siRNA对体外培养大鼠海马神经元细胞红蛋白基因表达的抑制

摘要

细胞红蛋白(CYGB)是继脊椎动物血红蛋白,肌红蛋白,脑红蛋白之后所发现的第四类携氧球蛋白,具有可逆性结合、运输及储存氧的主要生物学功能,在缺氧缺血性损伤时表达增强,并且可能发挥缺氧诱导的神经保护作用。细胞红蛋白的发现为缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的发病机制及防治方案提供了新的切入点。RNA干扰(RNAi)技术是近年来发现的一种重要的转录后水平的基因沉默技术,被广泛的应用于基因功能、基因治疗等基因水平的研究。它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA的降解,达到抑制基因表达的目的。各种体内外实验证实21-23个nt的短双链RNA,即siRNA,可在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭作用,其结构稳定无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高其半衰期,并能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下,使靶基因降至极低水平甚至完全“敲除”。本实验以CYGB基因为靶标,设计合成siRNA,并通过脂质体将其转入体外培养海马神经元中,研究其阻断CYGB基因表达的效应,为进一步研究CYGB的功能奠定基础。
　　目的：转染特异性针对细胞红蛋白(CYGB)基因的 siRNA进入体外培养的大鼠海马神经元中,观察其对CYGB基因表达的抑制作用。
　　方法：取新生大鼠(24小时内)海马组织做神经元原代培养,神经元特异性Neu免疫荧光抗体鉴定神经元纯度后,通过阳离子脂质体转染试剂将体外化学合成的针对CYGB基因的3组siRNA(根据碱基序列不同,分别为siRNA-78,siRNA-79,siRNA-80)转入细胞中,以荧光对照siRNA转染率估测转染效率,以未转入siRNA细胞为空白对照,转入阴性siRNA(不与任何脊椎动物基因具备同源性)细胞为阴性对照,通过 RT-PCR方法检测不同时间点各组siRNA对CYGB基因mRNA表达的抑制作用。
　　结果：成功体外培养经特异性Neu免疫荧光抗体鉴定纯度较高的海马神经元;转染荧光对照siRNA8小时后倒置荧光显微镜下观察转染效率在70％左右;转染3组siRNA(siRNA-78, siRNA-79,siRNA-80)0h,24h,48h,60h及72h后,RT-PCR结果提示转染siRNA-7824h后CYGB基因mRNA表达量与空白对照(1.039±0.007)及阴性对照(1.038±0.005)比明显减少,为1.021±0.009(P<0.01),48h后与空白对照(1.041±0.009)及阴性对照(1.035±0.007)比显著减少,为0.942±0.008(P<0.001),60h后与空白对照(1.033±0.003)及阴性对照(1.033±0.006)比明显减少,为1.002±0.006(P<0.001),72h后表达无明显差别(P>0.05)。转染 siRNA-79,siRNA-80在各时间点与空白对照及阴性对照相比均没有明显差别(P>0.05)。
　　结论：特异性针对大鼠CYGB基因设计的siRNA转染体外培养的海马神经元,短时间(24h-60h)内能显著下调CYGB基因的表达,其中以48h时沉默效果最好,这说明脂质体转染法可以使体外合成的siRNA对目的基因的表达产生特异性的瞬时抑制效应。siRNA-78组的抑制效应明显强于siRNA-79组和siRNA-80组,也验证了靶基因相同但靶标位点不同的siRNA对靶基因的抑制效应强弱不一的观点。

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第1章 前言

第2章 材料与方法

1 材料

2. 方法

第3章 结果

3.1 大鼠海马神经元体外原代培养

3.2 细胞免疫荧光法鉴定海马神经元纯度

3.3 转染荧光对照siRNA测定转染效率

3.4 细胞转染siRNA后各组CYGB mRNA表达水平

第四章 讨论

4.1研究细胞红蛋白表达及调控的意义

4.2 新生SD大鼠海马神经细胞原代培养方法的探讨

4.3 siRNA作用机制及转染方法的研究

4.4 siRNA特异性瞬时沉默基因的研究4.4.1 沉默效果的组间差异性

第五章 结论

第六章 参考文献

第七章 综述

细胞红蛋白表达及调控的研究?

参考文献(References)

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