一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪器读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时检测鉴别犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子的同时检测。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

说明书

技术领域

本发明属于养犬业的病原检测领域，具体涉及一种检测犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法。

背景技术

犬瘟病毒（Canine distemper virus, CDV）、犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）、狂犬病毒（Rabies virus, RV）是犬病毒性传染病暴发和流行的几个重要病原体，这三种病毒单一或混合感染后临床致死率可达50%~100%，给养犬业造成严重的经济损失。CDV感染引起的犬瘟主要有呼吸型、消化型、神经型和混合型4种，可引起感染动物全身性的免疫抑制，病死率极高。单一CPV感染机体引起的症状较轻，与其他病毒、细菌协同混合感染，引起的临床症状非常明显，主要引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎。RV是人兽共患传染病—狂犬病的病原体，其感染危害中枢神经系统，病死率几乎为100%，至今尚无有效的治疗药物，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。

目前对CDV、CPV、RV 的临床诊断方法主要采取血清学方法，如ELISA、胶体金快速检测试纸条等，但是非特异性交叉反应而影响诊断结果的准确性，并且该方法的敏感性不够高。随着分子生物学的发展，最近国内外建立了PCR/多重PCR、荧光定量PCR等检测方法。虽然PCR技术具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，具有更高的敏感性和特异性并且大大缩短了检测时间。建立两重或三重荧光定量PCR方法比较复杂，除了对试剂、引物有特殊要求外，同时也要求仪器有多个检测通道，大大增加了实验难度，并且仍不能满足样品较多但样本量较少的检测需求。目前，尚未见有应用多重免疫荧光分析方法对犬瘟病毒、犬细小病毒、狂犬病毒进行检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析引物。

本发明的另一目的在于提供一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

进一步的，所述引物CDV1和CDV2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物CPV1和CPV2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物RV1和RV2其中一条引物的5’端被生物素化。

进一步的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

进一步的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2这3组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:7~9所示的tag序列，且该3组引物对中连接的tag序列互不相同。

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析试剂盒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。

进一步的，该试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球。

进一步的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

1）从样品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸为模板，用上述任一所述的引物进行PCR扩增；

3）将上步扩增产物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；

4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

进一步的，步骤2）中PCR扩增的反应体系为：

5×One-step RT-PCR buffer5µL

dNTP 1µL

引物混合液 4µL

酶 1µL

模板 2µL

ddH₂O12µL

Total25µL；

进一步的，步骤2）中PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性15min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

进一步的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：

3种荧光编码微球20µL

链霉亲和素-藻红蛋白75µL

扩增产物 5µL

总体积 100µL；45℃孵育30min。

本发明的有益效果是：

1）本发明实现了同时对犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒进行检测，本发明通过RT-PCR获得目标扩增片段，再将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SAPE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的病原。

2）本发明方法能够同时对犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。本发明能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。

附图说明

图1是犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒3种病原PCR的电泳图；1：DM2000 DNA marker；2：CDV；3：CPV；4：RV；5：NTC（PCR空白对照）；6：对CDV+CPV+RV进行的三重PCR；

图2是犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒3种病原的多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；

图3是犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒3种病原的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；图中的“Rabies”即为RV；

图4是犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒3种病原的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；

图5是犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒3种病原的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图，NTC表示阴性对照，PC表示阳性对照。

具体实施方式

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

优选的，所述引物CDV1和CDV2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物CPV1和CPV2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物RV1和RV2其中一条引物的5’端被生物素化。

优选的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

优选的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2这3组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:7~9所示的tag序列，且该3组引物对中连接的tag序列互不相同。

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析试剂盒，该试剂盒中含有上述任一所述引物。

优选的，该试剂盒中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球。

优选的，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：

1）从样品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸为模板，用上述任一所述的引物进行PCR扩增；

3）将上步扩增产物、3种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；

4）杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

优选的，步骤2）中PCR扩增的反应体系为：

5×One-step RT-PCR buffer5µL

dNTP 1µL

引物混合液 4µL

酶 1µL

模板 2µL

ddH₂O12µL

Total25µL；

优选的，步骤2）中PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性15min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

优选的，步骤3）中所述杂交的反应体系和程序为：

3种荧光编码微球20µL

链霉亲和素-藻红蛋白75µL

扩增产物 5µL

总体积 100µL；45℃孵育30min。

优选的，步骤3）中3种编码不同荧光色的荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，3种荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1 引物

经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2对多重荧光免疫检测犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的效果最好，其碱基序列如下所示。

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

本发明采用多重荧光免疫分析的方法对分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒进行区分，故将上述引物作进一步的修饰，以满足相应的操作要求。其中引物CDV1、CPV1和RV的5’端连接有tag序列，所连接的tag序列分别为：

引物CDV1的tag序列为：ATCTCAATTACAATAACACACAAA（SEQ ID NO：7）；

引物CPV1的tag序列为：CAAACAAACATTCAAATATCAATC（SEQ ID NO：8）；

引物RV1的tag序列为：TACTACTTCTATAACTCACTTAAA （SEQ ID NO：9）。

另外，引物CDV2、CPV2和RV2的5’端还添加有生物素标记。

实施例 2：快速区分CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析试剂盒

试剂盒包括以下组分：

（1）实施例1所设计的用于多重荧光免疫分析的引物；

（2）3种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物中的tag序列互补配对；3种微球均购自luminex公司，其中CDV、CPV和RV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。

（2）3种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物组上游引物上的tag序列互补配对；三种微球均购自luminex公司，具体的CDV、CPV和RV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。

实施例3 CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立

（1）CDV、CPV和RV质粒的构建

用天根的核酸自动抽取仪分别提取CDV、CPV和RV的核酸，分别用引物对CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2进行PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化，将纯化后的cDNA分别连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。

（2）质粒PCR扩增

用实施例1所述的引物分别对CDV、CPV和RV进行单重、三重PCR扩增。

上游引物混合液的制备：将CDV1、CPV1和RV1以摩尔比1:1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将CDV2、CPV2和RV2以摩尔比1:1:1:1比例进行混合。利用CDV、CPV和R三种病原的特异性模板，以及CDV、CPV和RV三重混合模板，对上述三种病原的特异性区域进行扩增。其中三重模板的制备：将三种质粒以以体积比1:1:1:1的比例进行混合。

PCR扩增反应体系如下：

5×One-step RT-PCR buffer5μl

Enzyme 1μl

dNTP 1μl

上游引物混合液 2μl （各引物终浓度为0.2μM）

下游引物混合液 2μl（各引物终浓度为0.2μM）

模板 2 μl (< 500ng)

ddH₂O>

Total 25μl。

扩增的反应程序为：50℃逆转录30min；95℃预变性15min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。

电泳检测结果：将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。1：DM2000 DNA marker；2：CDV；3：CPV；4：RV；5：NTC（PCR空白对照）；6：对CDV+CPV+RV进行的三重PCR。从图1中可以看出，CDV的扩增产物大小约为151bp，CPV的扩增产物大小约为163bp，RV的扩增产物大小约为155bp，由于这三种病原的扩增产物大小相近，所以三重PCR 扩增产物的电泳条带无法分辨。

（3）将所得的PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SAPE）工作液杂交，包括以下步骤：

分别包被有特异的anti-tag序列的3种微球，其中anti-tag序列能相应地与CDV、CPV和RV三种病原引物上的tag序列互补配对。三种微球均购自luminex公司，具体的CDV、CPV和RV分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。

SAPE工作液制备：将1mg/ml SAPE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10μg/μl。

充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μl，样品孔中加入5μl PCR产物，背景孔中加入5μl NTC产物，再加入75μl的SAPE工作液，充分混匀，于金属加热器中45℃孵育30min。

依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的100μl上述反应液进行检测，结果如图2所示，虽然三重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读取MFI值时，可以明显分辩不同类型的病原。

结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：

最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10份健康犬组织样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为182.5，因此将本发明的cutoff值定为200。只有检测样品的MFI值高于200时，该实验数据才能进行有效分析。

待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞200时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤200时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。

实施例4 CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析检测特异性实验

分别用犬瘟病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、狂犬病毒（RV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPiV）、犬冠状病毒（CCV）作为模板进行多重荧光免疫分析检测。实验结果如图3所示，只有犬瘟病毒、犬细小病毒、狂犬病毒为阳性，其他均为阴性，说明本检测体系特异性良好。

实施例5：CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验

将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行梯度稀释，稀释至10¹copies/μl，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图4所示，实验结果表明，CDV、CDV和RV的最低检出量分别为为10²copies/μl、10²copies/μl和10³copies/μl。

实施例6：样品的检测

将所收集的犬的拭子、粪便、尿液、唾液等临床样品，用核酸自动抽取仪抽提核酸作为反应模板，并使用Qiagen的One-Step RT PCR kit进行扩增。采用上述CDV、CPV和RV的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SAPE杂交，在Luminex 200检测仪上读取数据。具体步骤参照实施例3，实验结果如图5所示。

经普通PCR检测实验结果表明，样品1、3、5、7、8、10均为阴性；2、4、9为CDV阳性样品；4、6、9为CPV阳性样品。其中，样品4、9为CDV、CPV混合感染样品。通过测序分析，结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>广东省实验动物监测所

<120>一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及

试剂盒

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