云南重楼或其多芽品系种子的萌发和出苗方法

摘要

本发明提供了云南重楼或其多芽品系种子的萌发和出苗方法。本发明通过在变温方式、赤霉素溶液浓度、授粉方式等条件的设置，最终使得云南重楼和其多芽品系获得了高达91.50％的发芽率和83.26％的出苗率。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材育种、栽培等领域，具体涉及云南重楼或其多芽品系种子的萌发和出苗方法。

背景技术

云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.为历版《中国药典》收载的重楼药材的基源植物之一。由于重楼类植物种植需要6-8年才能采挖；云南重楼可采用根茎或种子进行繁殖，根茎繁殖技术虽简单成熟，但是种植户无法可持续性承担需要消耗大量的高价格重楼根茎种源的重楼种植业；种子繁殖具有繁殖系数大、生产成本低等优点，但其存在二次休眠，自然发芽率低，需经过2次低温休眠才能萌发，在自然情况下需要两冬一夏才能出土成苗，l5个月的出苗率仅为46.2％。

云南白药集团、四川光大制药有限公司和通化万通药业股份有限公司等相关企业对重楼药材资源需求量大，过度采挖导致野生资源日益稀少，市场价格暴涨，导致重楼药材野生资源日渐濒危，人工种植目前尚无优质、稳定的种源供给市场，已经成为制约重楼制药产业可持续发展的瓶颈。多芽品系是一类具有典型的云南重楼植物学特征的新品系，如花瓣上部狭匙形，药隔凸出明显等，但其具有众多丛生芽，每个芽均可作为繁殖材料。

目前破除其休眠虽有较多文献报道，但没有成体系地应用到云南重楼的种植生产环节，且效果欠佳。如云南省大理学院药学与化学学院张琳、李海峰等人，先将赤霉素(50mg/L)浸种的种子在4℃下湿沙层积120天，然后20至25℃条件下无菌培养90天，种子萌发率可达68.67％。(注：种子萌动率＝胚根或胚芽突破种皮的种子数占接种种子数的百分数；以胚根或胚芽长度≥5mm视为萌发)。云南省农业科学院高山经济植物研究所陈翠等人，采用18℃恒温培养120天发芽率能达到94％，但播种大田后的出苗率仅能达到32％。

因此，建立一套同时提高发芽率和在地出苗率的种子萌发、出苗技术是目前解决重楼种源的有效途径。

发明内容

本发明希望对近年来新发现的云南重楼(多芽品系)与普通云南重楼的种子萌发力进行对比研究，以期为云南重楼及其多芽品系重楼的种苗繁育提供科学指导，缓解目前重楼优质种源严重不足，商品药材严重供不应求，市场价格高居不下的瓶颈问题，从而规范重楼品种、品质混乱的情况，为解决云南和四川地区重楼野生变家种的优良种源供给问题和重楼药材供需之间的巨大缺口做出贡献，缓解重楼资源的稀缺而制约相关制药产业可持续发展的瓶颈。

具体地，本发明提供了云南重楼或其多芽品系种子的萌发和出苗方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取云南重楼或其多芽品系的成熟种子，去外种皮，用100-500mg/L赤霉素水溶液浸泡，浸泡后的种子先于1-5℃下培养60d，转入18℃～20℃培养至发芽；

(2)发芽种子播种于苗床，覆土0.1-1cm，遮阳，田间管理直至出苗。

进一步地，步骤(1)中，所述云南重楼或其多芽品系的成熟种子，是指云南重楼或其多芽品系人工授粉或自然授粉的成熟种子；优选为人工授粉的成熟种子。

进一步地，赤霉素水溶液浓度为100-200mg/L。

进一步地，种子先于4℃下培养60天，再转入18℃培养至发芽。

进一步地，步骤(2)中，覆土厚度为0.3-0.7cm，优选为0.5cm。

进一步地，步骤(2)中，覆土是指覆盖腐叶土。

进一步地，步骤(2)中，遮阳选择遮阳率为60～80％遮阳网，优选为70％遮阳网，进一步优选为75％遮阳网。

除本发明提及的各步骤、参数外，其余方法均按照现有技术进行。

经过长达5年的实验，在收集、分析了大量的实验数据的基础上，本发明最终通过在变温方式、赤霉素溶液浓度、授粉方式等多个条件的最佳组合，使得云南重楼和其多芽品系获得了高达91.50％的发芽率，同时，其在地出苗率也高达83.26％，远高于现有方法。

附图说明

图1云南重楼(多芽品系)幼苗图

具体实施方式

除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有一般技术者通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外来定义。

腐叶土，即腐殖土，是植物枝叶在土壤中经过微生物分解发酵后形成的营养土。也是常见的花木栽培用土。

云南重楼多芽品系，也称为多芽重楼。

实施例1

将人工授粉的云南重楼(多芽品系)种子除去红色外种皮，于100mg/L赤霉素(GA₃)中浸泡24h，晾干水分。

4～18℃变温培养操作如下：将重楼种子先于4℃中培养60d，转入18℃中培养，保持环境湿润。

将培养后的种子直接播种墒面上，覆盖一层0.5cm厚的腐叶土，并搭建遮阳网(75％)，田间管理直至出苗。

本发明实施例1的实施地点在四川省阿坝州汶川县。

实施例2

将人工授粉的云南重楼种子除去红色外种皮，于100mg/L赤霉素(GA₃)中浸泡24h，晾干水分。

4～18℃变温培养操作如下：将重楼种子先于4℃中培养60d，转入18℃中培养，保持环境湿润。

将培养后的种子直接播种墒面上，覆盖一层0.5cm厚的腐叶土，并搭建遮阳网(75％)，田间管理直至出苗。

实施例3

1材料和方法

1.1仪器和材料

智能人工气候箱RTOP-2689(浙江托普仪器有限公司)；容声冰箱BCD-563WY-C(海信科龙电器股份有限公司)。

云南重楼及其多芽品系成熟果实2015年采自云南省丽江市华坪县和腾冲市重楼种植基地的，经西南民族大学刘圆教授和四川大学张浩教授鉴定为百合科

Liliaceae云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.果实。

1.2云南重楼及其多芽品系种子的萌发

1.2.1种子处理

将种子分别按大果(m≧20ɡ)：中果(20ɡ≤m≧10g)：小果(m≤10ɡ)(每个等级10个鲜果)、平均单果种子粒数、1000粒种子均重、1000粒去红色外种皮的种子均重计算，并按照国标农作物种子检验规程中“水分测定(GB/T 3543.6-1995)”和“净度分析(GB/T 3534.3—1995)”项下测定种子水分和净度。

1.2.2变温培养、种子萌发及种子播种处理

将人工授粉的云南重楼(多芽品系)种子除去红色外种皮，于100mg/L赤霉素(GA₃)中浸泡24h，晾干水分。

4～18℃变温培养操作如下：将重楼种子先于4℃冰箱中培养60d，转入18℃培养，保持环境潮湿，设置3组重复。

每隔2d记录一次发芽情况，当胚根长度约为种子直径的一半时视为种子发芽。发芽率(％)＝萌发的种子总数/200×100％；平均发芽时间＝∑(ti×ni)/∑ni，ti表示从实验开始的天数，ni表示每天发芽的种子数。

将培养后的种子直接播种于长5米，宽1.2米，高25cm的墒面上，覆盖一层0.5cm厚的腐叶土，并搭建遮阳网(75％)，田间管理。每隔2d统计1次出苗情况，连续记录140d。出苗率(％)＝出苗的种子总数/200×100％；平均出苗时间＝∑(ti×ni)/∑ni，ti表示从播种开始的天数，ni表示每天出苗的种子数。

1.2.3温度对种子萌发的影响

考察4℃、18℃、4～18℃三种温度对云南重楼种子萌发的影响。将去红色外种皮的云南重楼(多芽品系)种子分为3组，4℃和18℃分别置于冰箱中和气候箱中培养130d，4～18℃变温组按“1.2.2”项下变温培养条件处理。其余均按“1.2.2”项下操作。

1.2.4赤霉素浓度对种子萌发的影响

设置0mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L四种GA₃浓度，将去红色外种皮的云南重楼(多芽品系，人工授粉)种子在相应浓度的GA₃溶液中浸泡24h。其余均按“1.2.2”项下操作。

1.2.5授粉方式对种子萌发的影响

将人工授粉和自然授粉的云南重楼(多芽品系)种子分别按照“1.2.2”项下的步骤操作。

1.2.6比较云南重楼及其多芽品系种子萌发

将人工授粉的云南重楼及其多芽品系种子按照“1.2.2”项下的步骤操作。

1.3数据分析

除种子参数计算外，所有数据均采用SPSS统计软件进行单因数方差和独立样本T检验进行分析。

2结果和分析

2.1种子各参数对比

云南重楼及其多芽品系种子各参数计算结果见表1。

表1云南重楼(多芽品系)种子比较

云南重楼及其多芽品系种子间各参数并无明显的差异。人工授粉果实较自然授粉果实主要有以下区别：(1)与自然授粉比较，人工授粉果实更加均匀，大果和中果的比例显著增加；(2)人工授粉单果重量、种子数、种子千粒重明显高于自然授粉，水分低于自然授粉。

2.2温度处理对种子萌发的影响

云南重楼(多芽品系)种子各温度条件下培养的结果见表2。种子在4℃培养130d均无萌发，播种后140d均无出苗，因其发芽率和出苗率均为0，故4℃温度培养结果不做统计学分析。18℃培养52d后种子开始萌发，播种后90d种子开始出苗，开始出苗后的30d内为出苗高峰期。经4℃培养60d，再转入18℃培养40d后种子开始萌发，播种后85d种子开始出苗，出苗高峰期也是开始出苗后的30d内。

温度处理对云南重楼(多芽品系)种子的萌发有极显著的作用(P＜0.001)，18℃处理的发芽率为40.50％，而4～18℃变温处理的发芽率高达91.50％；对种子的平均发芽时间也有极显著的影响(P＜0.001)，4～18℃变温处理的平均发芽时间(112.33d)显著高于18℃处理的(60.67d)(P＜0.001)。温度处理对云南重楼(多芽品系)种子出苗率有显著的影响(P＜0.001)，4～18℃变温处理的出苗率(83.26％)显著高于18℃处理的(32.40％)；对种子平均出苗时间的影响没有达到显著差异水平(P＞0.05)。

表2温度对云南重楼(多芽品系，人工授粉)种子萌发的影响(n＝3)

注：^*18℃恒温与4～18℃变温相比，P＜0.05

2.3授粉方式对种子萌发的影响

云南重楼(多芽品系)人工授粉与自然授粉种子的培养结果见表3和图1。授粉方式对种子发芽率有显著的影响(P＝0.001)，人工授粉的种子发芽率(92.50％)显著高于自然授粉的(70.50％)；对种子平均发芽时间的影响没有达到显著性水平(P＞0.05)。授粉方式对种子的出苗率有极显著的影响(P＜0.001)，人工授粉的种子出苗率(86.88％)显著高于自然授粉的(62.04％)；对种子的平均出苗时间无明显影响(P＞0.05)。人工授粉的发芽种子胚根明显长于自然授粉。

表3云南重楼(多芽品系)不同授粉方式种子萌发结果(n＝3)

注：^*自然授粉与人工授粉相比，P＜0.05

2.4赤霉素对种子萌发的影响

GA₃处理对云南重楼(多芽品系，人工授粉)种子的发芽率有极显著的促进作用(P＝0.001)，随GA₃浓度的升高发芽率先升后降，空白组的发芽率最低(79.84％)，200mg/LGA₃组获得了最高发芽率(93.50％)，显著高于空白组(P＜0.001)和500mg/LGA₃组(P＜0.05)，但与100mg/LGA₃组的差异没有达到显著性水平(P＞0.05)；对种子的平均发芽时间也有显著影响(P＜0.05)，随GA₃浓度的升高平均发芽时间越短，但空白组、100mg/L和200mg/LGA₃组间的差异并没有达到显著性水平(P＞0.05)。GA₃处理对种子的出苗率有显著影响(P＜0.05)，影响趋势与对发芽率的影响一致；对种子的平均出苗时间无明显影响(P＞0.05)。

表4赤霉素对人工授粉的云南重楼(多芽品系)种子萌发的影响(n＝3)

注：不同的字母表示用LSD检验在检验水准α＝0.05上存在显著性差异

2.5比较云南重楼及其多芽品系种子萌发

人工授粉的云南重楼与云南重楼(多芽品系)种子的培养结果见表5。二者的种子发芽率、平均发芽时间、出苗率和平均出苗时间均无显著差异(P＞0.05)。

表5人工授粉的云南重楼与云南重楼(多芽品系)种子萌发比较(n＝3)

综上，本发明通过在变温方式、赤霉素溶液浓度、授粉方式等条件的设置，最终使得云南重楼和其多芽品系获得了高达91.50％的发芽率和83.26％的出苗率。

外种皮在维持种子休眠中起着重要作用，新鲜的云南重楼及其多芽品系的种子有红色多汁的假种皮，里面可能含有抑制物质或阻止了种子内萌发抑制物质的溢出。人工授粉的云南重楼及其多芽品系的果实比自然授粉的更加饱满，单果种子数较多，在有限的子房空间里彼此较拥挤，以致假种皮较薄，因此假种皮里可能含有的抑制物较少且有利于种子内萌发抑制物的渗出；人工授粉的种子水分低于自然授粉的，说明人工授粉的种子种胚比重较高，发育可能更加成熟。上述因素可能是导致人工授粉的云南重楼及其多芽品系的种子发芽率和出苗率显著高于自然授粉的原因。云南重楼与其多芽品系的种子萌发和出苗结果并无显著差异，二者的种子各参数亦无明显差别，这说明二者间除外观形态有差异外，可能并不存在内在的特征差异。

结合上述研究结果和生产成本，本发明最佳方法如下：采用人工授粉的成熟种子，去外种皮，用100mg/L GA3溶液浸泡24h，先于4℃下培养60d，转入18℃～20℃培养至发芽；发芽种子播种于苗床，覆盖一层0.5cm厚的腐叶土，遮阳度75％，田间管理至出苗即可。