异(p<0.01)，并且以siRNA-2的干扰效率最为显著。采用Western Blot检测HDAC4的蛋白表达水平，结果显示，相对于阴性对照组，HDAC4的表达水平显著降低，两者存在显著性差异(p<0.01)，其中siRNA-2干扰效率最为明显。其中A为HDAC4mRA的qPCR定量结果，B为HDAC4的蛋白表达水平及统计图。

图3：HDAC4干扰后对MM细胞增殖能力的统计图。当采用HDAC4-siRNA转染干扰MM细胞后，相对于阴性对照组，可以抑制细胞增殖。

图4：HDAC4及乙酰化H₃水平均可被miR-145-3p下调。A为MM细胞LP-1转染miR-145-3p类似物(miR-145-3p>3蛋白水平升高。

图5：针对HDAC4为靶点的siRNA或miRNA干扰后对MM细胞凋亡的影响图及统计图，其中A为流式细胞术检测图及其统计图，B为WB检测凋亡相关蛋白相对表达及其统计图。

图6：针对HDAC4为靶点的siRNA或miRNA干扰后对MM细胞自噬的影响图及统计图，为WB自噬相关蛋白相对表达(A)及其统计图(B)。

图7：针对HDAC4为靶点的siRNA或miRNA干扰后对HDAC4下游重要转录因子ATF4的调控作用，为WB检测ATF4蛋白相对表达(A)及其统计图(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、MiR-145-3p作用靶基因的寻找及验证

生物信息学法预测microRNAs的靶基因：利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA靶基因预测网站和软件，对microRNA的二级结构和靶基因进行预测分析，寻找序列匹配程度高、二级结构稳定、靶序列在物种间高度保守的基因进行后续验证。

双荧光报告基因法检测microRNA的靶基因：将靶基因的3'非翻译区(Untranslated Region，UTR)中能与microRNA相互作用的序列克隆至pGL3质粒中荧光素酶的3'UTR，构建重组的荧光素酶报告基因质粒。将其与表达相应microRNA的pSuper载体按一定的比例共转293T细胞。24小时后裂解细胞，采用双荧光报告基因检测系统检测荧光素酶的表达量，从而反映microRNA在离体体系中能否调控靶基因表达。

Western Blot方法检测蛋白表达水平：采用western blot方法检测在MM细胞中miR-145-3p作用后HDAC4的蛋白表达水平以及乙酰化H3(Acetyl-H3)的蛋白相对表达水平，内参为GAPDH或者tubulin。

qPCR检测HDAC4及miR-145-3p的mRNA水平：通过设计特异性的引物，利用qPCR方法检测MM患者骨髓中HDAC4及miR-145-3p的mRNA水平，然后进行相关性分析。其中HDAC4特异性的引物序列如下表1，反应条件如下：

表1 HDAC4扩增引物序列

反应条件为：95℃1分钟；95℃30秒，58℃20秒，70℃20秒循环40次；95℃15秒，60℃15秒，95℃15秒。

通过生物信息学分析及荧光素酶报告基因，发现HDAC4是miR-145-3p的潜在靶基因，具体结果见图1A、图1B。MM细胞LP-1转染miR-145-3p类似物(miR-145-3p mimic)后，相对于对照组，HDAC4蛋白表达减少(图4A)。进一步相关性分析发现，在MM中miR-145-3p的表达水平与HDAC4的表达水平呈显著的负相关(图4B)。我们进一步分析了过表达miR-145-3p后，乙酰化H3(Acetyl-H3)的表达水平，结果发现Acetyl-H3(lys9/14,lys18)的水平升高(图4C)。这些结果提示HDAC4是miR-145-3p的靶基因。

实施例2：siRNA的设计、合成及抑制效率验证

检索NCBI GeneBank得到HDAC4全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对HDAC4进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。

本实施例设计并合成的siRNA序列如下，委托广州锐博生物技术有限公司合成：

3条siRNA的抑制效率用以下方法进行验证：

1、细胞转染siRNA

调整MM细胞株LP-1细胞(购自购自中科院细胞所)为最佳状态，计数后调整浓度，细胞密度为1x10⁵/ml；吸取>

2、HDAC4mRNA水平检测

总RNA提取：收集细胞至1.5mL无RNA酶离心管中，加入0.5mLTrizol，在冰上充分混匀吹打，静置10min。加入0.125mL氯仿，剧烈振荡20s，冰上静置5min。4℃离心，12000r/min×15min，吸取0.2mL上清至另一个1.5mL,进而加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10min。4℃离心，12000r/min×15min，弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，12000r/min×15min。弃上清，晾干，溶于20μLDEPC水中。多功能酶标仪测定提取RNA的浓度和纯度。

3、HDAC4蛋白表达水平检测

采用western blot方法检测3条siRNA作用后HDAC4的蛋白表达水平，通过电泳、转膜、一抗孵育、二抗孵育后曝光检测HDAC4的蛋白相对表达水平，内参为GAPDH。

实验结果：qPCR结果和western blot结果显示，无论是mRNA水平，还是蛋白表达水平，siRNA1可以将HDAC4表达抑制掉30％左右；siRNA2可以将HDAC4表达抑制到50％以上，siRNA3可以将HDAC4抑制掉30％左右，具体结果见图2A和图2B。

因此，本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制HDAC4表达效果最显著的siRNA2进行进一步的实验，下述实施例的HDAC4-siRNA均为siRNA2。

实施例3：HDAC4干扰后对MM细胞增殖能力的调控

通过转染HDAC4-siRNA，观察干扰HDAC4对细胞增殖情况的调控，实施过程如下：

(1)收集对数生长期LP-1细胞，以每孔20000个的密度接种于96孔板。

(2)利用RNAimax转染试剂介导转染，72h检测细胞增殖情况。

(3)每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后，用多功能酶标仪在560nm波长检测各孔吸光度值。

(4)实验重复3次，

实验结果显示，相对于阴性对照组，转染HDAC4-siRNA组的细胞的吸光度值显著降低，其中阴性对照组为0.8±0.09，而转染NC-siRNA组仅为0.4±0.05，两组存在显著性的差异(p<0.01)，具体结果见图3。

实施例4：HDAC4干扰后对MM细胞凋亡的调控作用

通过转染HDAC4的抑制剂HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics，观察干扰HDAC4对细胞凋亡的调控作用，选取MM细胞LP-1，调整细胞浓度后，实验分组，设立HDAC4-siRNA组(A组)、miR-145-3p mimic组(B组)以及两组相应的对照组，实施过程如下：

1、细胞转染

HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics：具体实施同实施例2，作用72h后观察细胞凋亡情况。

2、流式细胞术利用Annnexin-V试剂检测细胞凋亡率

(1)收集200ul细胞悬液至2ml离心管中，1200rpm，离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞。

(2)1200rpm，离心5分钟，弃上清，加入1×binding buffer重悬细胞。

(3)1200rpm，离心5分钟，弃上清，加入100μl的1×binding buffer重悬细胞，吸取5μl Annexin V-FITC凋亡试剂，轻轻混匀。

(4)在室温(20-25℃)下，放入工作台抽屉避光孵育15分钟，然后加入1×bindingbuffer，重悬细胞。

(5)1200rpm，离心5分钟，弃上清，加入200μl 1×binding buffer轻轻重悬细胞。

(6)进行流式细胞仪检测(可于4℃避光封口保存4小时，不影响检测结果)，其中Annexin V-FITC为FL-1通道。

(7)用流式软件Flowjo 7.5进行数据分析。

3、采用Western Blot检测凋亡相关蛋白

具体方法同实施例2中的Western Blot部分。

结果显示，流式检测结果发现，相对于对照组，无论是HDAC4-siRNA还是miR-145-3p mimic均可显著诱导MM细胞凋亡，但HDAC4-siRNA与miR-145-3p mimic之间诱导细胞凋亡的作用无显著性差异，具体结果见图5A，同样凋亡相关蛋白的检测结果提示，在HDAC4-siRNA还是miR-145-3p mimic这两组间同样存在类似结果，具体结果见图5B，这些结果提示无论是siRNA还是miRNA分子干扰HDAC4后均可以诱导MM细胞凋亡增强。

实施例5：HDAC4干扰后对MM细胞自噬的调控作用

通过转染HDAC4的抑制剂HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics，观察干扰HDAC4对细胞自噬的调控作用，选取MM细胞LP-1，调整细胞浓度后，实验分组，设立HDAC4-siRNA组(A组)、miR-145-3p mimic组(B组)以及两组相应的对照组，实施过程如下：

1、细胞转染

HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics：具体实施同实施例2，作用72h后观察细胞自噬情况。

2、细胞自噬情况检测

采用Western Blot方法检测自噬相关蛋白的表达，具体实施同实施例2中的Western Blot部分。

通过上述Western Blot实验检测A组和B组中LC3、P62、beclin-1等自噬相关蛋白表达。结果发现，不管是HDAC4的siRNA还是miRNA抑制剂miR-145-3p均可以诱导细胞自噬，并且两组间无显著性差异，具体结果见图6。这些结果提示无论是siRNA还是miRNA分子干扰HDAC4后均可以诱导MM细胞自噬增强。

实施例6：HDAC4干扰后对下游转录因子ATF4的调控作用

通过转染HDAC4的抑制剂HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics，观察干扰HDAC4对游转录因子ATF4的调控，选取MM细胞LP-1，调整细胞浓度后，实验分组，设立HDAC4-siRNA组(A组)、miR-145-3p mimic组(B组)以及两组相应的对照组，实施过程如下：

1、细胞转染

HDAC4-siRNA及miR-145-3p mimics：具体实施同实施例2，作用72h后收集细胞。

2、下游转录因子ATF4的表达情况

采用Western Blot方法检测ATF4蛋白的表达，具体实施同实施例2中的WesternBlot部分。

我们通过过表达HDAC4的miRNA抑制剂-miR-145-3p和HDAC4-siRNA后，收集细胞，结果发现过表达miR-145-3p与HDAC4干扰均可以诱导上调ATF4蛋白表达量，两者无显著性的差异(P>0.05)，具体结果见图7。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。