一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法

摘要

本发明提供了一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。该方法步骤如下：通过检测新鲜烟叶中植醇和角鲨烯含量，计算其比值，采用气相色谱串联质谱GC‑MS对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析，为代谢组学合格样品的选择提供依据。本发明具有准确可靠，简单可行的特点，可为烟叶代谢特征分析及相关烟叶代谢组学研究提供借鉴。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体说是涉及一种判别烟草代谢组学研究所用的新鲜烟叶样品质量是否满足代谢组学研究需要的判别方法。

背景技术

植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后期代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究植物体的一种技术。在代谢组学轮廓分析的流程中，典型样品的采集是首要并且极其重要的步骤，获得合格样品，以真实客观的反映样品的代谢状态，是代谢组学分析进行的基础和前提。新鲜烟叶样品的采集，需要在低温下淬灭以停止其生理活动以保证其停止在采样时的代谢状态，标准做法为采摘植物样品后，锡纸包裹，置于-196℃液氮冷冻，用于新鲜烟叶样品分析或者冻干后干粉样品分析。在样品采摘到分析前的这一段过程，需保证新鲜烟叶样品在液氮中保存且在液氮条件下研磨，否则会造成烟叶的酶促褐变。由于烟叶样品保存不当而导致的质量发生变化，代谢物水平不能反映烟叶样品真实状态的情况时有发生。急需一种简单、快速的分析方法对植物代谢组学研究中的烟叶样品质量进行判别。

烟叶萜类化合物与烟叶香气品质密切相关，它们不但是烟叶重要的香气前提物质，而且它们的降解产物是烟叶最重要的香气来源之一。同时，萜类代谢是烟叶的重要次生代谢途径之一，挥发性萜类化合物在植物对环境胁迫的适应、植物与植物之间的相互竞争和协同进化、植物对昆虫的危害、草食性动物的采食及病原微生物的侵袭等过程的防御中起着重要作用。近年来有关烟叶中萜类化合物的分离、鉴定及检测取得了一定进展，但未曾有人提出将新鲜烟叶中的萜类化合物含量或含量比值用于代谢组学新鲜烟叶样品质量的判别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法。本发明利用新鲜烟叶中植醇和角鲨烯含量的比值对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别，该法操作简单快速，结果准确可靠。

本发明的目的是通过下述技术措施来实现：

本发明的基于萜类的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法通过检测新鲜烟叶中植醇和角鲨烯含量，计算其比值，采用气相色谱串联质谱GC-MS对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析；具体制备方法如下：

a、称取10~25mg的冻干研磨烟叶样品，加入提取溶剂正己烷0.75~1.5 mL，室温下超声提取30min，离心，将上清液转移到样品瓶中，并用氮气吹干；提取后的残渣加入0.6~1.2 mL由甲醇和氢氧化钾溶液按4:1的体积比组成的混合液，70℃下振荡提取30min，离心，将上清液转移到Eppendorf管中；加入0.5~1.0mL正己烷，进行萃取；涡旋6 s，离心1 min；之后转移到上述样品瓶中，并用氮气吹干；衍生化：加入50~100μL 20mg/mL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液，40~60℃反应60~90分钟，再加入50~100 μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在40~60℃条件下反应30~90分钟，进GC/MS分析，采用保留时间和选择离子（SIM）模式定性，检测萜类物质的含量；

b、GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f. )；程序升温：起始温度60℃（3 min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）。载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；进样量 2 µL，分流进样，分流比 10:1；

c、GC/MS分析方法的质谱参数：电离电压：70 ev；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；定量离子对如下：法尼醇（135>107），叶绿醇（123>87），氘代十八烷酸（IS）（376>136），α-西柏三烯二醇（156>141），β-西柏三烯二醇（156>141），角鲨烯（149>107），环氧化鲨烯（135>107），胆固醇（329>121），菜油甾醇（255>173），豆甾醇（255>173），谷甾醇（396>255），香树脂醇（218>203）。

本发明中所述冻干研磨烟叶样品为由大田采摘的新鲜烟叶样品置于-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低温冻干，-80℃冰箱保存待用的烟叶末。

本发明中所述提取溶剂中添加有5~20μL 2mg/mL内标氘代十八烷酸。

本发明中所述采用气相色谱串联质谱GC-MS对新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析的分析步骤如下：GC-MS分析数据可定性新鲜烟叶中的植醇和角鲨烯，通过绘制标准曲线可对所测得的植醇和角鲨烯进行绝对定量，将植醇和角鲨烯含量的比值作为区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，即待测样品中植醇和角鲨烯含量的比值在120以上的为合格样品，可用于代谢组学分析，植醇和角鲨烯含量的比值在120以下的为变质的不合格样品，不可用于代谢组学分析。

本发明经过大量新鲜烟叶样品的分析研究，发现新鲜烟叶样品如果保存不当，其萜类化合物含量会发生变化，植醇和角鲨烯含量的比值也会明显降低，此类样品将不能用于代谢组学分析。因此可以以植醇和角鲨烯含量的比值作为一个标准对代谢组学研究中的新鲜烟叶样品质量进行判别。

本发明的有益效果如下：

本发明利用新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯含量的比值和样品质量的相关性，对代谢组学新鲜烟叶样品质量进行判别，相比现有技术具有以下特点：1）操作简单快速；2）结果准确可靠；3）样品用量少，可为烟叶代谢特征分析及相关烟叶代谢组学研究提供借鉴。

具体实施方式

本发明以下将结合实施例作进一步描述：

本发明中所述采用气相色谱串联质谱GC-MS对新鲜烟叶样品中植醇和角鲨烯进行绝对定量分析的分析步骤如下：GC-MS分析数据可定性新鲜烟叶中的植醇和角鲨烯，通过绘制标准曲线可对所测得的植醇和角鲨烯进行绝对定量，将植醇和角鲨烯含量的比值作为区分代谢组学合格样品及变质的不合格样品的标准，即待测样品中植醇和角鲨烯含量的比值在120以上的为合格样品，可用于代谢组学分析，植醇和角鲨烯含量的比值在120以下的为变质的不合格样品，不可用于代谢组学分析。以下不再赘述。

实施例1

采用GC-MS方法测定新鲜烟叶样品中的萜类化合物含量，发现褐化样品的植醇和角鲨烯含量比值明显降低。

待测样品包括福建、贵州、湖南、河南、云南等省份的6个品种、17个产地的新鲜烟叶样品97份（每个点有5~6个生物学重复）。其中包括81份合格样品（样品在采集、运送及预处理过程中均严格控制在-80℃），16份褐变样品（由于储运过程中液氮不足等原因已完全褐变）。

样品分析步骤如下所述：

1）由大田采摘的新鲜烟叶样品，于-196℃液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低温冻干，-80℃冰箱保存待后续进行代谢组学分析；称取20~25mg冻干研磨烟叶样品，加入提取溶剂正己烷1.5 mL（含20 μL 的2mg/mL 氘代十八烷酸），室温下超声提取30min，离心，将上清液转移到样品瓶中，并用氮气吹干；提取后的残渣加入1.2mL由甲醇和氢氧化钾溶液按4:1的体积比组成的混合液，70℃下振荡提取30min，离心，将上清液转移到Eppendorf管中，加入1mL正己烷，进行萃取；涡旋6 s，离心1 min后转移到上述样品瓶中，并用氮气吹干；衍生化：加入50~100μL 20mg/mL甲氧胺盐酸盐-吡啶溶液，40~60℃反应60分钟以上，再加入50~100 μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，40~60℃反应30分钟以上，进GC/MS分析，采用保留时间和选择离子（SIM）模式定性，检测萜类物质的含量；

2）GC/MS分析方法的气相色谱参数：色谱柱：DB-35MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f. )；程序升温：起始温度60℃（3 min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）。载气：氦气；柱流速：1.0 mL/min；进样口温度：250℃；进样量 2 µL，分流进样，分流比 10:1。

3）GC/MS分析方法的质谱参数：电离电压：70 ev；离子源温度：250 ℃；传输线温度：280 ℃；定量离子对如下：法尼醇（135>107），叶绿醇（123>87），氘代十八烷酸（IS）（376>136），α-西柏三烯二醇（156>141），β-西柏三烯二醇（156>141），角鲨烯（149>107），环氧化鲨烯（135>107），胆固醇（329>121），菜油甾醇（255>173），豆甾醇（255>173），谷甾醇（396>255），香树脂醇（218>203）。

绘制了植醇（0.12-29.6 μg/mL）与角鲨烯（0.31-12.32 μg/mL）的标准曲线。以目标物峰面积与内标物峰面积（氘代十八烷酸）的比值为纵坐标Y，质量浓度X（μg/mL）为横坐标，计算其标准曲线及相关系数，测定结果如下：Y（植醇）=231.8X，Y（角鲨烯）= 860.4X-323.5，相关系数分别为0.995和0.999。

在上述条件下获得了97份新鲜烟叶中植醇等11种萜类化合物的绝对含量，发现植醇与角鲨烯含量的比值变化显著，详细数据见表1。

表1 实施例1中烟叶样品信息及植醇与角鲨烯含量的比值

样品编号产地品种重复数植醇/角鲨烯是否合格C23Y贵州毕节云97652.2-99.1不合格C01K云南昆明K3265397.9-635.8合格C02K云南玉溪K3266200.3-263.5合格C03C云南曲靖云876250.5-367.4合格C04Y云南红河云976149.1-267.7合格C05Y云南普洱云876176.2-576.6合格C06Y云南大理云875282.1-399.6合格C09Y贵州黔西南云976246.8-444.5合格C12C河南平顶山中烟1006279.3-481.8合格C13C河南南阳中烟1005151.9-352.7合格C14C河南驻马店中烟1006179.3-375.6合格C15K广东韶关K3266280.3-385.7合格C17K湖南郴州K3266165.4-338.8合格C25N贵州铜仁南江3号6174.1-242.5合格C26Y湖北恩施云876145.2-190.2合格C29K湖南张家界K326541.7-116.8不合格C24B贵州黔南贵烟2号597.9-112.6不合格

经过以上实验，发明人发现褐化样品中的植醇与角鲨烯含量的比值显著降低。本发明将植醇与角鲨烯含量的比值作为区分代谢组学正常样品与变质样品的标准。即待测样品中植醇与角鲨烯含量的比值在120以上的为正常样品，可用于代谢组学分析，植醇与角鲨烯含量的比值在120以下的为变质样品，不可用于代谢组学分析。