丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用及其提取方法

摘要

本发明涉及丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用及其提取方法。本发明公开了丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用。本申请的发明人，通过对蛇毒的成分分析、丹皮酚原苷的结构性质分析并结合临床试验，发现丹皮酚原苷能够显著抑制蛇毒引起的皮下出血症状，能够可显著的抑制蛇毒造成的肌肉毒性，并能够使蛇毒引起的水肿症状明显减弱且趋于稳定，具有的抗出血、抗肌肉毒性作用。所述提取方法，先使用甲醇对徐长卿进行醇提，再依次进行浓缩和多级萃取，并进行凝胶层析和反相高效液相色谱分离纯化，即可得到收率高、纯度高的丹皮酚原苷，所述提取方法具有操作要求低、试验收率高的优点。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及丹皮酚原苷在制备治疗毒蛇咬伤药物中的应用及其提取方法。

背景技术

毒蛇咬伤(蛇伤)是被WHO列为一个易忽视的重要的热带疾病之一，全球每年约有500万蛇伤事件发生，造成约2.5万—12.5万人死亡。在我国，每年因毒蛇咬伤患者达10万人次，其中73％为中青年，死亡率为5-10％，致残或丧失劳动能力者占25-30％，给家庭和社会带来了极大负担。

自1894年世界上第一个商品化的抗蛇毒血清问世以来，经过一个多世纪的发展，已有超过80种商品化的抗蛇毒血清研制成功。然而，应用抗蛇毒血清治疗蛇伤也存在一些不足，如价格昂贵、保存和使用不便，很难在蛇伤发生后及时进行治疗；抗蛇毒血清具有种间特异性，在致伤的蛇种不明时很难用于伤者的救治；抗蛇毒血清通过免疫动物制备而来，血清中的杂蛋白可引起副作用，如过敏性休克、致热反应及血清病等；尤其是，抗蛇毒血清很难中和蛇毒引起的局部损伤。研究显示，即使在毒蛇咬伤后及时注射抗蛇毒血清，也仅能中和蛇毒引起的全身系统性毒性。蛇伤患者康复后，常因蛇毒造成的局部损伤而伴有短暂性或永久性残疾。据估计，约40万人因蛇伤造成了永久性残疾。因此，寻求新的治疗策略以弥补抗蛇毒血清存在的缺陷就显得尤为重要。

蛇毒主要分为三类：1、血液循环毒素。包括蝰蛇、腹蛇、竹叶青、五步蛇等蛇分泌的毒素，它造成被咬伤处迅速肿胀、发硬、流血不止，剧痛，皮肤呈紫黑色，常发生皮肤坏死，淋巴结肿大。经6-8小时可扩散到头部、颈部、四肢和腰背部。病犬战栗，体温升高，心动加快，呼吸困难，不能站立。鼻出血，尿血，抽搐。如果咬伤后4小时内未得到有效治疗则最后因心力衰竭或休克而死亡。2、神经毒素。包括金环蛇、银环蛇等蛇分泌的毒素。被咬伤后，局部症状不明显，流血少，红肿热病轻微。但是伤后数小时内出现急剧的全身症状，病人兴奋不安，痛苦呻吟，全身肌肉颤抖，吐白沫，吞咽困难，呼吸困难，最后卧地不起，全身抽搐，呼吸肌麻痹而死亡。3、混合毒素。眼镜蛇和眼镜王蛇的蛇毒属于混合毒素。被咬伤后，局部伤口红肿，发热，有痛感，可能出现坏死。毒素被吸收后，全身症状严重而复杂，既有神经症状，又有血循毒素造成的损害，最后，死于窒息或心动力衰竭。

在毒蛇中，尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)又称五步蛇、百步蛇、七步蛇、蕲蛇等，隶属于蝰蛇科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)尖吻蝮属(Deinagkistrodon)，仅分布于中国南方和越南部分地区，是引起我国蛇伤事故高发的主要毒蛇之一。尖吻蝮蛇毒主要作用于血液系统，能在短时间内引起严重的局部损伤，造成出血、水肿及肌肉组织坏死症状，如不及时治疗，将会导致永久性残疾或死亡。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用及其提取方法。

本发明所采用的技术方案为：丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用。

优选地，丹皮酚原苷在制备治疗血液循环毒素类蛇蛇伤药物中的应用。

进一步地，根据本发明的试验例，丹皮酚原苷在制备治疗尖吻蝮蛇蛇伤药物中的应用。

丹皮酚原苷，CAS号为：72520-92-4，结构式如下：

经本申请的发明人研究发现，能够抑制蛇毒的致伤活性，特别是血液循环毒素类的致伤活性。

本申请以尖吻蝮蛇蛇毒为例，进行说明阐述。

根据毒液成分及药理学作用方式的不同，蛇毒可分为血液循环毒素、神经毒素和混合毒素三大类。尖吻蝮蛇毒属典型的血循环毒素，主要成分为金属蛋白酶、磷脂酶A₂(PhospholipaseA₂，PLA₂)、C-型凝集素、丝氨酸蛋白酶、核苷酸酶及核酸酶以及其他蛋白质或多肽。其中，蛇毒金属蛋白酶是引起出血的主要成分，也是尖吻蝮蛇毒中表达丰度最高的酶类，该酶能降解胞外基质或基质膜，破坏血管壁完整性，进而导致皮肤血液溢出，引起局部出血。根据本发明中的试验例的实验结果显示，丹皮酚原苷能显著抑制尖吻蝮蛇毒引起的小鼠皮下出血症状，当终浓度为20mM时，能使出血活性降低60％；当终浓度为80mM时，可完全抑制小鼠皮下出血。

另外，蛇毒可以通过两条途径引发肌肉组织坏死，肌肉毒素PLA₂(碱性磷脂酶Lys49-PLA₂)直接作用于肌细胞质膜，引起大量的肌肉组织损伤，进而导致疼痛、肌肉无法运动；或者蛇毒金属蛋白酶作用于微血管系统或肌肉动脉，导致血管明显受损，造成贫血，间接引起肌肉毒性。肌肉坏死是尖吻蝮蛇伤引起的至关重要损伤，可以导致永久性组织损伤、肢体残疾甚至截肢。不同浓度丹皮酚原苷与蛇毒孵育后进行肌肉损伤抑制实验，根据本发明中的试验例的实验结果显示，丹皮酚原苷可显著的抑制尖吻蝮蛇毒造成的肌肉毒性，当浓度达500mM时，可使肌肉毒性降低约70％。

毒蛇咬伤后水肿的发生涉及到多种毒素组分，如PLA₂、金属蛋白酶，这些组分诱导机体快速释放内源性炎症因子：激肽、组胺、5-羟色胺等物质，引起毛细血管通透性增加，组织间液的胶体渗透压上升，组织液生成增多，引起水肿抑制实验结果显示，丹皮酚原苷处理组能使尖吻蝮蛇毒引起的水肿症状明显减弱且趋于稳定，而蛇毒处理组水肿症状不断恶化；终浓度为80mM的丹皮酚原苷在处理后180min，可使水肿程度降低约53％。基于丹皮酚原苷具有的抗出血、抗肌肉毒性作用，本申请的发明人认为其可能通过作用于蛇毒中的PLA₂和金属蛋白酶而起到抑制水肿作用。

综上，丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中发挥重要作用。

本发明还提供了一种丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步骤：

A、将中药徐长卿干燥、粉碎处理后，使用甲醇进行醇提，得到甲醇提取液；

B、将所述甲醇提取液减压浓缩至浸膏，然后加水混悬得到混悬液；

C、将所述混悬液依次使用石油醚、氯仿和乙酸乙酯除杂，除杂后使用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取液；

丹皮酚原苷在石油醚、氯仿和乙酸乙酯中的溶解度很小，不会造成丹皮酚原苷的大量损失，同时，所述石油醚、氯仿和乙酸乙酯能够溶解大量有机物，起到除杂的作用。

需要说明的是，石油醚、氯仿和乙酸乙酯的极性依次增大，除杂效果依次增强，也可以直接使用乙酸乙酯进行除杂。

D、将正丁醇萃取液依次使用羟丙基葡聚糖凝胶层析和反相高效液相色谱进一步分离纯化，得到单一组分化合物，即为丹皮酚原苷。

所述提取方法，先使用甲醇对徐长卿进行醇提，再依次进行浓缩和多级萃取，并进行凝胶层析和反相高效液相色谱分离纯化，即可得到收率高、纯度高的丹皮酚原苷，所述提取方法具有操作要求低、试验收率高的优点。

为检验所得到物质的纯度和结构，优选的技术方案是，所述提取方法还包括还包括E、鉴定步骤：使用HPLC对步骤D得到的单一组分化合物进行纯度鉴定；纯度鉴定之后，使用质谱和/或核磁共振对步骤D得到的单一组分化合物进行结构鉴定。

步骤A中，所述醇提操作分三次进行，每次醇提的具体步骤为：使用干燥后的徐长卿4-6倍重量的甲醇，将徐长卿进行醇提，每次醇提的时间为2-4小时；三次醇提完成后，将取得的溶液合并即可。

多次醇提，能够提取到更多的活性成分，增加所述提取方法的收率。

根据本发明的实施例，步骤A中，使用70-80wt％的甲醇，使用索氏提取器对徐长卿进行醇提。

步骤B中，所述浸膏和干燥后的徐长卿的重量比为1:8-10。

步骤D中，将所述正丁醇萃取液上样于羟丙基葡聚糖凝胶层析柱，以70-80wt％的甲醇，0.5-1.5ml/min的流速洗脱，并将层析产物干燥后，溶于5-15wt％的甲醇中上样于反相高效液相色谱，使用甲醇溶液洗脱，分离纯化得到单一组分的丹皮酚原苷。

进一步地，步骤D中，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇对反相高效液相色谱柱进行洗脱，每个浓度阶段洗脱10-20min。

本发明的有益效果为：

1、本发明公开了丹皮酚原苷在制备治疗蛇伤药物中的应用。本申请的发明人，通过对蛇毒的成分分析、丹皮酚原苷的结构性质分析并结合临床试验，发现丹皮酚原苷能够显著抑制蛇毒引起的皮下出血症状，能够可显著的抑制蛇毒造成的肌肉毒性，并能够使蛇毒引起的水肿症状明显减弱且趋于稳定，具有的抗出血、抗肌肉毒性作用。

2、本发明还提供了一种丹皮酚原苷的提取方法，先使用甲醇对徐长卿进行醇提，再依次进行浓缩和多级萃取，并进行凝胶层析和反相高效液相色谱分离纯化，即可得到收率高、纯度高的丹皮酚原苷，所述提取方法具有操作要求低、试验收率高的优点。

附图说明

图1是丹皮酚原苷经HPLC纯度检测图谱；

图2是试验例1中蛇毒引起小鼠皮下出血活性图；

图3是试验例1中各处理组小鼠皮下出血代表图谱；

图4是试验例2中丹皮酚原苷对尖吻蝮蛇毒所致小鼠肌肉毒素活性的影响图；

图5是试验例3中丹皮酚原苷对尖吻蝮蛇毒所致小鼠水肿活性的影响图。

图中：

**表示与蛇毒处理组比较，P<0.01；

***表示与蛇毒处理组比较，P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步骤：

A、将干燥后的中药徐长卿500g，粉碎处理后，使用甲醇进行醇提，所述醇提操作分三次进行，每次醇提的具体步骤为：使用2000g的80wt％的甲醇，将徐长卿进行醇提，每次醇提的时间为2小时；三次醇提完成后，将取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、将所述甲醇提取液减压浓缩至浸膏，所述浸膏的重量为85g，然后加水混悬得到混悬液；

C、将所述混悬液依次使用石油醚、氯仿和乙酸乙酯除杂，除杂后使用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、将所述正丁醇萃取液上样于羟丙基葡聚糖凝胶层析柱，以70wt％的甲醇，1.5ml/min的流速洗脱，并将层析产物干燥后，溶于5wt％的甲醇中上样于反相高效液相色谱，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇对反相高效液相色谱柱进行洗脱，每个浓度阶段洗脱20min，分离纯化得到单一组分的丹皮酚原苷；

实施例2

A、将干燥后的中药徐长卿500g，粉碎处理后，使用甲醇进行醇提，所述醇提操作分三次进行，每次醇提的具体步骤为：使用3000g的70wt％的甲醇，将徐长卿进行醇提，每次醇提的时间为4小时；三次醇提完成后，将取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、将所述甲醇提取液减压浓缩至浸膏，所述浸膏的重量为50g，然后加水混悬得到混悬液；

C、将所述混悬液使用氯仿和乙酸乙酯除杂，除杂后使用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、将所述正丁醇萃取液上样于羟丙基葡聚糖凝胶层析柱，以80wt％的甲醇，0.5ml/min的流速洗脱，并将层析产物干燥后，溶于15wt％的甲醇中上样于反相高效液相色谱，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇对反相高效液相色谱柱进行洗脱，每个浓度阶段洗脱10min，分离纯化得到单一组分的丹皮酚原苷；

实施例3

一种丹皮酚原苷的提取方法，包括以下步骤：

A、将干燥后的中药徐长卿500g，粉碎处理后，使用甲醇进行醇提，所述醇提操作分三次进行，每次醇提的具体步骤为：使用2500g的75wt％的甲醇，将徐长卿进行醇提，每次醇提的时间为3小时；三次醇提完成后，将取得的溶液合并，得到甲醇提取液；

B、将所述甲醇提取液减压浓缩至浸膏，所述浸膏的重量为65g，然后加水混悬得到混悬液；

C、将所述混悬液依次使用乙酸乙酯除杂，除杂后使用正丁醇进行萃取，得到正丁醇萃取液；

D、将所述正丁醇萃取液上样于羟丙基葡聚糖凝胶层析柱，以75wt％的甲醇，1ml/min的流速洗脱，并将层析产物干燥后，溶于10wt％的甲醇中上样于反相高效液相色谱，依次使用10wt％、22wt％、24wt％和80wt％的甲醇对反相高效液相色谱柱进行洗脱，每个浓度阶段洗脱15min，分离纯化得到单一组分的丹皮酚原苷；

E、鉴定步骤：使用HPLC对步骤D得到的单一组分化合物进行纯度鉴定；纯度鉴定之后，使用质谱和/或核磁共振对步骤D得到的单一组分化合物进行结构鉴定。

HPLC的检测结果如图1所示，说明纯度较高。质谱显示m/z:483.00([M+Na]⁺)，329.00([M-Ara+H]⁺)，167.05([M-Ara-Glc+H]⁺)，458.95([M-H]^—)，505.40([M-H+HCOOH]^—)，计算值460.43，推测其分子式为C₂₀H₂₈O₁₂，核磁数据显示：¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ:7.82(1H，d，J＝9.0Hz，H-6)，6.89(1H，d，J＝2.3Hz，H-3)，6.86(1H，dd，J＝2.3，8.7Hz，H-5)，5.33(H，d，J＝7.7Hz，H-1')，4.46(1H，d，J＝7.7Hz，H-1″)，3.96(3H，s，-OCH₃)，2.72(3H，s，-CH₃)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ:121.43(C-1)，157.78(C-2)，99.76(C-3)，164.6(C-4)，108.25(C-5)，132.56(C-6)，102(C-1')，75.5(C-2')，75.8(C-3')，69.38(C-4')，75.67(C-5')，68.6(C-6')，103.34(C-1″)，72.79(C-2″)，73.07(C-3″)，69.22(C-4″)，65.07(C-5″)，55.84(-OCH₃)，30.4(-CH₃)，203.14(-COOCH₃)。则证明所示单一组分化合物为丹皮酚原苷。

试验例1

本实验为丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的出血活性实验。

出血活性检测参照Kondon等的方法进行。选取健康昆明小鼠25只(20±2g)，随机分为5组，于小鼠背部皮下注射0.1ml不同剂量尖吻蝮蛇毒溶液(0μg、2.5μg、5μg、10μg、20μg、30μg)。2h后，小鼠经乙醚麻醉处死，取背部皮肤，用游标卡尺测量注射点皮下出血斑的平均直径。以出血斑直径对蛇毒剂量做图，最小出血剂量(Minimum hemorrhagic dose,MHD)定义为引起出血直径达10mm的蛇毒剂量。

抑制出血活性实验：将100μL由不同剂量功效组分(20μM、40μM、80μM)与尖吻蝮蛇毒(MHD剂量)组成的混合液，置于37℃水浴45min后，进行小鼠背部皮下注射。蛇毒溶液和生理盐水分别作为阳性对照和阴性对照，以MHD剂量引起的出血直径作为100％出血活性。

尖吻蝮蛇毒属典型的血循环毒素，主要成分为金属蛋白酶、磷脂酶A2(Phospholipase A₂，PLA₂)、C-型凝集素、丝氨酸蛋白酶、核苷酸酶及核酸酶以及其他蛋白质或多肽。其中，蛇毒金属蛋白酶是引起出血的主要成分，也是尖吻蝮蛇毒中表达丰度最高的酶类，该酶能降解胞外基质或基质膜，破坏血管壁完整性，进而导致皮肤血液溢出，引起局部出血。如图2和图3所示，丹皮酚原苷能显著抑制尖吻蝮蛇毒引起的小鼠皮下出血症状，当终浓度为20mM时，能使出血活性降低60％；当终浓度为80mM时，可完全抑制小鼠皮下出血。

试验例2

本实验为丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的肌肉组织坏死活性实验。

肌肉坏死活性检测参照Mebs等的方法进行。选取健康昆明小鼠25只(20±2g)，随机分为5组。小鼠右腿肌肉注射50μL尖吻蝮蛇毒溶液(30μg)作为蛇毒组，阴性对照组注射相同剂量的生理盐水。1h后摘除小鼠眼球，取血，37℃孵育10min，8000g离心10min制备血清。血清中肌酸激酶(Creatine kinase,CK)活性检测按照试剂盒说明进行操作(南京建成生物工程研究所)。以蛇毒组测得CK活力作为阳性对照，定义为100％组织坏死活性。抑制肌肉组织坏死活性实验：将50μL由不同剂量功效组分(125mM、250mM、500mM)与尖吻蝮蛇毒(30μg)组成的混合液，置于37℃水浴45min，再肌肉注射至小鼠右后腿，按上述方法进行CK活力检测。

蛇毒可以通过两条途径引发肌肉组织坏死，肌肉毒素PLA₂(碱性磷脂酶Lys49-PLA₂)直接作用于肌细胞质膜，引起大量的肌肉组织损伤，进而导致疼痛、肌肉无法运动；或者蛇毒金属蛋白酶作用于微血管系统或肌肉动脉，导致血管明显受损，造成贫血，间接引起肌肉毒性。肌肉坏死是尖吻蝮蛇伤引起的至关重要损伤，可以导致永久性组织损伤、肢体残疾甚至截肢。不同浓度丹皮酚原苷与蛇毒孵育后进行肌肉损伤抑制实验，如图4所示，丹皮酚原苷可显著的抑制尖吻蝮蛇毒造成的肌肉毒性，当浓度达500mM时，可使肌肉毒性降低约70％。

试验例3

本实验为丹皮酚原苷抑制尖吻蝮蛇毒的水肿活性实验。

蛇毒水肿活性检测参照Rojas等的方法进行。选取健康昆明小鼠25只(20±2g)，随机分为5组。小鼠右后脚注射20μL尖吻蝮蛇毒溶液(2μg)作为阳性对照组，阴性对照组注射相同剂量的生理盐水，于注射后不同时间点(0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min)，用游标卡尺测量小鼠右后脚厚度，计算肿胀率【肿胀率＝(不同时间点脚掌厚度-注射前脚掌厚度)÷注射前脚掌厚度×100】。抑制水肿活性实验：将20μL由不同剂量功效组分(20μM、40μM、80μM)与尖吻蝮蛇毒(2μg)组成的混合液，于37℃水浴45min，再注射小鼠右后脚，按上述方法进行肿胀率检测。

毒蛇咬伤后水肿的发生涉及到多种毒素组分，如PLA₂、金属蛋白酶，这些组分诱导机体快速释放内源性炎症因子：激肽、组胺、5-羟色胺等物质，引起毛细血管通透性增加，组织间液的胶体渗透压上升，组织液生成增多，引起水肿抑制，如图5所示，丹皮酚原苷处理组能使尖吻蝮蛇毒引起的水肿症状明显减弱且趋于稳定，而蛇毒处理组水肿症状不断恶化；终浓度为80mM的丹皮酚原苷在处理后180min，可使水肿程度降低约53％。基于丹皮酚原苷具有的抗出血、抗肌肉毒性作用，推测其可能通过作用于蛇毒中的PLA₂和金属蛋白酶而起到抑制水肿作用。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。