用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的提取方法及其卵黄抗体的制备方法

摘要

本发明属于生物制药技术，公开了一种用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的提取方法及其卵黄抗体的制备方法。具体制备方法包括以下：用SDA固体培养基培养皮肤癣真菌，然后接种到SDA液体培养基中大量培养；过滤得到菌丝，用液氮低温研磨；加入蜗牛酶酶解细胞壁，得到的沉淀加入裂解液，充分作用后，上层液用PBS透析，即为皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原。再利用制备的细胞浆蛋白作为抗原，免疫母鸡，得到高效价的抗体，为皮肤癣疾病的预防与治疗提供了新思路。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术，特别涉及一种用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的提取方法及其卵黄抗体的制备。

背景技术

皮肤癣菌是浅部真菌病的主要病原菌，主要侵犯皮肤、毛发及指(趾)甲，寄生或腐生于表皮角质、毛发和甲板的角蛋白组织中。皮肤癣菌对机体损害程度由宿主对真菌代谢产物的反应强度、致病菌种与菌株致病力强弱、感染部位和外界环境因素决定的。常引起感染的皮肤癣菌主要有须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌、铁锈色小孢子菌、絮状表皮癣菌等。皮肤癣菌病包括体股癣、手足癣、头癣。手足癣分为三种类型：鳞屑角化型、水疱型、擦烂型。由真菌感染引起的皮肤癣疾病往往病情顽固，反复发作。给患者带来生理与心理的双重折磨。

临床上对于这类真菌性感染疾病的治疗多为抗真菌的抗生素药物或者一些中药提取的抗真菌成分。然而，利用抗生素类药物的治疗会引起耐药菌株的不断出现，真菌疾病的高频率复发，且副作用较大。利用中药药物的治疗效果缓慢，且复发率高，效果并不显著。这也促使科研人员不断寻找新的高效的廉价的安全的抗真菌药物。

卵黄抗体是近年来受到广大关注的一个方向，通过免疫母鸡得到免疫后的鸡蛋，从鸡蛋中提取抗体。其操作简单，稳定性好，得到的产率较高。卵黄抗体是一种生产工艺较为简单的廉价抗体，具有较强的耐酸耐碱耐热能力。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的提取方法。

本发明的再一目的在于提供一种由上述提取方法提取得到的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原。

本发明的又一目的在于提供一种利用上述皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原制备的卵黄抗体的方法。

本发明的又一目的在于提供上述方法制备得到的卵黄抗体。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的提取方法，包括以下步骤：

(1)选取红色毛癣菌或须癣毛癣菌，先固体培养后采用液体培养；

(2)液体培养后进行冲洗和离心，得到的菌丝经过液氮研磨，酶解细胞壁，利用裂解液提取真菌的细胞浆蛋白，离心得到上清液；

(3)将上清液透析后获得皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原。

步骤(1)所述固体培养是采用SDA固体培养基；所述液体培养基是采用SDA液体培养基。

步骤(2)所述酶解细胞壁是采用蜗牛酶破壁，以及使用二硫苏糖醇还原蛋白质中二硫键；所述利用裂解液提取真菌的细胞浆蛋白的过程中使用冰浴，所述裂解液含有8M的尿素和1M的碳酸氢钠。

步骤(3)所述透析是采用PBS透析三天，更好的除去溶液中的小离子化合物

一种根据上述提取方法提取得到的用于制备卵黄抗体的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原。

一种利用上述的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原制备卵黄抗体的方法，包括以下步骤：

(1)选取20周龄产蛋母鸡；将皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原用PBS缓冲液稀释成1mg/ml的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液；将皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液与弗氏完全佐剂按照等体积混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，并存放于4℃；

(2)将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集蛋黄，与冻存蒸馏水按照体积比为1:9混匀，离心获得水溶性成分，采用PEG6000进行沉淀获得卵黄抗体干粉，于-20℃保存。

步骤(2)中采用蒸馏水提取得到的卵黄抗体更为纯净，可有效的去除油脂类。

一种根据上述的方法制备得到的卵黄抗体。该卵黄抗体可以抗真菌。

本发明原理是：

本发明人尝试过利用真菌的全菌来作为抗原免疫得到卵黄抗体，由于皮肤癣的致病菌为丝状真菌，较难超声破碎，得到的卵黄抗体的特异性以及其效价均不高；利用细胞壁蛋白来作为抗原免疫得到卵黄抗体，发现虽然其效价较高，由于真菌的细胞壁结构相似，蛋白成分较为相似，利用细胞壁蛋白作为免疫原得到的卵黄抗体特异性不高；因此，本发明人尝试采用真菌的细胞浆蛋白的提取，利用细胞浆蛋白作为免疫原得到一种卵黄抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明利用皮肤癣菌提取的细胞浆蛋白作为免疫原免疫母鸡，得到较为安全的特异性卵黄抗体，为其应用于抗真菌的临床治疗方面提供了一定的理论基础。

附图说明

图1为皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的SDS-PAGE电泳图，其中1为红色毛癣菌细胞浆蛋白，2为须癣毛癣菌细胞浆蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原的制备

(1)通过SDA固体培养基培养红色毛癣菌和须癣毛癣菌，然后分别接种到液体培养基大量培养。

(2)细胞壁蛋白的提取：对于(1)液体培养，10000r/min，4℃，10min离心得到菌丝，用PBS反复冲洗，离心得到菌丝；采用液氮研磨，加PBS溶解，加入300mg蜗牛酶破壁；加入100μl DTT，在37℃下酶解3h，然后6000r/min，4℃，10min得到沉淀，用预冷的PBS(pH＝6.4)反复冲洗沉淀；加入细胞裂解液，吹打混匀后，冰浴1h，使细胞浆内蛋白完全释放；10000r/min，4℃，20min离心得到上层清液；用PBS透析三天，每12h更换透析液，透析后得到的清液即为皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原；其电泳图如图1。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，并用PBS缓冲液稀释成1mg/ml的皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液。

实施例2：卵黄抗体的制备

(1)用细胞浆蛋白抗原免疫产蛋母鸡：选取20周龄产蛋母鸡24只；将实施例1所得皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液与弗氏完全佐剂按照体积比1:1混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与皮肤癣菌细胞浆蛋白抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫4次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，连续收集三个月的免疫鸡蛋，并存放于4℃；

(2)抗抗皮肤癣特异性卵黄抗体的提纯：将获得的免疫鸡蛋用酒精消毒，破壳收集蛋黄，测定蛋黄体积，与4℃的冻存蒸馏水1:9混匀，调节pH为5.2,4℃保存过夜；高速冷冻离心后取上清液，用纱布过滤，测定滤液体积；

在上述上清液中加入PEG6000粉末使其质量终浓度为3.5％，调pH至7.2，充分混匀，4℃，10000r/min离心20min，过滤后得滤液。滤液中加入PEG6000粉末使其质量终浓度为8.5％，调pH至7.2，充分混匀，4℃，10000r/min离心20min，弃上清得沉淀；沉淀用4℃1mol/lPBS缓冲液(PH＝7.2)溶解后加入PEG6000粉末使其终浓度为12％，充分混匀，4℃，10000r/min离心20min，弃上清得沉淀；再用PBS溶解，转入透析袋，透析24h以上，收集透析液，在-60℃下真空冷冻干燥12h，制成了抗皮肤癣卵黄抗体的干粉纯品，-20℃保存。

(3)抗皮肤癣菌特异性IgY的效价检测

采用ELISA(酶联免疫吸附试验)法检测其得到的卵黄抗体的效价。检测结果表明,抗红色毛癣菌和须癣毛癣菌的IgY的效价均达到了1:16000。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。