一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：a)研磨工序、b)裂解工序、c)沉淀工序、d)纯化工序。本发明与现有技术相比，通过高温裂解、蛋白酶K变温消化、醋酸钾沉淀、纯化步骤，提高了产率。本发明主要采用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR检测等对提取的线粒体基因组DNA进行质量检测。结果表明，本发明所提取的线粒体基因组DNA的纯度和浓度已满足于群体遗传结构、系统演化、地理分布和构建基因文库等研究的要求。该方法的建立使提取钉螺等小型贝类线粒体基因组DNA过程更加简便、高效。

说明书

技术领域

本发明属于寄生虫DNA的提取方法，特别属于钉螺线粒体基因组DNA的提取方法。

背景技术

钉螺作为日本血吸虫的唯一中间宿主，分布容易受到水质、水温、气候等各种因素影响，从而产生地理隔离，使不同地理群体甚至同域分布的群体产生多个种型。因此，钉螺种内和种群间遗传多态性现状、种群间基因流强度、种群间遗传变异与分化成为了防治血吸虫病工作中的重点。与核基因组相比，线粒体基因组具有其独特的遗传特性，如母系遗传、缺乏重组及进化速率快等，故mtDNA对研究种群遗传变异和分化具有重要意义。

对钉螺线粒体基因组DNA提取时，常用的提取方法有蔗糖密度梯度离心法、碱裂解法、Triton法、高盐沉淀法和试剂盒等，这些提取方法存在着操作过程复杂，产率低，对人体有毒害，核DNA污染严重，试剂价格昂贵等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

a)研磨工序：

将单只钉螺去除螺壳和消化系统组织，取腹足肌肉组织2-3mg，放入研磨器中，加入50-100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织1-2分钟，得到含有肌肉组织的匀浆液，将含有肌肉组织的匀浆液转移至离心管中，再加入50-100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织，重复2-3次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的颗粒，最后用100μl的匀浆液冲洗研磨器，形成冲洗液，将数次研磨得到的含有肌肉组织的匀浆液与冲洗液合并，形成研磨好的匀浆液；

b)裂解工序：

将300-400μl研磨好的匀浆液放入400-800W微波炉中，功率选择高火，加热6-10分钟后，冷却至室温；形成加热匀浆液，向加热匀浆液中加入15-20μl的SDS(终浓度1％)和10-15μl的蛋白酶K(终浓度300～400μg/ml)，混合均匀，升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；再次升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；形成裂解的匀浆液；

c)沉淀工序：

将300-400μl裂解的匀浆液中加入300μl的醋酸钾(PH5.4)，上下轻轻颠倒8～10次，4℃下静置30-60min，于4℃，14000r/min，离心10-20分钟min，得到第1上清液；

取500-600μl的第1上清液于离心管中，再加入等体积醋酸钾溶液，上下颠倒7～8次，4℃下静置30-60min，于4℃，12000r/min，离心10-20min，得到第2上清液；

d)纯化工序：

取900-1000ul的第2上清液于离心管；加入等体积的异丙醇，-20℃冷藏30-60min后，于4℃，14000r/min，离心15min，去上清；加入200-300μl 75％乙醇(体积浓度)进行洗涤，重复洗涤2次，将乙醇风干后，用40-60μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。

所述的匀浆液的pH为8.0，由以下物质组成：25mmol/LTris-HCl，30mmol/LEDTANa₂，50mmol/L葡萄糖。

所述的SDS为20％十二烷基硫酸钠，使用时用水稀释至所需的浓度。

所述的蛋白酶K为10mg/mL蛋白酶K，使用时用水稀释至所需的浓度。

所述的醋酸钾溶液的PH为5.4，由以下的物质组成：3mol/L醋酸钾和2mol/L醋酸。

本发明具有以下的特点：

研磨工序：由于采用传统匀浆器破碎法进行研磨时存在着匀浆次数不易控制的问题，故将匀浆液分多次加入，在保证研磨效果的同时，有效减轻因匀浆过度而导致小片段核DNA污染mtDNA的问题。

裂解工序：将研磨好的匀浆液置于微波炉高温裂解，目的是让组织均匀分散，也让细胞膜在一定程度上发生破裂，以提高裂解效率。在此基础上，在蛋白酶K水浴消化过程中设置了温度梯度，利用温度的急剧改变释放更多的线粒体基因组DNA，使mtDNA的产率得到了明显提高。

纯化工序：应用醋酸钾纯化获得的线粒体基因组DNA，去除了核DNA的污染，避免了酚、氯仿等有机物的毒害作用，也减少了在酚-氯仿抽提过程中造成的线粒体DNA损失，保证了高产率。

本发明所建立的一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA提取方法，与现有技术相比，通过高温裂解、蛋白酶K变温消化、醋酸钾沉淀、纯化步骤，提高了产率。本发明主要采用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR检测等对提取的线粒体基因组DNA进行质量检测。结果表明，本发明所提取的线粒体基因组DNA的纯度和浓度已满足于群体遗传结构、系统演化、地理分布和构建基因文库等研究的要求。该方法的建立使提取钉螺等小型贝类线粒体基因组DNA过程更加简便、高效。

附图说明

图1为实施例1提取的线粒体基因组DNA电泳检测结果；

在图中，M：DNA Marker-R(0.5kb-14kb)；A实施例1所制的线粒体基因组DNA；B蔗糖密度梯度离心法所制的线粒体基因组DNA；C高盐沉淀法所制的线粒体基因组DNA；

图2为实施例1所制的线粒体进行Cox1基因和IT S序列片段扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

在图中，M：DNA Marker-J 100+50bp；DNA；A、B泳道分别为Cox1基因、ITS基因。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

所述的匀浆液的pH为8.0，由以下物质组成：25mmol/LTris-HCl，30mmol/LEDTANa₂，50mmol/L葡萄糖。

所述的SDS为20％十二烷基硫酸钠。

所述的蛋白酶K为10mg/mL蛋白酶K。

所述的醋酸钾溶液的PH为5.4，由以下的物质组成：3mol/L醋酸钾和2mol/L醋酸。

采用SPSS17.0软件进行统计分析，均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1：

一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

a)研磨工序：

将单只钉螺去除螺壳和消化系统组织，取腹足肌肉组织2mg，放入研磨器中，加入50μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织1-2分钟，得到含有肌肉组织的匀浆液，将含有肌肉组织的匀浆液转移至离心管中，再加入50μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织，重复3次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的颗粒，最后用100μl的匀浆液冲洗研磨器，形成冲洗液，将数次研磨得到的含有肌肉组织的匀浆液与冲洗液合并，形成研磨好的匀浆液；

b)裂解工序：

将300μl研磨好的匀浆液放入400W微波炉中，功率选择高火，加热10分钟后，冷却至室温；形成加热匀浆液，向加热匀浆液中加入15μl的SDS(终浓度1％)和10μl的蛋白酶K(终浓度300μg/ml)，混合均匀，升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；再次升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；形成裂解的匀浆液；

c)沉淀工序：

将300μl裂解的匀浆液中加入300μl的醋酸钾(PH5.4)，上下轻轻颠倒8次，4℃下静置30min，于4℃，14000r/min，离心10分钟min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于离心管中，再加入等体积醋酸钾溶液，上下轻轻颠倒7次，4℃下静置30min，于4℃，12000r/min，离心10-20min，得到第2上清液；

d)纯化工序：

取950ul的第2上清液于离心管；加入等体积的异丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，离心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(体积浓度)进行洗涤，重复洗涤2次，将乙醇风干后，用40μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。

实施例2：

一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

a)研磨工序：

将单只钉螺去除螺壳和消化系统组织，取腹足肌肉组织2.5mg，放入研磨器中，加入80μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织1-2分钟，得到含有肌肉组织的匀浆液，将含有肌肉组织的匀浆液转移至离心管中，再加入80μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织，重复2次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的颗粒，最后用100μl的匀浆液冲洗研磨器，形成冲洗液，将数次研磨得到的含有肌肉组织的匀浆液与冲洗液合并，形成研磨好的匀浆液；

b)裂解工序：

将340μl研磨好的匀浆液放入400W微波炉中，功率选择高火，加热10分钟后，冷却至室温；形成加热匀浆液，向加热匀浆液中加入20μl的SDS(终浓度1％)和15μl的蛋白酶K(终浓度400μg/ml)，混合均匀，升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；再次升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；形成裂解的匀浆液；

c)沉淀工序：

将350μl裂解的匀浆液中加入300μl的醋酸钾(PH5.4)，上下轻轻颠倒8次，4℃下静置30min，于4℃，14000r/min，离心10分钟min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于离心管中，再加入等体积醋酸钾溶液，上下轻轻颠倒7次，4℃下静置30min，于4℃，12000r/min，离心10-20min，得到第2上清液；

d)纯化工序：

取950μl的第2上清液于离心管；加入等体积的异丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，离心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(体积浓度)进行洗涤，重复洗涤2次，将乙醇风干后，用50μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。

实施例3：

一种简易高效钉螺线粒体基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

a)研磨工序：

将单只钉螺去除螺壳和消化系统组织，取腹足肌肉组织3mg，放入研磨器中，加入100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织1-2分钟，得到含有肌肉组织的匀浆液，将含有肌肉组织的匀浆液转移至离心管中，再加入100μl的匀浆液，上下研磨腹足肌肉组织，重复2次，研磨至腹足肌肉成5～30μm的颗粒，最后用100μl的匀浆液冲洗研磨器，形成冲洗液，将数次研磨得到的含有肌肉组织的匀浆液与冲洗液合并，形成研磨好的匀浆液；

b)裂解工序：

将400μl研磨好的匀浆液放入400W微波炉中，功率选择高火，加热10分钟后，冷却至室温；形成加热匀浆液，向加热匀浆液中加入20μl的SDS(终浓度1％)和15μl的蛋白酶K(终浓度340μg/ml)，混合均匀，升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；再次升温至60℃，保温1h，降温至37℃，保温1h；形成裂解的匀浆液；

c)沉淀工序：

将400μl裂解的匀浆液中加入300μl的醋酸钾(PH5.4)，上下轻轻颠倒8次，4℃下静置30min，于4℃，14000r/min，离心10分钟min，得到第1上清液；

取550μl的第1上清液于离心管中，再加入等体积醋酸钾溶液，上下轻轻颠倒7次，4℃下静置30min，于4℃，12000r/min，离心10-20min，得到第2上清液；

d)纯化工序：

取950μl的第2上清液于离心管；加入等体积的异丙醇，-20℃冷藏30min后，于4℃，14000r/min，离心15min，去上清；加入200μl75％乙醇(体积浓度)进行洗涤，重复洗涤2次，将乙醇风干后，用60μl双蒸水溶解，-20℃保存备用。

实施例4：

紫外分光光度法是目前测定DNA浓度和纯度的常用方法，其测定的结果准确。当得出A260/A280比值处于1.8～2.0之间时，表明mtDNA质量较好；当小于1.8时，说明有蛋白质污染，当大于2.0时，表明有RNA污染；

将实施例1所制的DNA与目前两种常用的提取方法蔗糖密度梯度离心法和高盐沉淀法进行了比较。其中蔗糖密度梯度离心法按照(Tamura K,Aotsuka T.Rapid isolationmethod of animal mitochondrial DNA by the alkaline lysis procedure[J].Biochemical Genetics,1988,26(11-12):815-819.)提取，高盐沉淀法按照(郑润玲,李家乐,牛东红.缢蛏线粒体DNA提取方法的比较[J].分子科学学报:中英文版,2008,24(5):312-315.)提取线粒体基因组DNA。

所获得的mtDNA样品按1:100稀释，用紫外分光光度仪测定光吸收度值。其结果如表1所示：

结果表明三种提取方法的OD值均处在1.8～2.0之间，差异无统计学意义(F＝0.008、1.076，P>0.05)；实施例1的产率优于蔗糖密度梯度离心法和高盐沉淀法，差异有统计学意义(F＝24.686、16.428，P<0.05)，

实施例5：

琼脂糖凝胶电泳法利用溴化乙锭(EB)可嵌入DNA分子碱基对间形成络合物，经紫外线照射后，通过条带的亮度来粗略判断mtDNA浓度和纯度；

制备1％琼脂糖凝胶，取3μl的线粒体基因组DNA样品与3ul的loading Buffer(30mM EDTA，50％(v/v)Glycerol，0.25％(w/v)Xylene Cyanol FF，0.25％(w/v)Bromophenol Blue)进行混合，80V 40min，凝胶成像仪成像并拍照。

其结果如图1所示，三种提取方法提取的线粒体DNA条带大小均约15kb，其中实施例1的提取效果最好，条带较亮且点样孔附近无明显条带，表明核DNA和蛋白质污染较少。

实施例6：

将实施例1所提取的mtDNA Cox1基因和核基因的ITS序列进行扩增，检测有无核DNA的污染。

扩增Cox1基因引物和ITS序列引物参照已有文献设计(表2)，以衡量线粒体DNA扩增和核DNA污染情况。PCR反应体系包含模板4μl，17μl超纯水，25μl Mix(2×Taq PCRMasterMix)，引物F、R(1mmol/L)各2μL。PCR反应条件：Cox1 94℃5min；94℃30s，51℃50s，72℃1min，循环34次；72℃延伸10min；ITS退火温度为50℃，其他条件与Cox1相同，扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外光下分析各条带的亮度。

表2 扩增Cox1、ITS基因的引物及序列

线粒体基因组DNA的PCR扩增结果如图2所示，Cox1基因扩增产物图谱为700bp左右片段，送上海生物工程有限公司测序，将测序结果经GenBank查询，发现与湖北钉螺mtDNACox1基因同源性在99％，确定为线粒体基因。而ITS无明显条带，结果表明核基因含量较少。