一种载抗菌肽基因的药物递送系统及构建和应用

摘要

本发明的目的在于提供一种以牛抗菌肽BMAP28为治疗基因的药物递送系统、包括基因表达载体、药物递送载体及其制备方法与应用。它是利用分子克隆技术，包括PCR技术、点突变技术和酶切插入连接等，构建携带有BMAP28基因的分泌型真核表达质粒。将裸质粒DNA用壳聚糖纳米粒包封，制备成载抗菌肽基因的壳聚糖纳米递送系统。本发明的药物递送系统可有效介导基因药物在真核细胞中表达并分泌到胞外，对奶牛乳腺炎具有较好的疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程制药领域，具体涉及一种抗菌肽基因融合表达质粒的构建和载基因递送系统的制备。

背景技术

奶牛乳腺炎(mastitis)是严重危害成乳奶牛的一种乳腺疾病，可由多种病原微生物感染引起。长期以来，抗生素作为治疗奶牛乳腺炎的常规药物被广泛使用，导致耐药菌株不断出现，传统抗生素逐渐失去治疗作用，开发新型抗菌药物已成为临床上迫切需要解决的问题。

抗菌肽(antimicrobial peptide)是一类具有广谱抗微生物作用的小分子多肽。与传统抗生素通过干扰细菌代谢而发挥抗菌作用不同，抗菌肽主要通过干扰细菌细胞壁合成和破坏细胞壁的完整性而杀灭细菌，这一杀菌机制很难诱导细菌对抗菌肽产生耐性。因而，基于抗菌肽的新型抗菌药物开发持续成为制药领域的研究热点。然而，由于人工合成抗菌肽价格高昂，且外源性给予抗菌肽可被体内蛋白酶降解而失活，阻碍了抗菌肽在临床上的应用。

近年来，以质粒DNA作为生物药剂的基因治疗显示出了巨大的应用潜力，并在一些人类疾病的治疗中已得到成功应用，其有效性和安全性也得到了普遍认同。在奶牛疾病治疗领域，有研究者曾尝试利用携带有人溶菌酶基因的裸质粒治疗乳腺炎，取得了一定疗效。由于裸质粒DNA很容易被体内核酸酶降解，且裸质粒DNA很难进入细胞内表达，以裸质粒DNA作为治疗手段存在很大局限性。成功的基因治疗要求质粒DNA能被有效地递送到细胞内表达。在基因治疗领域，目前常用的基因递送载体包括病毒载体和非病毒载体两类。相对于病毒载体而言，非病毒载体具有低毒、低免疫原性和制备方便等优势，有着更大的临床应用潜力。在近年来开发出的众多非病毒载体中，生物可降解性纳米载体被认为是唯一能将DNA靶向递送到细胞内并实现DNA缓控释放的载体。壳聚糖(chitosan)是一种带正电荷的天然高分子生物聚合物，具有无毒、生物降解度高、生物相容性好、免疫原性低、价格低廉等优点。带正电荷的壳聚糖可与带负电荷的DNA形成纳米粒，保护质粒DNA被核酸酶降解，并能将治疗性基因携带进入细胞核中表达，是一种较为理想的基因载体材料。

体外研究发现，牛骨髓抗菌肽-28(bone marrow antimicrobial peptide-28,BMAP28)对多种奶牛乳腺炎致病菌具有杀灭作用，提示BMAP28基因可作为开发奶牛乳腺炎基因治疗药物的候选基因，但目前尚未见使用BMAP28进行基因治疗的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供了一种以牛抗菌肽BMAP28为治疗基因的药物递送系统、包括基因表达载体、药物递送载体及其制备方法。本发明制备的载抗菌肽基因的药物递送系统对奶牛乳腺炎具有较好的疗效。

一种载抗菌肽基因的药物递送系统，其特征在于，所述一种载抗菌肽基因的药物递送系统由以下步骤制得：

(1)pEGFP-C3-SP质粒的构建：设计引物构建携带有BMAP28信号肽序列的质粒，将信号肽序列插入pEGFP-C3质粒的EGFP编码基因的起始密码子之后，上游引物为：5’-GGCGCTGGCCGAGGGCAGCGCTAGTCCCAGCAGCAGTAGCCAAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCAC-3’，下游引物为：5’-GAGACCCAGAGGGCCAGCCTCTCCCTGGGACGGTGGTCACTGGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTC-3’；

以pEGFP-C3质粒为模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增；扩增产物用Blunting Kination Ligation Kit进行平滑末端连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落测序，以确定SP序列正确插入，测序正确的质粒命名为pEGFP-C3-SP；

(2)pEGFP-C3-SP-BMAP28载体的构建：以牛中性粒细胞cDNA为模板，PCR扩增BMAP28(序列号：NM_174832)全长编码区序列，并添加EcoR I和Xba I酶切位点，正向引物为5’-CGGAATTCATGGAGACCCAGAGGGCCAG-3’，下划线为EcoR>TCTAGATTACCCCAAATGGAGTAG-3’，下划线为Xba>

割胶回收BMAP28片段，与质粒pEGFP-C3-SP分别进行EcoR I和Xba I双酶切后，使用T4DNA连接酶将BMAP28片段定向插入pEGFP-C3-SP的EcoR I/Xba I位点；重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，阳性克隆进行EcoR I/Xba I双酶切鉴定，并测序，将测序和双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pBMAP28；

(3)壳聚糖-质粒DNA纳米粒的制备：配置0.02％质量体积浓度的壳聚糖溶液，用NaOH溶液调节pH值至5.5；配制5mM Na₂SO₄溶液，将pBMAP28质粒用Na₂SO₄溶液分别稀释成浓度为75～200μg/mL的溶液，将壳聚糖溶液和质粒DNA溶液分别置于55℃水浴中加热10min，取等体积壳聚糖溶液和质粒DNA溶液迅速混合，涡旋震荡30s，室温静置30min，制备得到壳聚糖/质粒DNA复合物，即载抗菌肽基因壳聚糖纳米粒。

进一步地，步骤(1)中PCR反应条件为：94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 5min，35个循环。

步骤(3)中将pBMAP28质粒用Na₂SO₄溶液稀释成浓度为175μg/mL的溶液。

本发明的载抗菌肽基因的药物递送系统，是由含牛抗菌肽BMAP28基因的真核表达质粒和壳聚糖纳米粒载体构成，所用抗菌肽基因属于牛源，避免了异源基因带来的危害，具有更好的应用价值；所述真核表达质粒中抗菌肽BMAP28基因的5’端与增强型荧光报告基因EGFP融合，目的是使基因表达易于观察；此外，在所述真核表达质粒的EGFP起始密码子后还插入了BMAP28基因自身的信号肽序列，目的是使融合蛋白可分泌表达；所述载抗菌肽基因的药物递送系统通过复凝集法制备，也可根据需要采用共价交联法、沉淀凝集法和离子凝胶法等制备。

壳聚糖是目前发现的一种理想的基因递送材料，这种高分子聚合物可包裹DNA并形成稳定的带正电荷的纳米微粒，保护质粒DNA被降解。此外，带正电荷的壳聚糖纳米粒可与带负电荷的细胞膜结合，有利于细胞通过胞吞作用对其进行摄取。牛源抗菌肽BMAP28是一种已知的具有广谱抗微生物作用的小分子多肽，可在微摩尔级别水平上发挥抗菌作用。本发明的目的在于探索以BMAP28为治疗基因、以壳聚糖为基因递送载体的针对奶牛乳腺炎的基因治疗方法。为此，本发明首先构建了携带有荧光报告基因EGFP的BMAP28分泌表达质粒，由于BMAP28的活性部位位于C端，为避免影响BMAP28的抗菌功能，故将EGFP构建在BMAP28的N端。在成功构建BMAP28分泌表达质粒的基础上，将质粒DNA与壳聚糖按不同比例混合制备纳米粒，发现壳聚糖与质粒DNA质量之比为8:7时形成的纳米粒对DNA的包封率达94％，纳米粒直径在100～300nm之间，有利于细胞摄取。

体外试验发现，壳聚糖/质粒DNA纳米粒可有效保护质粒DNA被DNase I降解，并能有效介导质粒DNA进入真核细胞中表达。对转染细胞中荧光报告基因表达的动态监测发现，转染细胞传代2～3代后荧光报告基因的表达较传代前升高，提示壳聚糖包裹的质粒DNA可在细胞内缓慢释放。体外抑菌试验表明，EGFP-BMAP28融合蛋白可在真核细胞中分泌表达并保持抗菌活性。

本发明还提供了载抗菌肽基因壳聚糖纳米粒在制备奶牛乳腺炎药物中的应用。

将制备的壳聚糖/质粒DNA纳米粒经乳腺内灌注后1周，56％(5/9)临床型乳腺炎患牛乳腺红肿症状消失，78％(7/9)临床型乳腺炎和83％(10/12)隐性乳腺炎奶牛CMT评分下降一个“+”以上或转阴，原有病原菌检出率下降。结果表明，本发明制备的壳聚糖/质粒DNA纳米粒对奶牛乳腺炎治疗有效。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是限制性内切酶消化重组质粒pBMAP28的电泳图。

图2是壳聚糖-pBMAP27纳米粒扫描电镜图像。

图3是不同处理条件下质粒DNA的包封率(n＝3)示意图。

图4是CS/DNA 175复合物凝胶电泳图。

图5是壳聚糖纳米粒阻止DNase I对质粒DNA的降解示意图。

图6是壳聚糖-质粒DNA纳米粒对293T细胞存活的影响(n＝6)示意图。

图7是绿色荧光蛋白在转染细胞中的表达示意图。

图8是Western blot检测EGFP-BMAP28融合蛋白表达示意图。

图9是转染细胞培养上清的体外抑菌作用(n＝4)示意图。

具体实施方式

实施例1载抗菌肽基因的药物递送系统构建

1.pEGFP-C3-SP质粒的构建

设计引物构建携带有BMAP28信号肽(signal peptide,SP)序列的质粒，将信号肽序列插入pEGFP-C3质粒的EGFP编码基因的起始密码子之后。上游引物为：5’-GGCGCTGGCCGAGGGCAGCGCTAGTCCCAGCAGCAGTAGCCAAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCAC-3’，下游引物为：5’-GAGACCCAGAGGGCCAGCCTCT CCCTGGGACGGTGGTCACTGGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTC-3’。引物由上海生工合成。

以pEGFP-C3质粒为模板，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 5min，35个循环。扩增产物用Blunting Kination Ligation Kit进行平滑末端连接(按试剂盒说明书进行操作)。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落测序，以确定SP序列正确插入。将测序正确的质粒命名为pEGFP-C3-SP。

2.pEGFP-C3-SP-BMAP28载体的构建

以牛中性粒细胞cDNA为模板，PCR扩增BMAP28(序列号：NM_174832)全长编码区序列，并添加EcoR I和Xba I酶切位点，正向引物为5’-CGGAATTCATGGAGACCCAGAGGGCCAG-3’(下划线为EcoR>TCTAGATTACCCCAAATGGAGTAG-3’(下划线为Xba>

割胶回收BMAP28片段，与质粒pEGFP-C3-SP分别进行EcoR I和Xba I双酶切后，使用T4DNA连接酶将BMAP28片段定向插入pEGFP-C3-SP的EcoR I/Xba I位点。重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，阳性克隆进行EcoR I/Xba I双酶切鉴定，获得长度分别为4600bp和493bp的两条条带(如图1所示)，与预期相符。测序结果表明，重组质粒中目的基因序列与参考序列完全一致。将测序和双酶切鉴定正确的重组质粒命名为pBMAP28。

将1mL转化子转接于100mL LB培养基中，37℃摇床、230rpm/min培养过夜。离心收集菌体，按照罗氏质粒大量抽提试剂盒说明书抽提质粒，用NanoDrop ND-3000超微量核酸蛋白测定仪检测DNA含量。

3.壳聚糖-质粒DNA纳米粒的制备

准确称取0.1g壳聚糖，加入到5mL 5mM NaAc溶液中溶解，定容至500mL，配置成0.02％(w/v)浓度的壳聚糖溶液，并用NaOH溶液调节pH值至5.5。配制5mM Na₂SO₄溶液，将pBMAP28质粒用Na₂SO₄溶液(5mM)分别稀释成浓度为75、125和175μg/mL的溶液，将壳聚糖溶液和上述3种不同浓度的质粒DNA溶液分别置于55℃水浴中加热10min，取等体积壳聚糖溶液和质粒DNA迅速混合，涡旋震荡30s，室温静置30min，制备成壳聚糖/质粒DNA复合物，标记为CS/DNA75、CS/DNA125和CS/DNA175。

实施例2载抗菌肽基因的药物递送系统验证试验

1.壳聚糖-质粒DNA复合物扫描电镜观察

将壳聚糖/质粒DNA复合物均匀散布在样品台上，自然干燥，用导电胶固定后喷金，在扫描电镜下观察其形态特征，并选取有代表性的视野拍照。扫描电镜观察显示，CS/DNA 75、CS/DNA 125和CS/DNA 175均能形成球形结构。其中，CS/DNA75形成的棒状颗粒较多、球状颗粒较少；CS/DNA125形成的球状颗粒较CS/DNA75增多、棒状颗粒减少；CS/DNA175的颗粒几乎完全呈球状，分布较均匀，颗粒直径多在100～300nm范围内(如图2所示)。

2.质粒DNA在壳聚糖中的包封率测定

取壳聚糖/质粒DNA复合物200μL，4℃、10000g离心1h。收集上清，采用NanoDrop ND-3000超微量核酸蛋白测定仪检测上清中质粒DNA含量，计算质粒DNA的包封率，计算公式为：

如图3所示，CS/DNA75、CS/DNA125及CS/DNA175的包封率在91.5～94.0％之间，其中CS/DNA175的包封率显著高于CS/DNA75和CS/DNA125。综合形态学和包封率测试结果，选择CS/DNA175进行下游实验。

3.凝胶阻滞试验

取CS/DNA175复合物(含质粒DNA 500ng)和500ng pBMAP28裸质粒分别与1μL 6×DNA上样缓冲液混匀，在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上电泳(6V/cm，30min)，紫外凝胶成像仪观察DNA在琼脂糖凝胶上的迁移情况，分析质粒DNA与壳聚糖的结合情况。

如图4所示，裸质粒DNA在1.0％琼脂糖凝胶上电泳后出现3条电泳条带，而CS/DNA 175复合物则被阻滞在凝胶加样孔中，未见DNA条带泳出，表明壳聚糖能有效结合质粒DNA。

4.DNase I保护试验

取CS/DNA175和pBMAP28裸质粒溶液各5μL(含质粒DNA 1μg)，分别加入2μL的DNase I(5U/μL)，以未加入DNase I的样品为对照，37℃反应30min，0℃冰浴30min以终止反应，在1.0％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳(6V/cm，30min)，紫外凝胶成像仪观察琼脂糖凝胶上DNA的迁移情况。

如图5所示，未经DNase I处理的裸质DNA有条带泳出，而经DNase I处理的裸质DNA无电泳条带出现，加样孔内也无DNA残留，表明裸质粒已被DNase I降解；无论是否经过DNase I处理，CS/DNA 175复合物均被阻滞在加样孔内，提示壳聚糖与质粒DNA形成的复合物能有效保护DNA被DNase I降解。

5.体外基因转染

用0.25％胰酶-EDTA消化单层培养的293T细胞并接种于6孔板，加入不含抗生素的DMEM培养基1mL，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，至细胞贴壁覆盖率达80％时，加入裸质粒DNA和CS/DNA175(含质粒DNA>

如图6所示，经CS/pEGFP-C3和CS/DNA175处理后，存活的293T细胞与对照组(未转染组)细胞相比无显著差异(P>0.05)，表明壳聚糖-质粒DNA复合物对细胞存活无显著影响。

6.细胞毒性试验

用0.25％胰酶-EDTA消化单层培养的293T细胞，按1×10⁴个/孔接种于96孔板。将细胞分为对照组、壳聚糖-空质粒组(CS/pEGFP-C3)和CS/DNA175处理组，每组6复孔。CS/pEGFP-C3组和CS/DNA175组分别加入含4μg质粒DNA的CS/pEGFP-C3和CS/DNA175，对照组正常培养。在37℃、5％CO₂条件下培养20h后，再加入5mg/mL>

未经转染的细胞中无荧光蛋白表达(图7中A图)；用CS/DNA175处理24h后，仅有极少量293T细胞表达荧光蛋白报告基因(图7中B图)，转染细胞传代后，荧光蛋白阳性细胞数量增多(图7中C图、D图)，表明壳聚糖可介导质粒DNA进入真核细胞中表达，且壳聚糖-质粒DNA具有缓释作用。荧光蛋白在细胞内和细胞周围均有分布(图7中E图)，表明重组蛋白可分泌表达。

7.免疫印迹(Western blot)

根据荧光蛋白表达强度，收集转染后的第二代细胞，采用RIPA法提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。取50μg总蛋白在12％分离胶上进行SDS-PAGE电泳，电转印PVDF膜，于5％脱脂奶中室温封闭2h。加入抗GFP一抗(1：2000稀释)，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG(1:5000)，室温孵育2h。ECL plus显色液(GE Healthcare)显色15min，观察结果。

免疫印迹试验结果发现，转染pEGFP-C3空载体的细胞表达分子量约为27kD的EGFP蛋白，EGFP-BMAP28融合蛋白分子量约为44kD，与预期相符(如图8所示)。

8.抑菌试验

收集转染后72h时的细胞培养上清，4℃、14000rpm离心10min，收集上清备用。将标准大肠大肠杆菌菌株(ATCC2592)培养至对数生长期，取10μL菌液(3×10⁸CFU/mL)加入1mL细胞培养液上清，37℃摇床、230rpm/min培养2h。加入100μL>

经CS/pEGFP-C3处理后的细胞的培养上清对大肠杆菌标准菌株无抑菌活性，而经CS/DNA175处理后的细胞的培养上清可显著抑制大肠杆菌增殖，表明EGFP-BMAP28重组蛋白在293T细胞中能分泌表达，表达产物具有抗菌活性。

实施例3载抗菌肽基因的药物递送系统治疗试验

本实验在杭州市近郊某奶牛场进行。通过临床观察、加州乳腺炎检测(CMT)及牛奶体细胞计数(SCC)(Fossmatic^TM>

对患病乳区进行挤奶和消毒后，每个乳区灌注50mL含CS/DNA175(含200μg质粒DNA)的生理盐水，间隔3～5d后再灌注1次。于最后一次灌注后第7d采集奶样进行CMT检测。

疗效评价：从临床症状、CMT评分和细菌学检测三方面进行疗效评价。乳腺红肿症状消失、牛奶性状无明显肉眼异常判定为临床治愈；CMT评分下降1个“+”以上判定为有效，CMT评分转为“-”或可疑判定为治愈；细菌学检测转阴判定为细菌学治愈。

采用CS/DNA175治疗后第7d，5头(67％)临床型乳腺炎患牛乳区炎症症状消失，乳汁性状无明显异常。CMT检测结果表明，有7头(78％)临床型乳腺炎和10头(83％)隐性乳腺炎奶牛为治疗有效或治愈。部分细菌在治疗后转阴(表1)。

表1.壳聚糖-质粒DNA复合物对奶牛乳腺炎的治疗效果

结果表明，本发明制备的载抗菌肽基因的药物递送系统(壳聚糖/质粒DNA纳米粒)对奶牛乳腺炎治疗有效。