功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，公开了一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。所述药物组合物包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸。这种组合物抗肿瘤的作用效果优于每种成分单独使用时的作用，对细胞的抑制作用更明显，因此可以将这种联合用药物用于治疗肿瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命。近年来，我国的肿瘤发病率呈逐年上升趋势。因此抗肿瘤研究也已经成为当今生命科学、医学和药物学等多个学科研究领域中意义重大的热点内容。

目前肿瘤临床治疗面临的最大难题之一是肿瘤细胞对治疗药物逐渐产生耐药性，从而导致治疗失败。根据抗肿瘤药的作用机制和肿瘤细胞增殖动力学进行合理的联合用药，是近年来肿瘤化疗领域的重要进展之一，也是克服肿瘤耐药的有效方法之一。不同作用机制的抗肿瘤药物合用，往往能够增强疗效且减少用药量，较大程度地减轻化疗药物带来的不可避免的毒副作用，为肿瘤临床治疗提供更为有效先进的方案，并同时达到减轻患者痛苦的目的。相较于抗肿瘤药物单用，联合用药具有减轻化疗毒副作用，增加化疗疗效，避免或者减少肿瘤耐药的发生等优越性，因而成为半个世纪以来国内外临床治疗肿瘤的主要手段之一。联合用药的主要指导原则之一，是将不同机制的药物联用，从不同靶点不同方面杀伤肿瘤，达到治疗肿瘤的目的。

红曲是以稻米为原料，利用真菌红曲霉Monascus>经固态发酵而成的天然产品，它因具有良好的降血脂功能而备受国内外消费者的青睐。红曲主要代谢产物洛伐他汀（Lovastatin ，又名Monacolin K）是其主要的药效成分，能够抑制胆固醇合成过程中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶，从而调节脂肪代谢。HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成初期阶段的限速酶，洛伐他汀竞争性地抑制HMG-CoA还原酶，导致甲羟戊酸的合成减少从而抑制胆固醇的生物合成。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该药物组合物包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸，两者联合应用产生协同抗肿瘤作用，进而能更为有效的治疗肿瘤，同时降低毒副作用。

本发明的具体技术方案为：一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物，所述药物组合物包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸（DHA）。其中功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸可以为任意比例。

本发明人通过长期研究发现，洛伐他汀通过影响胆固醇合成途径而在体外能够抑制包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞等多种肿瘤细胞的生长。二十二碳六烯酸（DHA）是一种对人体非常重要的不饱和脂肪酸，属于ω-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员。海洋鱼类，某些海藻或低等真菌是DHA的重要来源，含有DHA的Lovaza胶囊目前被美国食品药品管理局（FDA）批准为饮食辅助药物以降低成年患者的甘油三酸脂水平。

本发明的抗肿瘤的功能性红曲提取物和DHA药物组合物，其特点在于以洛伐他汀为主要活性成分功能性红曲提取物自身具有抗肿瘤效果，还能够增强DHA抗肿瘤效果。其中以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物与DHA联合使用，达到协同抑制肿瘤细胞增殖的效果。

进一步地，所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物是从功能红曲中提取的；所述二十二碳六烯酸是自然提取或化学合成修饰的。

进一步地，所述二十二碳六烯酸和功能性红曲提取物作为联合制剂供同时、分别或者按顺序使用。

进一步地，所述功能红曲，是以大米为原料，利用真菌红曲霉经固态发酵而成的天然产品。

进一步地，所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，其洛伐他汀含量为0%-99.99%。

进一步地，所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，是以功能红曲为原料，利用溶剂提取获得的，所述溶剂选自水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、乙醇水（0%-100%，最优为40%—80%）、甲醇水（0%-100%，最优为40%—80%）等。

进一步地，所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，为加热提取、浸泡提取或经初步柱色谱得到。

进一步地，所述功能性红曲提取物与二十二碳六烯酸共同制成以下形式的药物：散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、粉针、乳剂、脂质体、混悬剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、气溶胶、粉雾剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、栓剂、滴剂或滴丸剂。

本发明还公开了上述的功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所治疗的肿瘤疾病包括良性肿瘤和恶性肿瘤。包括白血病、淋巴瘤、皮肤癌、肉瘤、乳腺癌、肝癌、肺癌、神经胶质瘤或成胶质细胞瘤中的任意一种。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明的药物组合物进行了体外人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞的细胞毒作用实验，结果显示，在MCF-7、MDA-MB-231细胞实验中，以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物能明显增强DHA的细胞毒作用，比单独使用功能性红曲提取物或者DHA对细胞的抑制作用更明显，同时凋亡检测实验结果显示功能性红曲提取物和DHA合用能协同诱导乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞凋亡，表明功能性红曲提取物和DHA联合用药增强了功能性红曲提取物的抗肿瘤效果。

附图说明

图1：功能性红曲提取物和DHA合用抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖；

图2：功能性红曲提取物和DHA合用抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖；

图3：功能性红曲提取物和DHA合用诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡；

图4：功能性红曲提取物和DHA合用诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡；

图5：功能性红曲提取物和DHA合用诱导凋亡相关蛋白PARP的裂解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1：细胞增殖实验

采用SRB比色法，考察功能性红曲提取物和DHA联合用药体外抑制乳腺癌细胞增殖能力的作用，并计算抑制率。

实验方法：

1）将肿瘤细胞按3000-5000个细胞/孔接种于96孔板中。

2）24小时后，分别加入不同浓度的功能性红曲提取物和DHA（倍半稀释，设置6个浓度），以及相对应的混合液，每个浓度重复3孔。

3）72小时后，每孔加入50 μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。 待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4% (w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制) 70 μL，染色30 min后倒掉染液，用1% (v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。 用100 μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪515 nm处测定光吸收值。

4）以0 μmol/L 药物作为对照组，其细胞存活率为100 %，其余各组按：存活率＝(各浓度组吸光值/ 对照组吸光值)×100 %与之比较，作图。

实验结果：

如图1、图2所示，功能性红曲提取物抑制乳腺癌细胞生长，当与DHA联合使用时，这种抑制效果显著增强（方块实线）。

实施例2：细胞凋亡实验

采用PI单染和Annexin-V/PI双染法，对DHA和功能性红曲提取物联合用药体外促肿瘤细胞凋亡的能力进行考察。

实验方法：

1）将肿瘤细胞按300000-500000个细胞/ 孔接种于6孔板中；

2）24小时后，分别加入相应浓度DHA和功能性红曲提取物以及混合液；

3）24小时后，收集细胞，用Annexin-V室温避光染色15分钟；

4）再用PI室温避光染色5分钟；

5）流式细胞仪收集10000个细胞进行分析，得到早期凋亡（PI^-AV⁺）和晚期凋亡（PI⁺AV⁺）百分率，两者相加得到总的凋亡率。

实验结果：

如图3、图4所示，DHA和功能性红曲提取物合用增加诱导乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡的能力。合用组和单用组相比凋亡率显著上升。

实施例3：免疫印迹分析 (Western Blot)

采用Western Blot 的方法考察凋亡通路重要蛋白PARP的变化情况，从而从蛋白水平反映功能性红曲提取物和DHA合用诱导凋亡的能力。

实验方法：

1）将肿瘤细胞按300000-500000个细胞/孔接种于6孔板中；

2）24小时后，分别加入相应浓度的DHA和功能性红曲提取物以及混合液；

3）药物作用6、12、24小时后，收集细胞，PBS洗涤，加入50 μL预冷细胞裂解液4℃裂解40min；

4）经蛋白定量后，将40μg样品加入等量上样缓冲液，经10％SDS-PAGE电泳后，用电转移仪转至PVDF膜上；

5）加入PARP和GAPDH特异性抗体4℃孵育过夜。荧光标记二抗，室温孵育1h。扫描后分析结果。

实验结果：

如图5所示，DHA和功能性红曲提取物合用显著引起MCF-7细胞凋亡通路重要蛋白PARP的裂解。

实施例4 ：功能性红曲提取物提取

取功能性红曲100 g，常温下用乙酸乙酯（质量体积比1:4）浸泡24小时，重复3次，分别倒出上清液并用纱布过滤，合并3次浸出液浓缩得乙酸乙酯提取物，最终得乙酸乙酯提取物4.7 g。

实施例5

一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物，包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸，质量比为5:5。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物是从功能红曲中提取的；所述二十二碳六烯酸是自然提取的。

所述功能红曲，是以大米为原料，利用真菌红曲霉经固态发酵而成的天然产品。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，其洛伐他汀含量为50%。

实施例6

一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物，包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸，质量比为1:9。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物是从功能红曲中提取的；所述二十二碳六烯酸是化学合成修饰的。

所述功能红曲，是以大米为原料，利用真菌红曲霉经固态发酵而成的天然产品。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，其洛伐他汀含量为99.99%。

实施例7

一种功能性红曲活性成分与二十二碳六烯酸的药物组合物，包含以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物和二十二碳六烯酸，质量比为9:1。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物是从功能红曲中提取的；所述二十二碳六烯酸是自然提取的。

所述功能红曲，是以大米为原料，利用真菌红曲霉经固态发酵而成的天然产品。

所述以洛伐他汀为主要活性成分的功能性红曲提取物，其洛伐他汀含量为1%。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

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