鉴定梯棱羊肚菌交配型的方法和特异引物对

摘要

本发明涉及一种鉴定梯棱羊肚菌交配型的方法和特异引物对，属于生物学技术领域。所述的引物对包括检测交配型MAT1‑1的特异引物对P8‑4F/P8‑4R和检测交配型MAT1‑2的特异引物对P6‑1F/P6‑1R。该方法为提取菌株DNA，分别用两对引物对进行PCR扩增，若电泳检测都得到预期条带，则菌株包含两种交配型基因，是有效栽培菌株；若只能检测到一种扩增条带，则菌株只有一种交配型，不能用于栽培。本发明的检测结果特异性强，稳定可靠快速，适用于羊肚菌菌种选育、栽培、交配型基因和系统发育方面的研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种鉴定梯棱羊肚菌（Morchella>importuna）交配型的方法和特异引物对。本发明技术适用于羊肚菌菌种选育、栽培、交配型基因和系统发育方面的研究。

背景技术

子囊菌的有性生殖目前认为由单一交配位点MAT1控制，这个交配位点包括以MAT1-1-1基因为特征的MAT1-1交配型和以MAT1-2-1基因为特征的MAT1-2 交配型。同宗交配的子囊菌自交可育，而异宗交配的子囊菌自交不育，必须由分别具有交配型MAT1-1和交配型MAT1-2的个体交配后才能完成有性生殖。

梯棱羊肚菌是一种经济价值较高的美味食用菌，目前野生干品价格在2000元/公斤左右。近几年，梯棱羊肚菌的人工栽培获得成功并在全国兴起热潮，很多地方纷纷大面积商业化种植，但不出菇的情况经常发生，有时甚至出现整个大棚或田块1个羊肚菌都不出，究其原因除气候环境因素外，最主要的就是菌种问题，确保菌种的可靠是首要的技术关键。

我们对梯棱羊肚菌基因组测序，获得其MAT1-1-1和MAT1-2-1基因全长序列，通过单子囊孢子交配型比例分析并结合交配位点结构分析，证实梯棱羊肚菌是异宗交配型真菌，有性生殖过程（出菇）需要两种配型个体结合才能完成。羊肚菌的孢子分离和组织分离都有可能只得到一种交配型的菌株，而菌种的继代培养过程中也会出现一种交配型丢失的现象。因此，对菌株交配型的检测是获得有效栽培菌株的关键。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种鉴定梯棱羊肚菌交配型的方法和特异引物对，该方法是通过检测两对特异引物对PCR扩增后条带的有无，鉴定梯棱羊肚菌菌株的交配型，从而确定是否为有效栽培菌株，并为杂交育种提供可靠的待选菌株。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

鉴定梯棱羊肚菌交配型的方法，包括用于检测交配型MAT1-1的特异引物对P8-4F/P8-4R，用于检测交配型MAT1-2的特异引物对P6-1F/P6-1R，相应的PCR扩增体系和扩增程序；

所述的P8-4F/P8-4R特异引物对中：

P8-4F的核苷酸序列为5’-GCTCTCTTGTGCCCCTTTTGACTAT-3’；（SEQ ID No.1）

P8-4R的核苷酸序列为5’-TCTACCAGCCATGTGAAACAAGCAA-3’ ；（SEQ ID No.2）

所述的P6-1F/P6-1R特异引物对中：

P6-1F的核苷酸序列为5’-GAGACTCAAATCTGACTGACTTCCT-3’（SEQ ID No.3）

P6-1R 的核苷酸序列为5’-GAAGAACCTCAGATAAGCGTAAAAT-3’。（SEQ ID No.4）

进一步，优选的是，鉴定交配型MAT1-1和MAT1-2的PCR扩增体系相同，均包括2×PCRmix 12.5 µL，10 µM/L 的正反向引物各1 µL，DNA模板10 ng， ddH₂O补足至25>

进一步，优选的是，鉴定MAT1-1交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 sec，60℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸10 min；

鉴定MAT1-2交配型的PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸10 min。

检测梯棱羊肚菌菌株的MAT1-1交配型时，可以获得大小为1837bp唯一条带，且该条带包含了MAT1-1-1全长基因；检测梯棱羊肚菌菌株的MAT1-2交配型时，可以获得大小为1744bp唯一条带，且该条带包含了MAT1-2-1全长基因。

本发明提供鉴定梯棱羊肚菌交配型的PCR引物对，包括用于检测交配型MAT1-1的特异引物对P8-4F/P8-4R和用于检测交配型MAT1-2的特异引物对P6-1F/P6-1R。

本发明还要求保护上述PCR 引物对的鉴定梯棱羊肚菌交配型的试剂及试剂盒。

本发明还提供上述PCR 引物对、试剂或试剂盒在鉴定梯棱羊肚菌交配型中的应用。

本发明同时提供上述PCR 引物对、试剂或试剂盒在鉴定梯棱羊肚菌育种的应用。

在本发明中，用引物对P8-4F/P8-4R 扩增出1837bp左右唯一条带，表明菌株含MAT1-1交配型；用引物对P6-1F/P6-1R 扩增出1744bp左右唯一条带，表明菌株含MAT1-2交配型；两对引物对PCR扩增都能检测到预期条带的菌株，含有两种交配型，可以作为有效栽培菌株，而只具有单一交配型的菌株，不能用于栽培，可以作为杂交育种的备选菌株。

本发明基于基因组测序获得的两个交配基因序列的特征，设计了两对特异引物，分别用于梯棱羊肚菌菌株MAT1-1和MAT1-2交配型的检测。扩增条带为单一条带，条带的有无即可确定菌株的交配型，结果稳定可靠。

本发明中所涉及的梯棱羊肚菌的交配基因序列和检测方法目前国内外均未报道。通过本发明的引物，可扩增得到MAT1-1-1和MAT1-2-1 基因的全长序列，对于羊肚菌的有性生殖和系统进化研究都有重要意义。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

梯棱羊肚菌MAT1-1-1和MAT1-2-1基因序列目前国内外皆未见报道，利用本发明的两对引物对，可以扩增得到这两个基因的全长序列，不仅可以通过扩增条带的有无鉴定梯棱羊肚菌菌株的交配型，而且可以用于进一步有性生殖和系统进化方面的研究。梯棱羊肚菌栽培中，由于菌种问题带来每亩的直接经济损失在4000元以上。通过本技术的应用，可以在4小时内鉴定出是否为有效的栽培菌株，每个样品的检测成本只需50元左右,由此带来的社会效益明显。

附图说明

图1为梯棱羊肚菌YPL6单子囊孢子群体交配型MAT1-1检测电泳图：M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp）；1-24代表梯棱羊肚菌单子囊孢子菌株YPL6-1—YPL6-24。

图2为梯棱羊肚菌YPL6单子囊孢子群体交配型MAT1-2检测电泳图：M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；1-24代表梯棱羊肚菌单子囊孢子菌株YPL6-1—YPL6-24。

图3为梯棱羊肚菌有效栽培菌株检测电泳图：M代表Marker-DL2000（图中从上到下的条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp）；1、2、3、4分别是菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7检测MAT1-1交配型；5、6、7、8分别是菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7检测MAT1-2交配型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1梯棱羊肚菌YPL6单子囊孢子群体交配型鉴定

梯棱羊肚菌YPL6单子囊孢子群体菌株YPL6-1—YPL6-24接种在PDA培养基上，23℃培养10d，挑取适量菌丝体，CTAB法提取DNA，取3 µL在1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度。

分别以YPL6-1—YPL6-24的DNA为模板，用引物对P8-4F/P8-4R进行PCR扩增，25µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P8-4F、P8-4R引物各1 µL， DNA模板1µL，ddH₂O>

分别以YPL6-1—YPL6-24的DNA为模板，用P6-1F/P6-1R引物对进行PCR扩增，25 µL扩增体系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5 µL，10 µM/L 的P6-1F、P6-1R引物各1 µL， DNA模板1 µL，ddH₂O>

所有扩增产物在1.2%（W/V）琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图1和图2，菌株YPL6-2、YPL6-3、YPL6-5、YPL6-7、YPL6-9、 YPL6-10、YPL6-11、YPL6-17 、YPL6-20、YPL6-21、YPL6-23在引物对P8-4F/P8-4R扩增时有1.8kb左右唯一条带，而用P6-1F/P6-1R引物对扩增时无条带，鉴定为交配型MAT1-1菌株。菌株YPL6-1、YPL6-4、YPL6-6、YPL6-8、YPL6-12、 YPL6-13、YPL6-14、YPL6-15 、YPL6-16、YPL6-18、YPL6-19、YPL6-22、YPL6-24在引物对P8-4F/P8-4R扩增时无条带，而引物对P6-1F/P6-1R扩增时有1.7kb左右唯一条带，鉴定为交配型MAT1-2菌株。

实施例2 梯棱羊肚菌有效栽培菌株的鉴定

待测菌株为梯棱羊肚菌菌株SP1、SP2、YPL6、YPL7，菌株培养、DNA提取、PCR扩增体系和扩增程序同实施例1。

扩增产物在1.2%(W/V)琼脂糖凝胶上电泳检测，结果见图3，SP2、YPL6、YPL7菌株用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R引物对PCR扩增都有条带，说明具有两种交配型，是有效栽培菌株。而SP1菌株用P8-4F/P8-4R引物对扩增时无条带，P6-1F/P6-1R引物对扩增有条带，为MAT1-2交配型菌株，不能作为栽培菌株。菌株YPL6、YPL7栽培后已出菇。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID No.1

GCTCTCTTGT GCCCCTTTTG ACTAT 25

SEQ ID No.2

TCTACCAGCC ATGTGAAACA AGCAA 25

SEQ ID No.3

GAGACTCAAA TCTGACTGAC TTCCT 25

SEQ ID No.4

GAAGAACCTC AGATAAGCGT AAAAT 25

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 鉴定梯棱羊肚菌交配型的方法和特异引物对

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GCTCTCTTGT GCCCCTTTTG ACTAT 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

TCTACCAGCC ATGTGAAACA AGCAA 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

GAGACTCAAA TCTGACTGAC TTCCT 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GAAGAACCTC AGATAAGCGT AAAAT 25

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