类酵母真菌抑制霜霉病的应用

摘要

本发明公开了一种类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6的新的应用，具体为其在抑制霜霉病病害中的应用；在制备霜霉病病害抑制剂中的应用；在抑制霜霉病病菌中的应用；在制备霜霉病病菌抑制剂中的应用。叶盘法生物测定实验结果表明，类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6可以有效抑制葡萄霜霉病，将类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6应用于抑制葡萄霜霉病或制备葡萄霜霉病抑制剂可以减少化学制剂带来的环境污染，该菌生长速度快，营养简单，不产生毒素，不产生抗生素，相对比较安全；该菌不产生致敏孢子；适合商业化大规模生产，并且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及类酵母真菌抑制霜霉病的应用，属于微生物应用技术领域。

背景技术

霜霉病是由真菌中的霜霉菌引起的植物病害。

葡萄霜霉病是一种真菌病害，它是葡萄上的一类重要的病害。葡萄霜霉病的普遍发生造成了果实的大量减产，严重影响了果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低，严重制约了我国葡萄产业的发展。无论在发达国家，还是在发展中国家，由于缺少必要的有效防控药剂，葡萄霜霉病引起的损失量占总量的20％以上。葡萄霜霉病的发生已给现代葡萄生产尤其是高端葡萄产品生产与加工造成了严重影响。

葡萄霜霉病主要危害叶片，也能侵染新梢幼果等幼嫩组织。叶片被害，初生淡黄色水渍状边缘不清晰的小斑点，以后逐渐扩大为褐色不规则形或多角形病斑，数斑相连变成不规则形大斑。天气潮湿时，于病斑背面产生白色霜霉状物，即病菌的孢囊梗和孢子囊。发病严重时病叶早枯早落。嫩梢受害，形成水渍状斑点，后变为褐色略凹陷的病斑，潮湿时病斑也产生白色霜霉。病重时新梢扭曲，生长停止，甚至枯死。卷须、穗轴、叶柄有时也能被害，其症状与嫩梢相似。幼果被害，病部褪色，变硬下陷，上生白色霜霉，很易萎缩脱落。果粒半大时受害，病部褐色至暗色，软腐早落。果实着色后不再侵染。

葡萄霜霉病病原为葡萄霜霉菌，属鞭毛菌亚门，卵菌纲霜霉目，单轴霉属。葡萄霜霉病菌以卵孢子在病组织中越冬，或随病叶残留于土壤中越冬。次年在适宜条件下卵孢子萌发产生芽孢囊，再由芽孢囊产生游动孢子，借风雨传播，自叶背气孔侵入，进行初次侵染。经过7-12天的潜育期，在病部产生孢囊梗及孢子囊，孢子萌发产生游动孢子进行再次侵染。孢子囊萌发适宜温度为10℃～15℃。游动孢子萌发的适宜温度为18℃-24℃。秋季低温，多雨多露，易引起病害流行。果园地势低洼、架面通风不良树势衰弱，有利于病害发生。

2014年我国葡萄栽培面积已经超过80万公顷，仅次于西班牙，超过法国是世界上葡萄有效种植面积第二大国，而且葡萄种植面积还在逐步增加。目前，葡萄霜霉病的普遍发生已成为制约我国葡萄产业发展的一个重要因素。应用杀菌剂防治葡萄霜霉病是降低果品损失的重要手段；目前国内应用于葡萄霜霉病防治的有效化学药剂较少，且其使用后残效期较长，不易降解，会影响一些高端果品的对外出口，更重要的是，化学药剂的大范围应用容易使得一些病原菌产生抗药性。因此，亟需开发和应用新型环保型杀菌剂。

生物杀菌剂相对于化学农药而言有着天然优势,避免了农药残留、环境污染、抗药性等问题，而且低毒、环保、持效且自然界生态兼容性较好。目前，国内生物农药开发主要集中在Bt杀虫剂、农用抗生素、细菌源生防制剂等几个方面，防治对象多集中于大田作物病害。但是针对葡萄霜霉病防治方面，生防应用研究进行的相对较少，且目前国内还没有能够用于葡萄霜霉病防治的生防菌剂产品。较之产抗生素类细菌和有丝真菌类生防菌，以类酵母菌或酵母菌为主体开发的杀菌剂在防治果实病害上，显得更为安全、环保。

酵母菌及类酵母真菌源生物杀菌剂有着独特的优势：(1)与一些生防细菌相比较，不产生抗生素，对环境的负面影响较小；(2)与一些有丝真菌类生防菌相比，不产生致敏孢子；(3)生长要求简单，易于大规模发酵生产。因此，开发采后病害酵母源杀菌剂成为近年来国际果实病害防治和果品食品安全研究领域中一个新的方向和趋势。

类酵母真菌Pseudozyma fusiformata来自于自然环境中，主要存在于含糖量较为丰富的果实表面和花上，是植物微生态系统中的优势微生物种群之一。类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6，保藏号为：CGMCC No.8577，为本发明人发现、分离并保藏，其在中国专利文献CN103937689A中公开。该菌生长速度快，营养简单，生长力强。在作为生防菌应用方面，它拥有自己独特的优势：1)该菌对环境的污染较少，不产生毒素；2)该菌不产生抗生素，对人类相对比较安全；3)相对于其他真菌而言，该菌不产生致敏孢子；4)该菌所需营养比较简单；5)该菌适合商业化大规模生产。因此，它具有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6，保藏号为：CGMCC No.8577的在抑制霜霉病中的新应用。

为此，本发明的技术方案如下：

类酵母真菌的下述任一应用：

(1)在抑制霜霉病病害中的应用；

(2)在制备霜霉病病害抑制剂中的应用；

所述类酵母真菌为Pseudozyma fusiformata SF6，保藏号为：CGMCC No.8577。

上述应用中，所述霜霉病为葡萄霜霉病。

类酵母真菌的下述任一应用：

(1)在抑制霜霉病病菌中的应用；

(2)在制备霜霉病病菌抑制剂中的应用；

所述类酵母真菌为Pseudozyma fusiformata SF6，保藏号为：CGMCC No.8577。

上述应用中，所述霜霉病病菌为葡萄霜霉病病原菌。

上述应用中，所述葡萄霜霉病病原菌为Plasmopara viticola。

一种葡萄霜霉病病原菌抑制剂，含有类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6或其菌液，其中所述类酵母真菌的浓度大于10⁶cfu/ml。

上述抑制剂中，所述葡萄霜霉病病原菌为Plasmopara viticola。

一种葡萄霜霉病病害抑制剂，含有类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6或其菌液，其中所述类酵母真菌的浓度大于10⁶cfu/ml。

所述类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6菌液为所述类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6的发酵液或生长液或培养基。

可按照如下方法制备：在液体培养基中培养所述类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6，除去液体培养物(发酵液)中的所述类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6即得到所述类酵母真菌的菌液。

本发明的有益效果为：

本发明中提供的类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6的一种新的应用，即对霜霉病病害和病原菌的抑制作用；尤其是对于葡萄霜霉病的抑制作用。叶盘法生物测定实验结果表明，类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6可以有效抑制葡萄霜霉病，将类酵母真菌Pseudozyma fusiformata SF6应用于抑制葡萄霜霉病或制备葡萄霜霉病抑制剂可以减少化学制剂带来的环境污染，该菌生长速度快，营养简单，生长力强，不产生毒素，不产生抗生素，相对比较安全；该菌不产生致敏孢子；所需营养比较简单；适合商业化大规模生产，并且成本低。

附图说明

图1.类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6在葡萄叶盘上对葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑制效果:a)SF6-10⁸cfu/ml浓度下对葡萄霜霉病菌(Plasmopara>7cfu/ml浓度下对葡萄霜霉病菌(Plasmopara>6cfu/ml浓度下对葡萄霜霉病菌(Plasmopara>

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：

葡萄霜霉病病原菌(Plasmopara viticola)-为北京市农林科学院植物保护环境保护研究所张殿朋博士田间采集、鉴定和保藏。

实施例1、类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6和植物霜霉病病原菌的培养

类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6可以从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA(含有硫酸链霉素)和YPD琼脂(含有硫酸链霉素)共2种培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的菌菌落，在YPD琼脂培养基上纯化保存。

类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6可以在YPD琼脂培养基上和PDA培养基上28℃下生长，生长48小时后，菌落为奶油状、乳白色不透明，扁平或圆形，边缘整齐，菌落无褶皱。

供试病植物霜霉病病原菌：

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。

具体操作如下：

类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6菌株在PDA培养基上28℃恒温培养48h。然后接种于YPD液体培养基中，28℃恒温摇床培养48h，备用。用蒸馏水或培养基调至菌液浓度分别为10⁵cfu/ml，10⁶cfu/ml，10⁷cfu/ml，10⁸cfu/ml。

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)由田间采集的发病葡萄叶片上分离经再次接种健康葡萄叶片进行扩繁而成，扩繁的病原菌悬浮液，在-20℃下保存，使用时用蒸馏水制成孢子悬浮液，浓度为10⁴cfu/ml。

实施例2、类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6抑菌活性的测定

选择易感葡萄品种(红乳)叶片进行叶盘法测定。

供试病原菌：

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。

选择易感葡萄品种(红乳)叶片进行叶盘法测定。

把采集的葡萄叶片先用自来水冲洗干净，然后用75％乙醇消毒30秒，再用无菌水彻底冲洗干净，然后用打孔器，获取直径1.5cm的叶盘。然后，把叶盘放置于铺有一层灭过菌纱布(2-3层)的培养皿中，无菌操作台中，吹4-5分钟，然后把叶盘浸泡于类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6发酵液中30-60秒，然后取出叶盘回放置于含有灭菌纱布的培养皿中，叶盘背面向上。无菌操作台中，吹1-2分钟，然后，从4度冰箱中，取出葡萄霜霉病病菌孢子悬浮液(10⁴cfu/ml),用移液器，取20μl分别接种于每个叶盘背面，放置5-10分钟，然后防治于相对湿度为80-90％，温度为22度，黑暗交替的培养箱中进行培养。以仅接种病原菌的叶盘为对照，每个处理三次重复，培养7-10天，观察叶盘葡萄霜霉病发病情况。

根据发病叶盘数占总接种叶盘数的多少，计算发病率，未发病的叶盘数占总接种叶盘数的多少，计算病害抑制率，结果见表1和图1。

表1.类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6对葡萄霜霉病的抑制效果

上述结果说明，类酵母真菌(Pseudozyma fusiformata)SF6对葡萄霜霉病具有较好的抑制功能。