一种琥珀酰芒柄花苷及其在制备心血管疾病药物方面的应用

摘要

本发明公开了以下式(1)所述的琥珀琥珀酰芒柄花苷及药学上可接受的盐为活性成分的药物，及其在制备心血管疾病药物方面的应用，特别涉及一种琥珀酰芒柄花苷及药学上可接受的盐在制备抗心肌缺血药物方面的应用，属于医药技术领域。本发明所提供的琥珀酰芒柄花苷作为一种新的芒柄花苷衍生物水溶性高、毒性低在心血管疾病尤其是心肌缺血疾病方面具有显著疗效，为心血管疾病提供了新的药物选择。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种琥珀酰芒柄花苷及药学上可接受的盐在制备心血管疾病药物方面的应用，特别涉及一种琥珀酰芒柄花苷及药学上可接受的盐在制备抗心肌缺血药物方面的应用。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoids compounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。近年来，黄酮类化合物的研究进入了一个新的层次，随着对其构效关系的深入研究，发现了部分药理作用的作用机制，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了黄酮类化合物的开发利用。

芒柄花素作为具有代表性的黄酮类化合物之一可以通过调节血管张力，起到调节血压的作用，从而对相关心血管疾病进行有效的预防和治疗。然而芒柄花素的水溶性较低，这在一定程度上限制了芒柄花素的使用。而芒柄花素的糖基化产物——芒柄花苷及衍生物具有较高的水溶性。同时，芒柄花苷是中药黄芪、甘草、红芪、葛根等药材中黄酮类化合物的代表性成分，具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中NO浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性(张蔚,等.药学学报,2014,49(8):1162-1168)。芒柄花苷可以实现有效预防心血管疾病、调节肠道环境等功能。徐风等利用芒柄花苷制备血管舒张药物(CN 104107184 A)，在其工作中芒柄花苷通过植物组分分离而得成本高，纯化步骤繁琐，且分离的结构毒性较大。如何制备高效、低毒的芒柄花苷药物是本发明的关键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题提供一种琥珀酰芒柄花苷化合物，及其在制备治疗心血管疾病药物方面的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种琥珀酰芒柄花苷，所述的琥珀酰芒柄花苷具有下式(1)所示的结构：

为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：一种治疗心血管疾病药物，包括活性成分为式(1)所示的琥珀酰芒柄花苷，以及药学上可接受的药用辅料。

优选的，包括活性成分为为式(1)所示的琥珀酰芒柄花苷或其盐，以及药学上可接受的药用辅料组合制成临床适用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。

优选的，琥珀酰芒柄花苷盐指琥珀酰芒柄花苷与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、烷基或芳基磺酸形成的盐。

为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：所述的琥珀酰芒柄花苷在制备心血管疾病药物的用途，所述心血管疾病包括心绞痛、心肌梗塞、心肌缺血、心力衰竭以及心律失常。

优选的，所述心血管疾病为心肌缺血。

本发明所述式(1)化合物，由解淀粉芽孢杆菌FJ18(保藏编号为CCTCC NO：M2016272)在非水相中制备琥珀酰芒柄花苷而得，反应化学式见下式：

合成方法为：以芒柄花素和糖基供体为原料，在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，芒柄花素7位酚羟基发生糖基化反应，形成芒柄花素-7-O-葡萄糖苷；芒柄花素-7-O-葡萄糖苷继而在解淀粉芽孢杆菌FJ18的催化作用下，葡萄糖基5位羟基发生琥珀酰化，形成琥珀酰芒柄花苷。具体分为以下步骤：

步骤(1)：将解淀粉芽孢杆菌FJ18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获 得湿菌体；

步骤(2)：以芒柄花素和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；

步骤(3)：将步骤(1)湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。

所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/L，pH为8.0。所述的原料溶液，其组分中，芒柄花素的浓度为0.01～0.5g/L，糖基供体的溶液浓度为5～50g/L，非水相溶剂体积百分比为5～20％。所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇。所述的糖基供体选自麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一种。所述的糖基供体为蔗糖或乳糖。

本发明所述琥珀酰芒柄花苷作为新化合物，此前未有报道。

本发明研究琥珀酰芒柄花苷对急性心肌缺血损伤小鼠的保护作用，以此来验证式(1)所述的琥珀酰芒柄花苷及药学上可接受的盐在制备心血管疾病药物方面的应用，尤其是在心肌缺血疾病中的应用。方法为昆明小鼠70只，雌雄各半，分为7组：空白组、模型组、阳性药组、琥珀酰芒柄花苷(20mg/Kg)组、琥珀酰芒柄花苷高、中、低(40、20、10mg/Kg)剂量组，小鼠进行灌胃给药10天，空白组、模型组给予生理盐水，阳性对照组给予普萘洛尔(20mg/Kg)，于给药第8、9、10天腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)10mg/Kg，末次给药2h后，进行实验，眼眶取血并摘取心脏，检测血淸中氧化还原指标，多聚甲醛灌注后对心脏进行HE染色，观察心肌组织变化。小鼠ISO造模后，小鼠心肌组织损伤明显，血清中过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，乳酸脱氢酶(LDH)活性增加；琥珀酰芒柄花苷给药后，与缺血模型组比较，琥珀酰芒柄花苷能显著改善小鼠心肌组织损伤，降低LDH活性，提高CAT及SOD活力(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。琥珀酰芒柄花苷对急性心肌缺血损伤小鼠具有显著、低毒的保护作用。

有益效果：

1.本发明提供了一种新化合物即式(1)所述的琥珀酰芒柄花苷；

2.本发明所提供的琥珀酰芒柄花苷作为一种新的芒柄花苷衍生物水溶性高、毒性低在心血管疾病尤其是心肌缺血疾病方面具有显著疗效，为心血管疾病提供了新的药物选择。

附图说明

图1是琥珀酰芒柄花苷的¹H>

图2是琥珀酰芒柄花苷的¹³C>

图3是琥珀酰芒柄花苷的HMBC谱图。

图4是琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠心肌组织病理形态学的影响

图5是琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中SOD活性的影响

图6是琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中SOD活性的影响：

本发明的解淀粉芽孢杆菌FJ18(Bacillus amyloliquefaciens FJ18)已经于2016年5月20日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：M2016272。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

实施例1

非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的菌株的筛选与菌种鉴定

取约1g土样，加入到盛有20mL筛选培养基的三角瓶中，30℃，180r·min^-1水浴振荡培养24h，再以5％接种量转接3次。将培养菌液适当稀释后，以LB平板培养基稀释涂布，于30℃培养24h，观察菌落形态，然后挑取单菌落在LB平板培养基进行划线分离获得单克隆，对筛选获得的菌株编号并于超低温冻存保藏。

以蔗糖为耐有机溶剂菌的生长碳源，加入20％(v/v)二甲基甲酰为筛选压力，从受化工污染的土样中筛选分离获得耐有机溶剂极端微生物。

LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0；LB平板培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L。

筛选培养基组成为：芒柄花素0.5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，蔗糖20g/L，DMSO 10％(v/v)，初始pH 7.0。

将保藏的菌株，从冻存管接种到LB平板培养基，于30℃，培养24h后接种到筛选培养基中(40mL培养液/250mL三角瓶)，于30℃，200rpm条件下培养24h，观察培养基中的荧光变化，并分别取0，12，24h的样品进行HPLC检测。 反应后，经HPLC检测，获得4株具有生物转化芒柄花素的耐有机溶剂菌株。其中一株菌株具有糖基化结构修饰芒柄花素及琥珀酰基化结构修饰芒柄花苷的能力，所获琥珀酰基化的芒柄花苷产物单一，优化后此菌株对底物芒柄花素的转化率达94.2％。

该菌株在肉汤培养基中生长24h后，菌落大小直径为1.8mm～2.8mm，生长温度范围为20℃～37℃，最适生长温度为30℃，生长pH范围为7.0～9.0，最适生长pH为8.0。菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色表明此菌株为革兰氏阳性菌。通过16SRNA同源性鉴定及系统发育分析，鉴定此菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌FJ18。

实施例2

解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵及静息细胞的制备

将解淀粉芽孢杆菌FJ18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，pH7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/L，酵母粉15g/L.KH₂PO₄>2>

实施例3

将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、芒柄花素、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，芒柄花素0.5g/L，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/L，磷酸缓冲的pH 8.0，蔗糖浓度为50g/L。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，HPLC检测分析测得芒柄花素转化率为97.2％。

产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱用1L乙醇冲洗，再用蒸馏水洗至无醇味；接行酸碱处理，即先后用体积分数5％的HCl溶液与质量分数2％的NaOH溶液分别以2BV/h流速通过树脂柱，并静止置2～4h后，用蒸馏水洗至pH值中性。为避免DMSO溶解转化产物降低上样吸附率，所以转化液用5倍体积的去离子水 (pH4.0，冰醋酸调节)稀释至DMSO<2％后加样。加样量20mg/g湿树脂，加样流速20mL/min。用10倍柱床体积的去离子水(pH4.0，冰醋酸调节)淋洗过量未反应的糖基供体(蔗糖)，直到洗脱液用浓硫酸检测不出糖为止，流速20mL/min。选用甲醇加去离子水作流动相进行洗脱，调整甲醇和去离子水的体积比，在洗脱流速20mL/min时，确定洗脱液中甲醇比例。浓缩干燥：经HPLC检测，合并洗脱液，用旋转蒸发仪对其减压真空浓缩，加热温度40℃。最后将固体置于真空干燥箱中，40℃干燥6h。

解淀粉芽孢杆菌FJ18非水相中制备琥珀酰芒柄花苷的反应化学式见下式：

经核磁共振质谱分析鉴定从NMR图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了葡萄糖基化的芒柄花素，即琥珀酰芒柄花苷。琥珀酰芒柄花苷的核磁共振波谱数据为：

¹H-NMR(MeOH-d6,600MHz)δ：8.39(1H,s，2-H),8.07(1H,d,J＝8.9Hz，5-H),7.52(2H,d,J＝8.6Hz，2'and>3),2.47-2.57(4H,m,2”'and>

¹³C>3)28.7(C-2”'),28.7(C-3”')。

实施例4

本发明的琥珀酰芒柄花苷在心肌缺血疾病方面的应用

选70只昆明小鼠，雌雄各半。氧化还原试剂盒由南京建成生物工程研究所购买。实验分组及给药分为7组：空白组、模型组、阳性药组、芒柄花素(20mg/Kg) 组、琥珀酰芒柄花苷高、中、低(40、20、10mg/Kg)剂量组，每组10只小鼠进行灌胃给药10天，空白组、模型组给予生理盐水，普萘洛尔(20mg/Kg)，于给药第8、9、10天腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)10mg/Kg，末次给药2h后，进行实验，小鼠眼眶取血，立即取出心脏、肾脏、肝脏冷冻保藏，用于HE染色的心脏组织用4％的多聚甲醛固定保存。

血清LDH、SOD活性及MDA含量的测定：小鼠眼眶取血后，3000转/min 4℃离心10min，取血清，测相关氧化还原指标，具体操作按试剂盒说明书进行。

观察心肌病理改变：对心脏进行HE染色，观察心肌组织变化。

统计学方法：计算数据资料以表示，应用SPSS统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用T检验，检验水准为α＝0.05.

琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠心肌组织病理形态学的影响光镜下显示，空白组小鼠心肌纤维排列整齐，横纹清晰，胞核明显，无水肿及炎细胞浸润。模型组小鼠心肌组织损伤明显，心肌细胞空泡变性，横纹消失，细胞核内移，有片状坏死状，严重炎细胞浸润和心肌间质水肿。与模型组比较，芒柄花素琥珀苷能明显改善心肌损伤，横纹可见，间质水肿改善明显；小鼠心肌组织中可见轻度心肌间质水肿，少量炎细胞浸润。其中，以高、中剂量组对心肌缺血损伤改善最为明显。下图4为琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠心肌组织病理形态学的影响(×200)：

琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中SOD活性的影响。空白组相比，模型组小鼠血清中SOD活性明显下降(P<0.01)，与模型组相比，阳性组和苷元组SOD活性显著升高(P<0.05,P<0.01)，琥珀酰芒柄花苷给药后小鼠血清中SOD活性显著升高(P<0.01,P<0.0001)。下图5琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中SOD活性的影响：

琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中LDH活力的影响。与空白组比较，模型组小鼠血清LDH活性显著升高(P<0.01)，表明造模成功；与模型组相比，阳性药和苷元均能显著降低LDH活性(P<0.01,P<0.05)，琥珀酰芒柄花苷也能降低LDH活性，但只有高剂量才有显著性差异(P<0.01)。下图6琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中SOD活性的影响：

琥珀酰芒柄花苷对ISO诱发心肌缺血小鼠血清中CAT活力的影响。空白组 相比，模型组小鼠血清中CAT活性明显下降(P<0.05)，与模型组相比，阳性药和苷元均能升高CAT活性，但差异没有统计学意义；琥珀酰芒柄花苷给药后小鼠血清中CAT活力升高，高剂量琥珀酰芒柄花苷可显著提高CAT活力(P<0.05)。

实施例5

片剂的制备

处方(以1000片的处方量计)：

实施例3中所得琥珀酰芒柄花苷纯品60g；

蔗糖60g；

玉米淀粉80g；

硬脂酸镁2g。

制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。平均片重202mg/片，活性成分含量为60mg。

实施例6

注射液的制备

处方：(以1000支的处方量计)

实施例3中中所得琥珀酰芒柄花苷纯品10g；

丙二醇100g；

注射用水加至1000ml。

将处方量的琥珀酰芒柄花苷纯品溶解于丙二醇中，加注射用水至1000ml，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，制成1ml/瓶注射液，活性成分含量为10mg/mL。