利用分子荧光差异加标测定蛋黄、VB2药片中核黄素的方法

摘要

一种利用分子荧光差异加标测定蛋黄、VB2药片中核黄素的方法，无需绘制工作曲线，只需通过两个差异加标的试液即可快速获得待测组分的质量分数，测定过程中完全消除了样品背景干扰，同时，采用向两个同体积试液中加入不同量的标准溶液，样品中因被测组分浓度不同可能因发生聚合、离解、光解等副反应所引入的测定误差可获得补偿或扣除，测定准确度进一步得到保障和提高。本发明方法检出限为5.76ng/mL，定量限为1.92×10‑2μg/mL。

说明书

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种利用分子荧光差异加标测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法。

背景技术

维生素B₂，又称核黄素，在光照和紫外线的照射下容易分解，耐酸不耐碱，可溶于氯化钠水溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。核黄素对人体非常重要，当缺乏时，代谢容易发生障碍。核黄素是水溶性的，不会在人体蓄积，要时常补充，鸡蛋黄、黄豆、牛奶、酵母等中的含量较多。

鸡蛋黄含有丰富的脂肪和蛋白质，包括可帮助合成乙酰胆碱的卵磷脂，同时含有丰富的钙磷铁等矿物质，以及丰富的脂溶性维生素，核黄素含量也比较高，因此，鸡蛋黄很适宜婴幼儿食用；维生素B₂药片为黄色片剂，用于治疗口角炎、唇干裂、舌炎、阴囊炎、结膜炎、脂溢性皮炎等。一般普通规格维生素B₂药片含核黄素5毫克，药品中还含有其他辅料，如淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。由于核黄素对人体的重要性，而且核黄素易发生破坏，因此对其来源中含量的测定十分重要。

目前，核黄素的测定方法较多，如电化学法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、化学发光分析方法、示波极谱法、荧光光谱法等。这些方法都有各自的优缺点，像电化学分析法虽然测定方法简单，灵敏度较高，但准确度和抗干扰能力较差。高效液相色谱法具有测定结果准确、可靠，但是样品前处理过程较为繁琐，测定较为费时，仪器较为昂贵，操作繁杂。毛细管电泳法有很好的灵敏度，但测定成本比较高。

分子荧光法是一种应用较多的分子发光痕量分析技术，灵敏度高，检出限低。由于核黄素溶液在430-440nm蓝光照射下，发出较强的绿色荧光，因此可以利用分子荧光法测定核黄素的含量，但由于分子荧光法为痕量分析技术，荧光污染、环境因素以及样品共存组分的影响是准确、快速分析不可不考虑的主要问题。目前测定中较多的定量分析方法为工作标准曲线法和比较法；工作曲线法是将已知量的标准溶液配制成一系列不同浓度的标准溶液，并在待测定试液之外，在一定条件下测定其标准溶液的相对发光强度，以发光强度对标准溶液浓度绘制工作曲线，提供回归方程和参数间的相关性，样品试液与标准溶液在相同的条件下测定，对照工作曲线或代入回归方程求出试样中待测组份的含量。该法的优点是适用于大批量样品的测定，缺点是①绘制工作曲线需配制5-7个标准溶液，耗费时间长，测定成本高；②工作曲线需要在一段工作时间之后重新绘制或校正；③是由于标准溶液中不含待测试样，因此试样测定时的背景与标准溶液的背景有较大差异，即使是用蒸馏水代替试液做全过程空白予以“扣空白”，也不能扣除试样本身共存物质可能引入的背景干扰，只能部分扣除蒸馏水、所用试剂、所用仪器引入的干扰，因标准溶液和试液的背景不一样，分别测定不能保证在完全相同测定条件下完全扣除背景干扰，测定的准确度将大打折扣；测定必须在线性范围内进行，如果被测定物质的浓度过稀或过浓，有可能发生不同程度的离解、聚合、光解或其它副反应而偏离线性关系，引入较大误差甚至无法测定。比较法为：取一标准溶液，在和试液完全相同的条件下测定，同时测定试剂空白，根据在完全相同条件下测定时，浓度与发光值成正比的关系，可计算出试液的浓度，本法适用于单个样品的快速测定，同时要求标准溶液浓度与待测液浓度尽量接近，该法的优点是快速、简便，分析成本相对低廉，无需作图；缺点是①虽然扣除了试剂空白的发光值，但试液和标准溶液背景本底情况并不一致，若体系在测定过程中发生不同程度的化学副反应或光化学副反应，测定结果就会不同程度的引入误差；②测定要求标准溶液与待测试液的浓度尽量接近，对未知样品实际上很难做到，往往需要预做试验确定； 由一个标准溶液测定信号决定待测试液的浓度，标准溶液测定信号的准确度严重影响测定结果。鸡蛋黄和维生素B₂药片如上所述，除了核黄素，还含有其他较多的共存物质，尤其是鸡蛋黄基体成分复杂，存在较高含量的蛋白质、氨基酸等物质，无论是采用工作曲线法还是比较法，在测定时均容易受到共存蛋白质等非测定组分的荧光干扰和各种荧光污染的影响；给测量结果带来一定的误差；所以，人们希望建立基体荧光干扰小或能够有效消除干扰和荧光污染的测定核黄素的新型荧光分析方法。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种利用分子荧光差异加标测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，该测定方法快速，有效消除了试液本底以及浓度差异所引入的干扰，准确度得到保证，工作效率得到提高。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种利用分子荧光差异加标测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备：取样品研磨，称取m_样，加入0.09-0.11moL/L盐酸，蛋黄与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:(2.6-4)，VB₂药片与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:(1200-1600)，压力水解提取，压力为（8.0-12.0）×10⁴Pa，时间为20-40min，然后用NaOH溶液调节pH至4.5-7.5，蛋黄试液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量为蛋黄质量的0.13-0.16%，VB₂药片试液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量为VB₂药片质量的50-70%，然后在37-39℃保温15-17h进行酶解；酶解液过滤，滤液定容至V_样1；

（2）测定液制备：从V_样1中取四份相同体积V_样2的过滤试液，向第一份和第二份加入不同体积的核黄素标准溶液，核黄素标准溶液质量体积浓度为，第二份标准溶液体积V_标2大于第一份V_标1，第四份加入低亚硫酸钠将核黄素还原为无荧光物质，作为空白，第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至V，然后加3-3.5%>1；

（3）测定：使用核黄素标准溶液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，将（1）处理好的试液在最大激发波长和最大荧光发射波长下测定，第一份加标试液相对发光值为I_标1，第二份加标试液相对发光值为I_标2，第三份待测样品试液相对发光值为I_样，第四份本底空白背景相对发光值为I₀，蛋黄或VB₂药片中核黄素的质量分数ω如式（1）；

优选的，包括以下步骤：

（1）提取液制备：取样品研磨，称取m_样，加入0.1moL/L盐酸，蛋黄与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:3.5，VB₂药片与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:1400，压力水解提取，压力为10.3×10⁴Pa，时间为30min，然后用NaOH溶液调节pH至5.5，蛋黄试液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量为蛋黄质量的0.15%，VB₂药片试液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量为VB₂药片质量的60%，然后在39℃保温16h进行酶解；酶解液过滤，取滤液定容至V_样1；

（2）测定液制备：从V_样1中取至少四份相同体积V_样2的过滤试液，向第一份和第二份加入不同体积的核黄素标准溶液，核黄素标准溶液质量体积浓度为，第二份标准溶液体积V_标2大于第一份V_标1，第四份加入低亚硫酸钠将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白，第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至V，加3.3%V的冰乙酸混匀，然后加入3.3%V的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为30g/L，混匀，静置，滴加双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，最后加水定容至V₁后测定；

（3）测定：使用核黄素标准溶液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，将步骤（2）处理好的试液在最大激发波长和最大荧光发射波长下测定。

进一步，所述的利用分子荧光差异加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备：取样品研磨，称取18-22g鸡蛋黄或0.04-0.06gVB₂药片，加入0.09-0.11moL/L盐酸60-80>4Pa，时间为20-40min，然后用NaOH溶液调节pH至4.5-7.5，蛋黄试液中加入2.5-3.5mL>2药片试液中加入2.5-3.5mL>样1；

（2）测定液制备：从V_样1中取至少四份相同体积V_样2的过滤液，体积为0.5-10mL，向第一份和第二份加入不同体积的核黄素标准溶液，核黄素标准溶液质量体积浓度为，第二份标准溶液体积V_标2为第一份V_标1的1.2-2倍；第四份加入低亚硫酸钠将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白；第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至14-16mL，然后向每份过滤液中加入0.4-0.6mL冰乙酸混匀，然后加入0.4-0.6mL的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为25-35g/L，混匀，静置，滴加双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，最后各管加水定容至24-26mL；

（3）测定：使用核黄素标准溶液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，将步骤（2）处理好的样品试液在最大激发波长和最大荧光发射波长下测定。

更进一步，包括以下步骤：

（1）提取液制备：取样品研磨，称取20g鸡蛋黄或0.05gVB₂药片，加入0.1moL/L盐酸70mL，

压力水解提取，压力为10.3×10⁴Pa，时间为30min，然后用NaOH溶液调节pH至5.5，蛋黄试液中加入3mL>2药片试液中加入3mL>

（2）测定液制备：从100mL滤液中取至少四份相同体积的过滤试液，鸡蛋黄滤液体积为10.00mL，VB₂药片滤液体积为1.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入1.00mL和2.00mL浓度为>

（3）测定：使用核黄素标准溶液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，将步骤（2）处理好的样品试液在最大激发波长和最大荧光发射波长下测定。

如上所述的利用分子荧光差异加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，步骤（1）中NaOH溶液浓度为1moL/L，步骤（2）中双氧水质量体积浓度为3%；蛋黄试液中加入低亚硫酸钠溶液至少0.5mL，VB₂药片试液中加入低亚硫酸钠溶液至少5mL；低亚硫酸钠溶液浓度为20g/100mL，所述木瓜蛋白酶和淀粉酶溶液采用2.5moL/L乙酸钠溶液配制，

所述核黄素标准溶液分为浓度为25μg/mL核黄素标准储备液和浓度为1μg/mL核黄素标准使用液；核黄素标准储备液配制过程如下：将标准品核黄素粉末状结晶置于真空干燥器中，用五氧化二磷干燥管和硅胶干燥剂联合干燥24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水，将容量瓶置于30-40℃温水中摇动，待其溶解，冷至室温，加水定容至2L，移至棕色瓶内，加甲苯覆盖于溶液表面，于4℃冰箱中保存；核黄素标准使用液配制过程为：吸取25μg/mL核黄素标准储备液2.00mL，置于50mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，4℃冰箱保存，保存时间为1周。

蛋黄还采用直接干燥法进行水分含量的测定。

本发明建立了一种快速、简便定量测定蛋黄、维生素B₂药片中的核黄素的新型分析方法，无需绘制工作曲线，只需通过使用两个加标试液即可计算待测组分在样品中的质量分数，测定过程中完全消除了样品试液中的背景干扰，同时采用两个加入不同标准浓度的加标试液，因浓度不同可能产生的被测组分发生聚合、离解等副反应可部分获得补偿或扣除，测定准确度进一步得到保障和提高。本发明方法检出限为5.76ng/mL，定量限为1.92×10^-2μg/mL。与国标方法进行比较，经过F检验法和t检验法，两种方法的精密度和平均值都不存在显著性差异；但本发明测定方法简便、快速，扣除了样品试液中背景发光值以及浓度差异所可能带来的一部分干扰，提高了测定准确度和工作效率，方法无需绘制工作曲线和过柱去杂质，是适合样品中核黄素含量测定的新型分析技术，有较强的创新性。

附图说明

图1是盐酸体积对鸡蛋黄试液相对荧光值的影响；

图2是pH对鸡蛋黄试液相对荧光值的影响；

图3是低亚硫酸钠体积对鸡蛋黄试液相对荧光值的影响；

图4是盐酸体积对维生素B₂药片试液相对荧光值的影响；

图5是pH对维生素B₂药片试液相对荧光值的影响；

图6是低亚硫酸钠体积对维生素B₂药片试液相对荧光值的影响。

具体实施方式

实施例1

一种利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备：取样品研磨，称取m_样，加入0.09-0.11moL/L盐酸，蛋黄与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:(2.6-4)，VB₂药片与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:(1200-1600)，压力水解提取，压力为（8.0-12.0）×10⁴Pa，时间为20-40min，然后用1moL/L>2药片试液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量为VB₂药片质量的50-70%，然后在37-39℃保温15-17h进行酶解；酶解液用干滤纸过滤，取滤液定容至V_样1；通过盐酸水解和酶解，可让样品物料中结合态的核黄素游离出来，参与测定，提高分析数据的可靠性和准确性；鸡蛋黄中加入木瓜蛋白酶可以酶解出与蛋白质结合的核黄素；

（2）测定液制备：从V_样1中取至少四份相同体积V_样2的过滤试液，向第一份和第二份加入不同体积的核黄素标准溶液，核黄素标准溶液质量体积浓度为，第二份标准溶液体积V_标2大于第一份V_标1，第四份加入低亚硫酸钠将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白，第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至V，然后加3.3%V的冰乙酸混匀，然后加入3.3%V的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为30g/L，混匀，静置，滴加双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，最后加高纯水（石英亚沸去离子重蒸水，25℃时，pH6.63±0.02、电导率1.183μs/cm）定容至V₁后测定；加入冰乙酸可维持溶液处于弱酸环境，因核黄素在弱酸环境中较为稳定；加入高锰酸钾可氧化除去可能存在的一些较强还原性物质的干扰，降低本底空白值；

（3）测定：使用核黄素标准溶液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下测定，第一份加标试液相对发光值为I_标1，第二份加标试液相对发光值为I_标2，第三份待测样品试液相对发光值为I_样，第四份本底空白背景相对发光值为I₀，上述测定过程中四份试液在完全相同的条件下测定，根据待测组份的浓度与发光值成正比的关系，即：，为待测定容试液的质量体积浓度，为两份加标定容试液的质量体积浓度之差；可推算出蛋黄或VB₂药片中核黄素的质量分数ω如式（1）；

本发明采用的差异加标测定方法，其中I_标1、I_标2因与I₀使用相同的辅助试剂，因此，I_标1、I_标2也含有I₀值，但后I₀已抵消，由于待测试液和加标后待测试液的测定本底一致，因此，采用该方法可消除试液背景对测定结果的干扰，提高了测定的准确度。所以，该方法只需在相同条件下测出溶液的相对发光值，即可快速求得测定结果，无需绘制工作曲线和作图求值，快速，简便，极大的提高工作效率，采用两个不同浓度的加标试液确定待测组份的浓度，因样品浓度不同可能产生的被测组分发生聚合、离解等副反应可部分获得补偿和扣除，测定准确度进一步得到保障和提高。

实施例2

利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

核黄素标准储备液（25μg/mL）：将标准品核黄素（上海金穗生物科技有限公司）粉末状结晶置于真空干燥器中，经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。

核黄素标准使用液（1μg/mL）；吸取2.00mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，避光，贮于4℃冰箱，可保存一周；此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。

木瓜蛋白酶（10g/L）：木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸钠溶液配制；使用时，现配制。

淀粉酶（10g/L）：淀粉酶（邢台万达生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

低亚硫酸钠溶液（20g/100mL）：低亚硫酸钠（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司），此液用时用高纯水（石英亚沸去离子重蒸水，25℃时，pH6.63±0.02、电导率1.183μs/cm）现配，保存在冰水浴中，4h内有效。

（2）提取液制备（此实施例中样品为蛋黄）：

取煮熟的鸡蛋黄样品研细，称取20.0000g置于250mL锥形瓶中，加入0.1moL/L盐酸70mL（蛋黄与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:3.5），搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为12.0×10⁴Pa，时间为30min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至5.5，蛋黄试液中加入3mL>

（3）测定液制备

从V_样1中取四份相同体积的过滤试液，体积为10.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入1.00mL和2.00mL浓度为>

（4）蛋黄中水分测定

为便于不同样品间的结果比较，测定结果最好为干基含量；将煮熟鸡蛋黄研细，称取质量约为5.0000g按照GB/T 5009.3-2010中直接干燥法进行水分测定，按照公式（2）计算出鸡蛋黄水分的百分含量。

式中： ω₀为鸡蛋黄的水分含量；m₁为样品干燥前称量瓶和样品的质量，g；m₂为称量瓶和样品干燥后的质量，g；m₃为称量瓶的质量，g。

（5）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（3）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，根据公式（3）计算出干基鸡蛋黄中核黄素的质量分数ω（μg /100g）；

实施例3

利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）溶液配制：

核黄素标准储备液（25μg/mL）：将标准品核黄素（上海金穗生物科技有限公司）粉末状结晶置于真空干燥器中，经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。

核黄素标准使用液（1μg/mL）；吸取2.00mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。

木瓜蛋白酶（10g/L）：木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时，现配制。

淀粉酶（10g/L）：淀粉酶（邢台万达生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

低亚硫酸钠溶液（20g/100mL）：低亚硫酸钠（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司），此液用时用高纯水（石英亚沸去离子重蒸水，25℃时，pH6.63±0.02、电导率1.183μs/cm）现配，保存在冰水浴中，4h内有效。

（2）提取液制备（此实施例中样品为VB₂药片）：

取VB₂药片研细干燥，称取0.0500g倒入250mL锥形瓶中，加入0.1moL/L盐酸70>2药片与盐酸溶液的质量体积比(g/mL)为1:1400），搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为12.0×10⁴Pa，时间为30min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至5.5，加入3mL>2药片质量的60%），然后在39℃保温16h进行酶解；酶解液用干滤纸过滤，取滤液定容至100mL；

（3）测定液制备

取四份相同体积的提取过滤液，体积为1.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入1.00mL L和2.00mL浓度为 1μg /mL的核黄素标准使用液；第四份加入5mL浓度为20g/100mL低亚硫酸钠溶液将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白；第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至15mL，然后向每份提取过滤液中加入0.5mL（3.3%V）冰乙酸混匀，然后加入0.5mL（3.3%V）的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为30g/L，混匀，静置，滴加质量体积浓度3%双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，剧烈振摇样品，使多余的氧气逸出，最后加水定容至25mL；

（4）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（3）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，根据公式（4）计算出VB₂药片中核黄素的质量百分数ω（g/100g）；

实施例4

利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备（此实施例中样品为蛋黄）：

取煮熟的鸡蛋黄样品研细，称取22.0000g倒入250mL锥形瓶中，加入0.1moL/L盐酸80 mL，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为12.0×10⁴Pa，时间为30min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至5.5，蛋黄试液中加入3.5mL>

（2）测定液制备

从V_样1中取四份相同体积的过滤试液，体积为5.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入1.00mL和2.00mL浓度为>

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（3）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，仿照公式（3）计算出干基鸡蛋黄中核黄素的质量分数ω；其余同实施例2。

实施例5

利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备（此实施例中样品为蛋黄）：

取煮熟的鸡蛋黄样品研细，称取20.0000g倒入250mL锥形瓶中，加入0.09moL/L盐酸70mL，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为10.0×10⁴Pa，时间为20min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至4.5，蛋黄试液中加入2.5mL>

（2）测定液制备

从V_样1中取四份相同体积的过滤试液，体积为10.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入4.00mL和5.00mL浓度为>

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，仿照公式（3）计算出干基鸡蛋黄中核黄素的质量分数ω；其余同实施例2。

实施例6

利用分子荧光加标法测定蛋黄、VB₂药片中核黄素的方法，包括以下步骤：

（1）提取液制备（此实施例中样品为蛋黄）：

取煮熟的鸡蛋黄样品研细，称取18.0000g倒入250mL锥形瓶中，加入0.11moL/L盐酸60ml，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为8.0×10⁴Pa，时间为40min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至7.5，蛋黄试液中加入3mL>

（2）测定液制备

从V_样1中取四份相同体积的过滤试液，体积为10.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入2.00mL和3.00mL浓度为>

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，仿照公式（3）计算出干基鸡蛋黄中核黄素的质量分数ω；其余同实施例2。。

实施例7

（1）提取液制备（此实施例中样品为VB₂药片）：

取VB₂药片研细干燥，称取0.0500g倒入250mL锥形瓶中，加入0.1moL/L盐酸80mL，搅拌直到颗粒物分散均匀，用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于压力锅水解提取，压力为12.0×10⁴Pa，时间为30min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至5.5，加入3.5mL>

（2）测定液制备

取四份相同体积的提取过滤液，体积为0.500mL，向第一份和第二份提取液中分别加入1.00mL L和2.00mL浓度为 1μg /mL的核黄素标准使用液；第四份加入5mL浓度为20g/100mL低亚硫酸钠溶液将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白；第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至16mL，然后向每份提取液中加入0.5mL冰乙酸混匀，然后加入0.5mL的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为30g/L，混匀，静置，滴加3%双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，剧烈振摇样品，使多余的氧气溢出，最后加水定容至25mL；

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，根据公式（1）计算出VB₂药片中核黄素的质量分数ω。

实施例8

（1）提取液制备（此实施例中样品为VB₂药片）：

取VB₂药片研细干燥，称取0.0600g倒入250mL锥形瓶中，加入0.09moL/L盐酸70>4Pa，时间为20min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至4.5，加入3mL>

（2）测定液制备

取四份相同体积的提取过滤液，体积为1.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入4.00mL L和5.00mL浓度为 1μg /mL的核黄素标准使用液；第四份加入5mL浓度为20g/100mL低亚硫酸钠溶液将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白；第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至15mL，然后向每份提取液中加入0.6mL冰乙酸混匀，然后加入0.6mL的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为35g/L，混匀，静置，滴加3%双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，剧烈振摇样品，使多余的氧气溢出，最后加水定容至24mL；

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，根据公式（1）计算出VB₂药片中核黄素的质量分数ω。

实施例9

（1）提取液制备（此实施例中样品为VB₂药片）：

取VB₂药片研细干燥，称取0.0400g倒入250mL锥形瓶中，加入0.11moL/L盐酸60>4Pa，时间为40min，水解液冷却后，用1moLNaOH溶液调节pH至7.5，加入3mL>

（2）测定液制备

取四份相同体积的提取过滤液，体积为2.00mL，向第一份和第二份提取液中分别加入2.00mL L和3.00mL浓度为 1μg /mL的核黄素标准使用液；第四份加入5mL浓度为20g/100mL低亚硫酸钠溶液将核黄素还原为无荧光物质作为本底空白；第三份既不加标准溶液，也不加低亚硫酸钠，为原过滤试液；各管加水至14mL，然后向每份提取液中加入0.4mL冰乙酸混匀，然后加入0.4mL的高锰酸钾溶液，高锰酸钾溶液浓度为25g/L，混匀，静置，滴加3%双氧水溶液至高锰酸钾颜色褪去，剧烈振摇样品，使多余的氧气溢出，最后加水定容至26mL；

（3）荧光测定

使用核黄素标准使用液在荧光分光光度计下扫描图谱，根据图谱获得最大激发波长和最大荧光发射波长，分别为452nm和530nm，将步骤（2）处理好的样品在最大激发波长和最大荧光发射波长下进行三次平行测定，然后取其平均值，根据公式（1）计算出VB₂药片中核黄素的质量分数ω。

试验例

1、波长的选择

无论核黄素标准溶液浓度如何变化，发射波长和激发波长都不变。取配置好的核黄素标准使用液（1μg/mL），扫描图谱，根据图谱可得最大激发波长和最大发射波长分别为452nm和530nm。因此，本实验选取的最大激发波长和最大荧光发射波长分别为452nm和530nm。

2、单因素试验

2.1蛋黄

2.1.1盐酸提取溶液体积的确定

将煮熟的鸡蛋黄研细，称取质量为20.0000g鸡蛋黄置于250mL锥形瓶中，分别加入0. 1mol/L盐酸50mL、60mL、70mL、80mL和90mL，搅拌直到颗粒物分散均匀，然后按照实施例2记载方法进行水解、酶解、过滤、氧化去杂质后，定容至25mL，平行测定三次，取平均值，实验结果如图1所示。

由图1可知，分别加入0.1mol/L盐酸50mL、60mL、70mL、80mL、90mL，测得的相对荧光值相差不大。当加入50mL、60mL、70mL盐酸时相对荧光值呈上升趋势，说明随着盐酸体积的增加，核黄素提取得越多；而加入70mL、80mL、90mL盐酸时相对荧光值呈下降趋势，表明随着盐酸体积的增加，酸度增大，稳定性下降，说明核黄素只有在酸度适宜的溶液中稳定。因此，加入0. 1mol/L盐酸70mL提取液较为适宜。

2.1.2酶解pH的选择

在0.1mol/L盐酸为70mL的条件下，在pH4～8之间进行酶解。将煮熟的鸡蛋黄研细，称取质量为20.0000g鸡蛋黄于250mL锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸70mL，按照实施例2记载方法进行水解提取，水解液冷却后，滴加1moL/L氢氧化钠，分别调节pH为4.500、5.500、6.500、7.500、8.500。然后按照实施例2记载方法进行酶解、过滤、氧化去杂质后，平行测定三次，取平均值，实验结果如图2所示。

由图2可知，pH分别为4.500、5.500、6.500、7.500、8.500时，测得的相对荧光值无明显变化，而pH等于5.500时，测得的相对荧光值最大。因此，本实验选择pH=5.500为最佳实验条件。

2.1.3低亚硫酸钠溶液体积的选择

将煮熟的鸡蛋黄研细，称取质量为20.0000g鸡蛋黄置于250mL锥形瓶中,然后按照实施例2记载方法进行水解提取、酶解、过滤和定容至100mL后，分别于6个25mL的带盖刻度试管中加入10mL鸡蛋黄提取液，按照实施例2记载方法进行氧化去杂质，定容至25mL，混匀后，加入0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL 20g/100mL低亚硫酸钠溶液，混匀后，平行测定三次，取平均值，测定结果如图3所示。

图3可以看出，当加入0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL低亚硫酸钠时，相对荧光值随着低亚硫酸钠体积的增加而逐渐降低，说明随着低亚硫酸钠体积的增加，鸡蛋黄中核黄素逐渐被还原为无荧光物质；当加入0.40mL、0.50mL、0.60mL低亚硫酸钠时，相对荧光值随着低亚硫酸钠体积的增加而基本保持不变，说明鸡蛋黄中的核黄素已经全部被还原为无荧光物质，而加入0.40mL低亚硫酸钠时，鸡蛋黄中核黄素已经全部被还原了。因此，实验选择低亚硫酸钠体积为0.50mL。

2.1.4核黄素标准溶液体积的确定

将煮熟的鸡蛋黄研细，称取质量为20.0000g鸡蛋黄于250mL锥形瓶中，按照实施例2记载方法进行水解提取、酶解、过滤、定容后，分别于8个25mL的带盖刻度试管中加入10.00mL鸡蛋黄提取液，在3、4、5、6、7、8号管中分别加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL1μg/mL核黄素标准使用液，1号管和2号管不加标准溶液，向1号管中加入0.50mL 20g/100mL低亚硫酸钠溶液，各管加水至16mL，按照实施例2记载方法进行氧化去杂质，定容至25mL，混匀，各管在相同条件下平行测定三次，取平均值，仿照公式(3)计算出干基鸡蛋黄核黄素的质量分数，然后和国标方法进行比较，结果如表1。

由表1可知，加入不同体积核黄素标准使用液测得的干基鸡蛋黄中核黄素含量相近。但加标1.00mL、2.00mL测得鸡蛋黄核黄素含量和国标法最接近，因此，本实验选择加标1.00mL、2.00mL核黄素标准使用液为最佳实验条件。

2.2维生素B₂药片

2.2.1盐酸提取溶液体积的确定

称取质量约为0.0500g研细干燥的维生素B₂药片于250mL锥形瓶中，分别加入0.1mol/L盐酸50mL、60mL、70mL、80mL和90mL，搅拌直到颗粒物分散均匀，然后按照实施例3记载方法进行水解、酶解、过滤、氧化去杂质后，定容至25mL，平行测定三次，取平均值，实验结果如图4所示。

由图4可知，分别加入50mL、60mL、70mL、80mL、90mL盐酸，测得的相对荧光值相差不大。当加入50mL、60mL、70mL盐酸时相对荧光值呈上升趋势，说明随着盐酸体积的增加，核黄素提取得越多；而加入80mL、90mL盐酸时相对荧光值呈下降趋势，表明随着盐酸体积的增加，酸度增大，稳定性下降，说明核黄素只有在酸度适宜的溶液中稳定。因此，加入0.1mol/L盐酸70mL为最佳实验条件。

2.2.2酶解 pH的选择

称取0.0500g研细干燥的维生素B₂药片于250mL锥形瓶中，分别加入>

由图5可知，酶解液pH等于5.500时，测得的相对荧光值最大。因此，本实验选择pH=5.500为最佳实验条件。

2.2.3低亚硫酸钠溶液体积的确定

称取0.0500g研细干燥的维生素B₂药片倒入250mL锥形瓶中，按照实施例3记载方法进行水解提取、酶解、过滤和定容至100mL后，分别于6个25mL的带盖刻度试管中加入1.00mL维生素B₂药片提取液，按照实施例3记载方法进行氧化去杂质，定容至25mL，混匀后，加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL>

图6可看出，加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL 低亚硫酸钠时，相对荧光值随着低亚硫酸钠体积的增加而逐渐降低，说明随着低亚硫酸钠体积的增加，维生素B₂药片中核黄素逐渐被还原为无荧光物质；当加入4.00mL、5.00mL、6.00mL低亚硫酸钠时，相对荧光值随着低亚硫酸钠体积的增加而基本保持不变，说明维生素B₂药片中的核黄素已经全部被还原为无荧光物质，实验选择低亚硫酸钠体积为5.00mL。

2.2.4核黄素标准溶液体积的选择

称取0.0500g研细干燥的维生素B₂药片于250mL锥形瓶中，按照实施例3记载方法进行水解提取、酶解、过滤、定容后，分别于10个25mL的带盖刻度试管中加入1.00mL维生素B₂药片提取液，在3、4、5、6、7、8、9、10号管中分别加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL1μg/mL核黄素标准使用液，1号管和2号管不加标准溶液，向1号管中加入5.00mL20g/100mL低亚硫酸钠溶液，加水至15mL，按照实施例3记载方法进行氧化去杂质，定容至25mL，混匀。混匀后，各样品在完全相同的条件下平行测定三次，取平均值，根据公式(1)计算出维生素B₂药片核黄素的质量分数，然后和国标方法进行比较，结果如表2。

由表2可知，加入不同体积核黄素标准使用液测得的药片中核黄素含量相近。但加标.1.00mL、2.00mL测得的结果和国标最接近，因此，本实验选择加标1.00mL、2.00mL核黄素标准使用液进行差异加标测定。

3样品的测定结果

在最佳条件下，对20.0000g鸡蛋黄和0.0500g维生素B₂药片分别平行测定6次，实验结果如表3和表4。

由表3和表4可得干基鸡蛋黄样品中核黄素含量为402μg/100g，维生素B₂药片核黄素含量为7.9>2药片测定的相对标准偏差分别为0.88%和1.0%，测定精密度良好。

4加标回收率

称取20.0000g鸡蛋黄和0.0500g维生素B₂药片分别按照实施例2和实施例3进行样品处理，然后进行加标回收率实验，实验结果如下表：

由表5和表6可得鸡蛋黄和维生素B₂药片回收率分别为92%～104%和90%～96%。

5检出限和定量限

取荧光值接近于空白，浓度较低的核黄素标准使用液进行11次平行测定，计算出标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量限。得核黄素检出限为5.79ng/mL，定量限为1.92×10^-2μg/mL。

6测定结果方法验证

分别按照实施例2和实施例3样品测定方法对鸡蛋黄和VB₂药片进行测定，对同一样品和国标法对照分析，各进行6次平行测定，检验无可疑值后，取平均值报告，结果如表7。

根据表7分子荧光差异加标法和国标法的标准偏差和平均值，进行F检验和t检验：

F检验法

鸡蛋黄

维生素B₂药片

计算自由度f：f_大=n－1=5，f_小=n－1=5，查相关表得F_表=5.05，计算出的F₁值和F₂值都小于表中的F值。所以，这两种方法的精密度不存在显著性差异，结论的置信度为>

t检验法

鸡蛋黄

维生素B₂药片

计算自由度：f=6＋6－2=10，查相关表，置信度为95%时，t_表=2.23，t₁值和t₂值都小于t_表值。所以，两种方法的平均值不存在显著的系统误差。

经过F检验和t检验，分子荧光差异加标法和国标法的精密度和平均值都不存在显著性差异，结论的置信度为 95%。分子荧光差异加标法测量结果准确，适合核黄素含量的快速测定。

本发明研究了盐酸提取液体积、酶解pH、加标量对鸡蛋黄、维生素B₂药片中核黄素荧光值的影响，实验确定了鸡蛋黄、维生素B₂药片提取液为0.1mol/L>2药片中核黄素含量为7.9>2药片相对标准偏差为1.0%(n=6)；鸡蛋黄加标回收率为92.0%～104%，维生素B₂药片加标回收率为90.0%～96.0%；检出限为5.76n>-2μg/mL。该方法与国标方法进行比较，经过F检验法和t检验法，两种方法的精密度和平均值都不存在显著性差异。本发明方法只需采用两个加标浓度不同的试液，用四份同体积试液在相同条件下测定的发光信号，快速获得测定结果，无需绘制工作曲线和过柱去杂质，方法扣除了样品试液中背景发光值以及浓度差异所可能带来的一部分干扰，提高了测定准确度和工作效率，简便、快速，是适合样品中核黄素含量测定的新型分析技术，有较强的创新性。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，该方法也可用来测定其他样品中的诸多分子发光的物质，包括分子荧光、分子磷光、化学发光、生物发光等定量分析中所能够测定的相关物质和组分。