一种用于抑制簇集蛋白基因表达的成套siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种用于抑制簇集蛋白基因表达的成套siRNA及其应用。本发明提供的siRNA，由正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链由19‑27个核苷酸组成，且所述正义链从5’末端起5‑9个连续核苷酸和从3’末端起5‑9个连续核苷酸均进行2＇－核糖修饰。本发明的实验证明，上述siRNA分子混合物提高了寡核酸抑制基因表达的概率；整体上提升了抑制效率；同时降低了脱靶效应；且其在应用过程中，省去了前期对单一RNAi分子的复杂设计、筛选、验证与优化的过程，操作简单、节省成本，是一种通用、有效、快速的RNAi工具。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于抑制簇集蛋白基因表达的成套siRNA及其应用。

背景技术

RNAi广泛存在于自然界的物种中，自Andrew Fire和Craig Mello等人1998年在线虫(Caenorhabditis elegans)中首次发现RNAi现象，Tuschl和Phil Sharp等人2001年证实在哺乳动物中也存在RNAi之后，关于RNAi的机制原理、基因功能和临床应用等研究取得了一系列的进展；RNAi不仅在防御病毒感染，防转座子跳跃等多种机体保护机制中发挥关键作用(Huntvagner et al,2001；Tuschl,2001；Waterhouse et al,2001；Zamore 2001)，其相关产品也是十分有前景的候选药物。

簇集蛋白(Clusterin，CLU)是异二聚体硫酸糖蛋白(sulfatealglycoprotein，SGP-2)，最早于1983年在睾丸液中分离出来，其后发现CLU广泛存在于人类及动物的许多组织中，如：睾丸、附睾、肾脏、心脏、肺脏、子宫、卵巢、乳腺及前列腺，也几乎存在于包括血浆、乳汁、尿液、脑脊液和精液等所有体液中。其中，其在睾丸、附睾、肝、肾等脏器表达较高。簇集蛋白是一种多功能蛋白，参与多种生理生化过程，如介导细胞聚集、参与脂质交换和运输、稳定细胞膜、促进生殖功能等；最近发现，其在细胞周期调节、细胞凋亡、DNA损伤，细胞黏附，组织重塑中也起到重要作用。

由于选择性剪接的结果，Clusterin有两种主要的亚型：分泌型Clusterin(sCLU)和核型Clusterin(nCLU)。sCLU是Clusterin的主要形式，其具有细胞保护作用，是一种相对分子量为76-80ku的糖基化蛋白。研究发现簇集蛋白的分泌型蛋白质(sCLU))在EMT(上皮至间充质转变)期间受到刺激，并且本身可以促进EMT过程(Lenferink,A.E.,C.Canti等人(2009).“Transcriptome Profiling of a TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition reveals extracellular clusterin as a target fortherapeutic antibodies.”Oncogene29:831)，而EMT会导致肿瘤侵袭和化疗抗性。用能与sCLU中特定区域相互作用的寡核酸阻断EMT，可导致肿瘤生长抑制和针对细胞毒药物的反应增加。

Clusterin在肿瘤的发生和发展中可能起着重要的作用(Oncogene.，2004，23，2298-304)，对其抑制剂的开发有利于对Clusterin相关疾病(如肿瘤)的机制研究与药物研制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抑制或降低靶基因CLU表达的siRNA。

本发明提供的siRNA，由正义链和与其完全反向互补的反义链组成；

所述正义链由19-27个核苷酸组成，且所述正义链从5’末端起5-9个连续核苷酸和从3’末端起5-9个连续核苷酸均进行2＇－核糖修饰；

所述反义链与所述靶基因CLU上的区段反向互补。

抑制率至少为65％，70％，75％，80％，85％，90％。

siRNA通过其反义链与靶基因CLU上的靶序列反向互补结合；

上述siRNA中，所述正义链由24、25或26个核苷酸组成；

或，所述正义链从5’末端起6或7或8个连续核苷酸和从3’末端起6或7或8个连续核苷酸均进行2＇－核糖修饰。

上述siRNA中，所述2＇－核糖核糖修饰为2＇-O-甲基修饰、2＇-O－氟代修饰、2＇-脱氧修饰或2＇-MOE修饰。

所述siRNA为如下任一种：

1)所示的siRNA由序列1所示的正义链和序列2所示的反义链组成，且序列1自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

2)所示的siRNA由序列3所示的正义链和序列4所示的反义链组成，且序列3自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

3)所示的siRNA由序列5所示的正义链和序列6所示的反义链组成，且序列5自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

4)所示的siRNA由序列7所示的正义链和序列8所示的反义链组成，且序列7自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

5)所示的siRNA由序列9所示的正义链和序列10所示的反义链组成，且序列9自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

6)所示的siRNA由序列11所示的正义链和序列12所示的反义链组成，且序列11自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

7)所示的siRNA由序列13所示的正义链和序列14所示的反义链组成，且序列13自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

8)所示的siRNA由序列15所示的正义链和序列16所示的反义链组成，且序列15自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

9)所示的siRNA由序列17所示的正义链和序列18所示的反义链组成，且序列17自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰；

10)所示的siRNA由序列19所示的正义链和序列20所示的反义链组成，且序列19自5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均进行2＇-O-Me修饰。

本发明另一个目的是提供一种抑制或降低靶基因CLU表达的成套siRNA。抑制率至少为70％、75％、80％、85％、90％。

本发明提供的成套siRNA，包括至少5个上述的siRNA。

上述成套siRNA中，所述成套siRNA中任2个siRNA的物质的量比为1:1-1:5；

或，所述成套siRNA中各siRNA为等物质的量比混合。

上述成套siRNA中，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA-7)所示的siRNA共7个siRNA组成；

或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的2)所示的siRNA-7)所示的siRNA共6个siRNA组成；

或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA、2)所示的siRNA、4)所示的siRNA、5)所示的siRNA和7)所示的siRNA共5个siRNA组成；

或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA-10)所示的siRNA共10个siRNA组成。

本发明第三个目的是提供如下1)或2)的物质。

本发明提供的如下1)或2)的物质：

1)抑制或降低靶基因CLU表达的试剂，其为如下A或B：

A包括上述的siRNA和转染试剂；

B包括上述的成套siRNA和转染试剂；

2)抑制或降低靶基因表达的试剂盒，其包括上述的siRNA或上述的成套siRNA或所述试剂。

上述物质中，所述成套siRNA中所有siRNA分子在所述试剂中的总浓度为2-100nM。

上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在抑制或降低靶基因CLU表达中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在抑制或降低细胞中靶基因CLU表达中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低靶基因CLU表达产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低细胞中靶基因CLU表达中产品的应用也是本发明保护的范围；

或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备预防或缓解或治疗由靶基因CLU表达引起的疾病中的产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第四个目的是提供一种抑制或降低靶基因CLU表达的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将抑制或降低靶基因CLU表达的siRNA的正义链从5’末端起5-9个连续核苷酸和从3’末端起5-9个连续核苷酸均进行2＇－核糖修饰；

所述siRNA由正义链和与其反向互补的反义链组成；

所述正义链由19-27个核苷酸组成；

所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补；

或所述2＇－核糖修饰具体为2＇-O-甲基修饰、2＇-O-氟代修饰、2＇-脱氧修饰或2＇-MOE修饰。

本发明第四个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，包括上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质；

和/或，所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：

1)抑制或降低CLU基因表达；

2)抑制或降低细胞中CLU基因表达；

3)预防或缓解或治疗由CLU基因表达引起的疾病；

或，所述细胞为真核生物细胞或原核生物细胞；

或，所述细胞具体为细胞为脊椎动物细胞、哺乳类动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞，靶基因异常表达或有基因缺陷癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、血液细胞、白细胞、脑细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、乳腺细胞、宫颈细胞、内皮细胞、神经细胞或神经胶质细胞；

或，所述细胞具体为HeLa、293T、A549或HUVEC细胞；

或，所述产品具体为药物。

本发明的“抑制”或类似表达可指RNA或蛋白水平或相关生化指标的表达、活性或指标相对阴性对照的降低。

siRNA分子混合物中单个siRNA分子的浓度可以是随机的，优选其最低浓度和最高浓度的siRNA的浓度为1：1至1：5，更优选单个siRNA分子的浓度相等。

本发明是通过向细胞引入siRNA分子或其混合物，抑制靶基因的表达；引入可以为直接引入或间接引入，除使用转染试剂外，其他已知的各种将siRNA分子递送如细胞的方式都可采用，如注射、载体转染(载体可以是质粒或病毒)、电穿孔，脂质体转染。

本发明的siRNA分子是指小的单链或双链RNA分子,其具备至少一个双链区，通过siRNA作用，促进靶向mRNA的降解。

“互补”是指核碱基之间配对的能力。

本发明中也可用碱基或碱基长度来表示核苷酸或RNA分子链的长度。

在发明的一些实施例中,siRNA分子中至少包括一个非天然的核苷酸，如经化学修饰的核苷酸，优选在正义链或正义区的化学修饰；正义链或正义区是指与反义链或反义区互补形成双链结构的一段连续的核苷酸链，反义链或反义区是指在RNAi作用中，与靶mRNA互补结合的一段连续的核苷酸链。在一些实施例中，核糖的2’-位修饰具体为2’-甲氧基修饰，2’-氟代修饰，2’-脱氧修饰，2’-MOE修饰。在一些实施例中，正义链的5末端的第1-10位和/或3末端的第1-10位任选1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个核苷酸经过修饰。在一些实施例中，正义链的5末端的第1-7位的核苷酸和3末端的第1-7位的核苷酸经过修饰。本发明的正义链修饰可起到：(1)增强siRNA分子稳定性；(2)减少siRNA分子脱靶性；(3)提高siRNA分子特异性；(4)减少免疫激活反应等作用。所述“特异性”指siRNA与靶mRNA间具有必要程度的互补性以诱导靶基因的抑制，而对非mRNA无抑制作用或仅有极小的抑制作用。

siRNA分子混合物优选固相合成法获得，也可通过转录法或其他方法合成。

在一个方案中，涉及本发明的siRNA分子或其混合物在抑制细胞中靶基因表达的用途，所述靶细胞可以为真核生物细胞或原核生物细胞，真核生物细胞包括哺乳动物细胞细胞，优选啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞；细胞可以来源于多种组织或器官，如血液，淋巴，骨髓，脑，血管，肝，肺，骨，乳腺，软骨，宫颈，结肠，角膜，胚胎，肾，肌肉，卵巢，胰腺，前列腺，皮肤，肠，脾，胃等；细胞种类可为多种，包括脂肪细胞，成纤维细胞，肌细胞，心肌细胞，内皮细胞，上皮细胞，神经细胞，神经胶质细胞，血细胞，巨核细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞，粒细胞，角化细胞，软骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，肝细胞；或是处于病理状态的细胞，如癌细胞、肿瘤细胞、炎症细胞、有基因缺陷的细胞(如染色体异常或基因突变)。优选靶细胞中的靶基因表达，更优选靶细胞中的靶基因高水平表达。

在一个方案中，所述细胞为为癌细胞，所述癌是前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤，子宫内膜癌、卵巢癌、肝细胞癌、结直肠癌、头颈癌、膀胱癌、唾液腺癌，肺癌、胰腺癌或肾细胞癌；优选所述细胞为HeLa、293T、A549、HUVEC细胞。

本发明设计合成的用于干扰CLU基因的成套siRNA其优势在于：(1)上述siRNA分子混合物均能有效抑制靶基因表达，所有的siRNA分子混合物均能确保70％以上的抑制效率，且所述siRNA分子混合物中的siRNA分子序列不需特殊设计，通过在线工具或其他常规技术均可获得；而在现有技术中，不是所有设计的siRNA分子都能达到抑制基因表达的效果，一般设计的siRNA仅有50％的概率能抑制靶基因表达，仅25％的siRNA能达到75％以上的抑制效果，后续还需对siRNA进行筛选、优化，或对其效果进行实验验证，费时耗力；(2)解决了在不同细胞系中、不同转染试剂处理时，siRNA作用不一致的问题，可在多个细胞系中有效沉默靶基因，并且不受转染试剂的影响；(3)增强了siRNA分子的基因沉默效果，siRNA分子间存在协同增效效应。(4)降低了siRNA分子的脱靶效应。

综上，上述siRNA分子混合物提高了寡核酸抑制基因表达的概率；整体上提升了抑制效率；同时降低了脱靶效应；且其在应用过程中，省去了前期对单一RNAi分子的复杂设计、筛选、验证与优化的过程，操作简单、节省成本。是一种通用、有效、快速的RNAi工具。

附图说明

图1为siRNA体外稳定性测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、成套siRNA的制备

1、设计原则

设计的所有单个siRNA均靶向靶基因CLU(如表1),设计方法参照Elbashir etal.2002；Paddison et al.2002；Reynoldset al.2004；Ui-Tei et al.2004等人的方法(Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Weber,K.,and Tuschl,T.2002.Analysis of genefunction in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Methods26:199–213；Paddison,P.J.,Caudy,A.A.,Bernstein,E.,Hannon,G.J.,and Conklin,D.S.2002.Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing inmammalian cells.Genes&Dev.16:948–958；Reynolds,A.,Leake,D.,Boese,Q.,Scaringe,S.,Marshall,W.S.,and Khvorova,A.2004.Rational siRNA design for RNAinterference.Nat.Biotechnol.22:326–330；Ui-Tei,K.,Naito,Y.,Takahashi,F.,Haraguchi,T.,Ohki-Hamazaki,H.,Juni,A.,Ueda,R.,and Saigo,K.2004.Guidelines forthe selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNAinterference.Nucleic Acids Res.32:936–948)。为保证siRNA的特异性，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Too，http://www.ncbi.nlm.gov))分析序列同一性(identity)，选择与其他序列同一性最小的序列。

成套siRNA由5-10个siRNA分子组成；

每个siRNA由25个核苷酸组成的SS正义链和与其反向互补的反义链AS组成，且为平末端；每个siRNA通过其反义链与靶基因上的靶序列互补结合；

AS链和SS链完全反向互补，AS链与靶基因完全互补，SS的从5’末端起7个连续核苷酸和从3’末端起7个连续核苷酸均经过2＇-O-Me修饰。

靶基因如表1所示。

表1为靶基因

靶基因名称登录号CLU簇集蛋白NM_001831

2、设计合成靶基因对应的成套siRNA

表1所示的靶基因对应的siRNA的名称如表2所示，具体序列如表3所示。

表2 siRNA分子混合物组成

表3 siRNA分子混合物序列表

上述表中，mA、mU、mC和mG分别为2＇-O-Me修饰后A、2＇-O-Me修饰后U、2＇-O-Me修饰后C和2＇-O-Me修饰后G。

分别将上述成套siRNA组RM-2(7个siRNA混合)、RM-3(6个siRNA混合)、RM-1(5个siRNA混合)、RM-6(10个siRNA混合)中的每个siRNA按照分组要求混合，其中，RM-2混合物中所有siRNA分子的总浓度为100nM，且每个siRNA分子为等物质的量比混合。

实施例2、成套siRNA抑制靶基因表达的研究

一、不同细胞系中成套siRNA RM-2的抑制效果比较

分别将4种不同的细胞系(293T,HeLa,A549与HUVEC(ATCC)接种在细胞培养板中培养24h后观察细胞，状态良好开始转染。

表4细胞系来源

细胞系名称来源293T人胚肾细胞ATCCHeLa宫颈癌细胞ATCCA549非小细胞肺癌细胞ATCCHUVEC人脐静脉内皮细胞ATCC

50μL riboFECT转染体系：5μL riboFECT^TMCP>TMCP>

100μL LF2K转染体系：1μL LF2K(Invitrogen，11668019)，5μL实施例1制备的成套siRNA组RM-2(所有siRNA的总终浓度为100nM)和94μL Opti-MEM细胞培养基(ThermoFisher Scientific，31985070)。

细胞培养板的每个孔中加入上述50μLriboFECT转染体系或100μL LF2K转染体系，得到转染后的不同细胞系。

转染48h后，收集转染后不同细胞系，Trizol法提取RNA，Reverse Transcriptionmix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)得到转染后不同细胞系的cDNA。

以转染后不同细胞系的cDNA为模板，用H-CLU-F和H-CLU-R引物进行RT-PCR扩增，以人的看家基因actin作为内参基因(Forward:5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3；Reverse:5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3)，利用Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2×)(BIO-RAD750000131)进行实时荧光定量PCR反应。一个样品的9个重复(每个单独的样品在转染时有3个重复，在qPCR时每个重复做3个复孔)的Ct误差在±0.5，然后用CFX 2.1进行相对定量分析。SPSS19.0数据统计软件数据分析，表中数据为其平均值，P值均<0.05。

NC阴性对照组：转染的siRNA为无关非特异siRNA，

5'UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT 3'

5'ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT 3'；

N空白对照组：正常细胞，无siRNA转染。

H-CLU-F：CAAGGCGAAGACCAGTACTATC；

H-CLU-R：CAGTGACACCGGAAGGAAC

Real-Time PCR抑制率计算方式：

结果如表5所示：

表5为不同细胞系中RM-2的抑制率(％)比较

结果表明，相对NC阴性对照组对照(表达水平为1)，针对不同的靶基因，在不同的细胞系中，使用不同的转染试剂，RM-2混合物均能达到70％以上的抑制效果。

二、HeLa细胞中RM-2混合物与单个siRNA分子的靶基因抑制效率比较

方法与上述一相同，不同的是将实施例1制备的成套siRNA组RM-2转染HeLa细胞。以转染RM-2中单个siRNA为对照。

抑制率(％)结果如表6所示。

表6 HeLa细胞中RM-2与单个siRNA的抑制率(％)比较

简称RM-2D1D2D3D4D5D6D7CLU9082888586919273

上述表中的D1-D7分别为每个靶基因对应的7个siRNA,RM-2为靶基因CLU对应的7个siRNA的混合样品。

结果表明，针对靶基因CLU，RM-2混合物抑制效果(抑制率)大于90％；且与其相同浓度的7个单个siRNA分子相比，起到了协同增效的作用。

三、不同组的成套siRNA转染HeLa细胞的抑制效果比较

比较不同成套siRNA组在HeLa细胞中抑制效果。

方法与上述一相同，不同的是将实施例1制备的CLU对应的成套siRNA组RM-1、RM-2、RM-3、RM-6分别转染HeLa细胞。

结果如表7所示，

表7不同siRNA条数混合而成的siRNA混合物

siRNA混合物RM-1RM-2RM-3RM-6抑制率(％)79838991

结果表明，混合物RM-1、RM-2、RM-3、RM-6均能起到高效抑制多种基因表达的作用。

实施例3、体外稳定性测定

将siRNA RB-CLU-D6经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜大鼠血清(为上海远慕生物科技有限公司产品),然后在37℃孵育6小时，取样进行电泳观察siRNA的完整性。

结果如图1所示，本发明的siRNA在血清中稳定，预计其在体内具有更好的效力。

其它RB-CLU-Dx(x为D1-D10)，其实验结果相同，具体图省略。