诱导的T7 RNA聚合酶

摘要

本发明涉及一种诱导的T7 RNA聚合酶，尤其是光或小分子化合物诱导调控的T7 RNA聚合酶；具体是选择T7 RNA聚合酶中特定的氨基酸序列位置作为拆分位点拆分，并将拆分后的片段与光敏感或小分子化合物敏感的结构域、蛋白或肽融合，实现了以下诱导调控：a.光或小分子化合物介导的蛋白‑蛋白相互作用调控T7 RNA聚合酶活性；b.光诱导别构调控使拆分片段自组装恢复T7 RNA聚合酶活性；c.光敏结构域嵌入T7 RNA聚合酶内部通过光诱导别构调控聚合酶活性。本发明构建的诱导体系实现了在时间和空间维度上对基因表达的精确调控，以及T7 RNA聚合酶拆分体系的多样化为实现模块化调控基因表达提供了强大的参考价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种光诱导的T7 RNA聚合酶，以及一种用工程化改造的核糖核酸聚合酶(RNAP)来诱导和控制基因表达的方法。本发明构建了能够特异性对蓝光响应，在光照和非光照条件下转录活性表现出显著差异的T7 RNA聚合酶，从而实现用光信号激活的转录启动，适用于需要用外部信号控制基因表达的应用场合，如重组蛋白质生产、代谢途径调节等。

背景技术

基因开关即利用可人工操控的外部信号调节基因表达。基因开关在生物技术中具有广泛应用。例如，利用生物细胞生产具有医疗用途和商业价值的目的蛋白质是一项极为重要且具有巨大经济效益的生物技术产业。为了让生物细胞高效的合成目的蛋白质，一般要构建一个包含编码目的蛋白基因、能够条件性表达目的蛋白的基因表达载体。T7表达系统是一种目前广泛使用的外源基因表达系统。该表达系统包含T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)和一个含有能被T7 RNA聚合酶特异性识别和驱动的T7启动子的载体。这种由于T7 RNA聚合酶及其启动子之间识别的特异性和高效性而建立的表达系统，为目前在生物细胞如大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白最强大的表达系统之一¹。此外，T7>2-5。

目前，用T7 RNAP实现条件性基因表达或基因开关主要有两种方式：一种是调控细胞内T7 RNAP编码序列上游的启动子区域，通过化学诱导等启动T7 RNAP的表达，例如通过IPTG启动T7 RNA聚合酶的表达，后者再进行下游目标基因的转录；另外一种是对T7 RNAP自身的人工调控，目前已知的方式是在T7 RNAP合成过程中引入非天然氨基酸，通过UV照射的方式使非天然氨基酸变为天然氨基酸，从而激活T7RNAP，用于下游基因的表达⁶。化学诱导生产目标蛋白质的方法虽然较为简单和容易操作，但是化学诱导物由于在时间和空间维度上分辨率相对较差(无法达到均匀诱导每一个细胞)，没有组织特异性，在生物系统中很难移除干净(存在污染发酵母液的风险)，不利于生产具有医疗功能的蛋白质，而且化学诱导物成本昂贵，从而限制了化学诱导物在实验研究和工业生产上的广泛应用；光化学诱导基因表达虽然能在时间和空间维度上获得较高的分辨率，但是诱导因子---紫外射线对细胞有潜在的副作用。此外，>

相较于化学诱导，光具有容易获取，成本低廉，高度可调，对细胞无毒(图2)，在时间和空间维度上有着很高的分辨率等固有属性，是一种用于基因表达调控的理想外部信号。

发明内容

本发明的目的在于提供多种不依赖于非天然氨基酸、但能够受到光诱导控制的T7RNA聚合酶，以改善T7表达系统并扩大该系统在工业上的实用性。

本发明涉及以下各项：

1.一种T7 RNA聚合酶的诱导表达调控试剂盒，所述试剂盒包含拆分为两部分的或其中插入外源蛋白或肽的T7 RNA聚合酶，其编码基因，或包含所述编码基因的构建体，

其中，

所述拆分或插入的氨基酸位置选自氨基酸位置165-168、175-186、308-312、343-371、496-500、560-568、588-611、661-668或709-724，优选为氨基酸位置560-568；

在拆分为两部分的情况下，拆分的两部分分别与经外源诱导而相互作用的一对蛋白或肽中的每个融合表达，或拆分的两部分中的一部分与经外源诱导会别构的蛋白或肽融合表达；或

所述外源蛋白或肽为经光诱导会别构的蛋白或肽。

2.根据1所述的试剂盒，其中所述经外源诱导会相互作用的一对蛋白或肽是光敏蛋白，优选为VVD，所述VVD的编码序列为SEQ ID No：1，其相应氨基酸序列为SEQ ID NO.26。

3.根据1所述的试剂盒，其中所述经外源诱导会相互作用的一对蛋白或肽是FKBP12和FRB，所述FKBP12和FRB的编码序列分别为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，其相应氨基酸序列分别为SEQ ID No：28和SEQ ID No：29。

4.根据1所述的试剂盒，其中外源诱导是光，如蓝光或小分子化合物，如雷帕霉素。

5.根据1所述的试剂盒，其中所述拆分的两部分中的N端部分在其C端与所述经外源诱导会相互作用的一对蛋白或肽中的一种蛋白或肽融合，所述拆分的两部分中的C端部分在其N端与所述经外源诱导会相互作用的一对蛋白或肽中的另一种蛋白或肽融合。

6.根据1所述的试剂盒，其中所述经外源诱导会别构的蛋白或肽是pMag，所述pMag的编码序列是SEQ ID No：2，其相应氨基酸序列为SEQ ID NO：27。

7.根据6所述的试剂盒，其中pMag与所述拆分的两部分中的N端部分融合。

8.根据1所述的试剂盒，其中所述融合通过接头实现，

优选地，在拆分为两部分的情况下，用于所述拆分的两部分的接头序列分别为SEQID NO.13和SEQ ID NO.15；或

优选地，在其中插入外源蛋白或肽的情况下，在外源蛋白或肽两侧的接头序列分别为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15。

9.一种开启或关闭T7 RNA聚合酶的方法，所述方法包括：

1)利用权利要求1-8中任一项所述的试剂盒获得表达拆分为两部分的或其中插入外源蛋白或肽的T7 RNA聚合酶的细胞；

2)用或不用诱导物处理步骤1)中获得的细胞。

10.根据9所述的方法，所述诱导物是光，如蓝光或小分子化合物，如雷帕霉素。

具体而言，本发明的核心内容是通过多肽链拆分、引入光或小分子敏感的蛋白结构域获得人工改造的、具有光控或小分子化合物控制的活性的T7 RNA聚合酶(以下主要以光敏的蛋白结构域为例具体描述本发明的原理和设计，但不意味着本发明仅限于光敏的蛋白结构域的情况)。

具体地，本发明通过拆分T7 RNA聚合酶，并按照不同的方式重组光敏蛋白和T7RNA聚合酶的两个片段，获得三种类型的受光调控的T7 RNA聚合酶：一种是通过光诱导光敏蛋白之间的相互作用促使T7 RNAP的两个片段之间相互作用以此恢复T7RNAP的活性；另外一种是选用不存在同源相互作用的光敏蛋白并将此蛋白与T7RNAP拆分片段的其中一个片段融合，借助T7 RNAP拆分片段之间已存在的高亲和力和光敏蛋白的空间阻抑效果，从而实现通过光诱导的别构效应调控T7 RNAP的活性；另外一种是将非同源相互作用的光敏蛋白结构域整合到野生型的T7 RNAP内部，通过光诱导前后光敏蛋白的构象变化实现对T7 RNA聚合酶活性的调控。此三种类型的T7RNA聚合酶均特异性的对光响应，即在黑暗条件下无酶活，在蓝光(波长～460nm)照射下恢复酶活性并激活T7启动子下游基因的转录。

以下分别描述构建这三类体系的详细技术路线：

1.光诱导蛋白-蛋白相互作用调控T7 RNAP活性

本发明中采用的光敏蛋白是VVD，VVD是丝状真菌Neurospora crassa中的光感应蛋白，也是目前已知的最小的光敏蛋白之一，该光敏蛋白能在蓝光照射下从单体变 为同源二聚体。基于此特性，我们将VVD与拆分后的T7 RNAP片段融合，获取光激活的T7 RNAP，以此实现对T7 RNAP在时间和空间维度上的精确调控。我们从多个氨基酸位置拆分T7 RNAP，然后将每个位点拆分获取的两个片段分别与VVD结构域融合，然后检测光照前后T7 RNA聚合酶的活性。对于T7 RNA聚合酶拆分位置的选择，我们根据T7 RNAP和DNA-RNA异源双链形成的复合物品体结构分析(PDB：1QLN)，选择分布于T7 RNAP表面且不与DNA-RNA异源双链直接作用的loop区域作为拆分位置，并且需保证loop区域两端连接的是helix二级结构，这样我们总共选择了9个loop作为拆分选项，对应的氨基酸位置是165-168、175-186、308-312、343-371、496-500、560-568、588-611、661-668和709-724，其中709-724这个位置的loop N端与Helix相连，C端与sheet相连。构建的上述光诱导体系连同报告体系(报告体系的启动子是P_T7，报告基因是GFPuv)共转化到E.coli，根据E.coli展现的荧光有无和强弱差异，我们测定7个拆分位置得到的片段与光敏蛋白融合后表现出显著的光诱导效应。对应的loop区域175-186这个位置，拆分获取的两片段与VVD融合，不光照情况下，有部分T7>

2.T7 RNAP片段的自组装受光诱导的别构调控

VVD在光照条件下从单体变为同源二聚体的过程中，其自身是存在着显著构象变化的，并且其构象变化主要发生在N端即Ncap区域⁷；此外，最近有文献报道根据VVD获取的突变体Magnets(包括pMag和nMag两种光敏结构域)之间可通过异源相互作用形成二聚体，而且不存在同源相互作用的可能性⁸。而且在测试光诱导蛋白-蛋白相互作用调节T7>

3.光诱导别构调控全长(Full-length)T7 RNAP活性

在生物体内，外源蛋白的存在对生物体自身都会或多或少产生毒性作用，所以在保证外源蛋白对细胞功能的前提下尽量减少外源蛋白的种类和数量是我们追求的目标。前文报道的光诱导调控T7 RNAP活性都是在T7 RNAP拆分的基础上进行了，而这类体系会导致细胞的负担加重，因此我们需要构建一类调控体系，既要满足光诱导调控的需求，并实现对细胞的减负。根据上文我们知道magnet可以别构调控T7 RNAP的拆分体系，而且作为别构调控的这些拆分片段之间都存在着较高的亲和力，所以我们尝试将magnet直接整合到Full-length T7 RNAP中对应的这些位点上，即magnet作为Full-length T7 RNAP的一部分参与对T7 RNAP的别构调控。将此嵌合体和GFPuv报告体共转化到E.coli并测定光照前后E.coli表现出的荧光差异，我们发现这些嵌合体都表现出共同的特性，即不光照无酶活性，光照酶活性显著改善。如此，我们得到了最简化版本的T7 RNAP光诱导调控体系。

此外，上述三种类型的光诱导体系虽然在时间和空间维度上实现了对目的基因的精确调控，而且作用一种分子开关在绝大多数情况下都具有普遍的适用性。但是光作为一种诱导因子对于某些细胞而言，持续性的光照会对细胞造成潜在性的损伤效果，所以我们希望T7 RNAP的拆分体系不仅能通过光诱导的蛋白-蛋白相互作用来调节其活性，也能适用于其他诱导因子诱导的蛋白-蛋白相互作用来调节其活性。

在优选的实施方案中，根据之前已获取的光诱导蛋白-蛋白相互作用得到的T7RNAP诱导体系，并将光敏结构域用其他类型的受小分子调控的相互作用结构域替换，然后检测T7 RNA聚合酶的活性。实验检测发现，T7 RNAP的拆分体系具有很强的适应性，拆分后T7 RNAP既能通过光诱导调控其活性，也能通过小分子化合物调控其活性。这样，我们发明了一种T7 RNAP的拆分体系，并且这个拆分体系具有强大的兼容性和适应性，从而使T7RNAP作为一种分子开关在生物体内具有广泛的应用层面。

优点和积极效果

1.本发明通过光诱导的方式生产目的蛋白质，此种物理诱导的方式简单、经济，不会造成发酵过程中的污染，而且可以实现精细调控细胞的基因表达水平。

2.三种类型的T7 RNAP光诱导调控体系，在动力学和热力学方面具有相对较明显的光诱导属性差异。据此可依照目的蛋白的属性选用不同类型的光诱导体系，以获取更高产量的目的蛋白。

3.本发明的T7 RNAP拆分体系具有模块化属性。T7 RNAP拆分体系既可以用光诱导的方式调控T7 RNA聚合酶的活性，也可以采用化学小分子调控的方式调节聚合 酶活性，从而使基于T7 RNAP构建的分子开关具有更加广泛的应用层面。

附图说明

从下面结合附图的详细描述，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.本发明中构建的质粒图：

图1a.质粒p5C-MCS 图1b.质粒p5C-VVD(N)图1c.质粒p5C-VVD(C)

图1d.质粒p5C-VVDI图1e.质粒paT7P-1 图1f质粒paT7P-2

图1g.质粒paT7P-3 图1h.质粒pJ61-R图1i质粒CaT7P

图2.时间维度上比较光对细胞生长的影响

图3光诱导调控T7RNAP的原理示意图和三种光诱导体系光照前后荧光数目的测定与分析

图3a光诱导蛋白-蛋白相互作用调控T7 RNAP活性示意图

图3b光诱导别构调控T7 RNAP拆分体系的自组装示意图

图3c光诱导别构调控Full-length T7 RNAP活性示意图

图3d.三种类型的光诱导体系和野生型T7 RNA聚合酶表达强度对比图

图4a.雷帕霉素诱导蛋白-蛋白相互作用调控T7 RNAP活性的示意图

图4b.雷帕霉素诱导调控T7 RNA聚合酶活性强度测定与分析

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

实施例1光诱导蛋白-蛋白相互作用调控T7 RNAP活性(图3a)

PaT7P-1，本发明中设计的一种可通过光诱导的蛋白-蛋白相互作用恢复T7 RNA聚合酶(编码序列为SEQ ID NO.5，相应氨基酸序列为SEQ ID NO.30)的诱导体系。该诱导体系通过下述方法获得：以质粒J61002(BioBrick code BBa_J61002)为模板，将氨苄抗性基因用卡那抗性基因替换，得到p5C质粒作为光诱导体系的模板，并在该模板上导入多克隆位点(MCS)，得到p5C-MCS(图1a)。在NheI和NcoI之间插入组成型启动子Pcat(BioBrick codeBBa_I14033)，在NcoI/BglII和KpnI/NdeI酶切位点之间分别插入RBS(BioBrick code BBa_B0034)。基因合成VVD-36⁹序列(光敏蛋白VVD的N端去掉36个氨基酸，对应的编码序列和氨基酸序列如SEQ>

由于我们这里只是检测光诱导对T7 RNA聚合酶活性的影响，所以选用报告基因GFPuv用于表征T7 RNAP聚合酶的活性在光照前后的变化。报告基因构建的实施方法如下：(1)以J61002(BioBrick code BBa_J61002)为模板，替换复制起始pMB1为CloDF13，得到载体pJ61质粒；(2)启动子J23100用启动子P_T7替换，编码序列导入到酶切位点SpeI/XbaI之间，并将终止序列rrnB用T7>

实施例2光诱导别构调控T7 RNAP拆分体系的自组装(图3b)

PaT7P-2，本发明中设计的一种光诱导的别构调控体系，光激活促使蛋白片段的自组装从而恢复T7 RNA聚合酶的活性。该诱导体系通过下述方法获取：质粒paT7P-1用NdeI、SacII双酶切，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶和引物对C565-F2(SEQ ID NO.21)，C565-R1(SEQ ID NO.20)进行PCR扩增，获得C565-I片段，并使用重组酶Exnase II(Vazyme)将C565-I片段重组到该酶切位置，然后使用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶和引物对pMag-F(SEQ IDNO.22)和pMag-R(SEQ ID NO.23)进行定点突变PCR，然后DpnI酶切后转化测序获取paT7P-2(图1f)(备注：pMag是VVD的一种突变体， 其核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：27所示，pMag之间不存在同源相互作用⁸)。报告体系选用实施例1中的pJ61-R，共转化到E.coli，涂板，挑单克隆，液体过夜培养，等比例转接，分别在光照和黑暗条件下液体培养一定时间(～20h)，取相同量的光照前后的菌液用酶标仪读取荧光数目。根据光照前后荧光数目的差异，我们分析发现paT7P-2光照前无T7>

实施例3光诱导别构调控Full-length T7 RNAP活性(图3c)

PaT7P-3，光诱导别构调控T7 RNA聚合酶，这是实施例2中描述的paT7P-2的简化版本。该诱导体系通过下述方法获得：paT7P-1用EcoRI、BamHI双酶切，去掉VVD编码序列。以paT7P-2为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶和引物对pMagl-F(SEQ ID NO.24)和pMag1-R(SEQ ID NO.25)进行PCR扩增，获得pMag1片段(含linker1序列)，使用重组酶ExnaseMultis(Vazyme)将pMag1和linker2重组到上述EcoRI/BamHI酶切位点处，以此获得paT7P-3(图1g)。检测paT7P-3光诱导属性依旧选择实施例1中提到的pJ61-R报告体系，将paT7P-3和pJ61-R共转化到E.coli，挑单克隆，液体过夜培养，等比例转接，分别在光照和黑暗条件下液体培养一定时间(～20h)，取相同量的光照前后的菌液用酶标仪读取荧光数目。根据测定的光照前后荧光数目的差异，paT7P-3具有和上述描述的paT7P-1和paT7P-2相似的特性，即不光照无酶活，光照T7RNAP聚合酶的活性显著改善(图3d)。

实施例4化学因子介导的蛋白-蛋白相互作用调控T7 RNAP活性

为了验证T7 RNAP的拆分体系可以被模块化的调控，即T7 RNAP既可以被光诱导调控，也可以被化学因子介导的相互作用调节。如图4a所示，选取已有的实施例1中paT7P-1作为我们的改造对象，将VVD相互作用结构域用rapamycin(雷帕霉素)诱导的相互作用结构域FKBP12(其核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28所示)和FRB(其核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：29所示)替换(备注：FKBP12和FRB这两个结构域在有雷帕霉素存在的情况下可以异源相互作用)。该诱导体系可通过下述方法获得：FKBP12和FRB这两个结构域的编码序列通过基因合成(通用生物公司)的方式获取，paT7P-1中VVD结构域通过酶切的方式去掉，FKBP12和FRB采用同样的酶切方式(备注：FKBP12和FRB在基因合成的过程中已带有和paT7P-1中VVD两端相同的酶切位点)获取，然后用T4 DNA连接酶(Thermo)将FKBP12和FRB导入到之前VVD所在的位置，如此构建获取对雷帕霉素响应的T7 RNAP诱导体系，命名为CaT7P(图1i)。报告体系依然选用之前描述的pJ61-R质粒。共转化，挑单克隆，液体过夜培养，等比例转接，检测 诱导前后E.coli表型的差异。酶标仪读取诱导前后荧光的数目并分析，我们证实T7RNAP拆分体系具有模块化属性，在特定位点拆分获取的两个片段既可以与光敏结构域融合并可通过光激活的方式恢复聚合酶活性，也可以与对化学小分子响应的结构域融合并可通过化学诱导的方式提高聚合酶的活性(图4b)。

参考文献

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