树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法

摘要

本发明公开一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法，经树鼩角膜内皮原代细胞的分离、纯化、CECs的传代培养，得到角膜内皮细胞。分离得到的角膜内皮细胞具有较高的细胞活力，在传至P3代可以实现树鼩角膜内皮细胞的纯化，纯化的细胞具有典型的内皮细胞形态，经NSE免疫荧光鉴定，染色率高。该方法纯化效率大大提高，价格低廉、使用方便，可以获得大量树鼩角膜内皮细胞。实现树鼩角膜内皮细胞的体外培养，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的角膜内皮原代细胞体外培养技术的空白，本发明提供的原代细胞的取材及纯化方法操作简单，价格低廉，体外培养的树鼩角膜内皮细胞可以在长期的传代培养过程中维持良好的细胞形态。

说明书

技术领域

本发明涉及一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法。

背景技术

角膜内皮细胞（Corneal Endothelial Cells，CECs）是一种来源角膜最靠近内侧的一层内皮细胞，它的液体屏障和Na+-K +离子泵功能对于维持角膜透明至关重要，各种损伤因素引起角膜内皮细胞功能失代偿将导致角膜水肿混浊。穿透角膜移植术是取代病变或受损的内皮细胞恢复角膜透明的有效方法，但供体来源短缺及术后免疫排斥反应的发生限制了手术的开展。近年来随着细胞体外培养技术的发展，体外培养角膜内皮细胞进行内皮移植成为新的发展趋势，其中高质量的种子细胞是构建内皮细胞移植能否成功的重要影响因素。但由于人类角膜供体的极其短缺，限制了实验研究的进展，寻找一种适用的、可以代替人类角膜内皮细胞的实验用细胞迫在眉睫。

目前已从人、兔、羊和大小鼠中分离培养出CECs，但各物种的CECs在形态和反应性上存在种属差异，如体外贴壁生长时，不同种属的CECs细胞形态明显不同。最近研究发现，树鼩（Tupaia>）与恒河猴的角膜内皮细胞由于其具有细胞面积较均衡、变异系数小和六边形细胞比例高等特点而被认为可以作为研究人类角膜内皮疾病的合适动物，加之与非人灵长类动物相比，树鼩来源广泛、价格低廉，被预测在角膜内皮疾病相关研究中具有良好的应用前景。只有建立一套有效的针对树鼩角膜内皮细胞的体外分离、培养及鉴定的方法，才能提供一种适用的、可以代替人类角膜内皮细胞的实验用细胞。

角膜内皮细胞体外培养常用的取材方法是组织膜块贴壁法、酶消化法和揭膜-消化两步法，现有的CECs方法，均不能很好的、快速有效的将树鼩CECs从动物体内分离。目前研究者使用的一般组织膜块贴壁法并不能使角膜内皮有效贴壁；而一般的酶消化法和贴壁-消化两步法，可以将树鼩CECs从动物体分离，但其分离得到的细胞纯度不理想，具有更强增殖性的杂质成纤维细胞往往会成为优势群体而抑制CECs的生长而影响CECs的体外培养实验。基于此，现在亟需开发一套针对树鼩CECs原代细胞的体外分离及纯化方法。

发明内容

为解决现有的树鼩角膜内皮细胞难以成功分离，分离得到的CECs纯度不理想的问题，本发明一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法，该方法能将树鼩CECs原代细胞很好的分离，大大提高纯化效率。

本发明通过下列技术方案实现：一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法，包括下列步骤：

（1）树鼩角膜内皮原代细胞的分离：

将成年树鼩死体的后弹力层完整撕下，加入3mL消化液，置于37℃的摇床上消化2h后以1500rpm离心10min，用培养液冲洗3次后重悬细胞，再以1500r/min离心10min，弃上清，加入5mL培养液吹打混匀后移至25cm²培养瓶中，将沉淀吹打混匀，在37℃、5%CO₂的条件下培养25～30d至P5代，隔日换培养液，得到培养样品；

（2）树鼩角膜内皮细胞的纯化：

联合使用差速消化法辅助细胞纯化：将步骤（1）所得培养样品，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2min，显微镜下观察到大部分成纤维细胞变圆、悬浮后用含10%FBS的DMEM/F12细胞培养液终止消化，反复吹打后弃掉消化下来的细胞，再用PBS冲洗3次后添加培养液继续培养，24h后全量换液，以后隔天换液；

（3）CECs的传代培养：

待步骤（2）培养的细胞生长至80%融合度后，用0.25%胰酶消化按1:2传代培养，传至P5代的角膜内皮细胞。

所述步骤（1）的消化液是含胶原酶75μg/mL、中性蛋白酶20μg/mL、DTT 0.5mg/mL和FBS 1%的DMEM低糖培养基。

所述步骤（1）、（2）的培养液是经下列操作制得：将Ham’s F12培养液与M199培养液按1:1质量比混合，再加入5%FBS、20μg/mL抗坏血酸钠、5μg/L胰岛素、1%ITS（Insulintransferrin selenium）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，5ng/mL EGF(epidermalgrowth factor)，添加10μmol/L的TGF-β抑制剂（SB431542，Selleck），即得到培养液。使用TGF-β抑制剂抑制杂质成纤维细胞的生长。该培养液分可在2～8℃保存1周。

树鼩角膜内皮细胞的鉴定：

用苏木精-伊红染色进行形态学鉴定：将步骤（3）传至P5代的角膜内皮细胞接种至6孔板上，待角膜内皮细胞生长至80%融合度后，弃去培养液，使用4%甲醛溶液固定10min，再以PBS冲洗3次，苏木精染色20s，PBS冲洗3～5次，伊红负染10min；在相差显微镜下观察细胞形态；

使用神经元特异性烯醇酶（NSE）免疫荧光染色进行鉴定：将培养至P5代的CECs融合至80%面积的细胞培养瓶，使用4%的甲醛溶液固定20min，PBS清洗3次，每次冲洗2min，再以0.5%的Triton-X100穿孔15min，PBS漂洗三次，然后用山羊血清封闭液封闭30min，PBS漂洗三次，再加入1%BSA稀释的兔抗人神经元特异性烯醇酶（NSE）一抗（1:1000），4℃过夜，PBS漂洗三次，加入1%BSA稀释的荧光标记的羊抗兔IgG（1:200），37℃孵育1h，PBS漂洗三次，抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

本发明通过大量试验筛选，最终提出最适消化液浓度组合，同时提出了在培养基中添加TGF-β抑制剂，联合差速消化分离法和低浓度血清培养。采用上述技术方案的进行树鼩角膜内皮原代细胞体外分离、纯化，可以成功分离得到树鼩角膜内皮细胞，分离得到的角膜内皮细胞具有较高的细胞活力，在传至P3代可以实现树鼩角膜内皮细胞的纯化，纯化的细胞具有典型的内皮细胞形态，经NSE免疫荧光鉴定，染色率高。该方法纯化效率大大提高，价格低廉、使用方便，可以获得大量树鼩角膜内皮细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是在于，本发明首次提供了树鼩角膜内皮细胞原代分离及纯化方法，可以实现树鼩角膜内皮细胞的体外培养，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的角膜内皮原代细胞体外培养技术的空白，分离得到的角膜内皮细胞具有较强的细胞活力与较高的CECs细胞纯度，本方法同时在体外培养过程中提高了角膜内皮细胞的纯度，极大程度地避免了杂质成纤维细胞对角膜内皮细胞生长与增殖的干扰。此外，本发明提供的原代细胞的取材及纯化方法操作简单，价格低廉，体外培养的树鼩角膜内皮细胞可以在长期（至少P20代）的传代培养过程中维持良好的细胞形态。

附图说明

图1是分离得到的树鼩角膜内皮细胞不同时期生长状态；其中A是消化后的细胞，B是4h后部分细胞贴壁，C是3d后细胞倍增生长，D是7d后大部分细胞融合。

图2是树鼩角膜内皮细胞的纯化状态；其中A是使用TGF-β抑制剂纯化3d的树鼩CECs，B是使用TGF-β抑制剂培养5d的树鼩CECs，C是使用TGF-β抑制剂培养10d的树鼩CECs，D是经TGF-β抑制剂纯化过树鼩CECs传至P3代。

图3是树鼩角膜内皮细胞的形态学与免疫学鉴定情观察结果；其中A是树鼩CECs的苏木精-伊红染色（100X），B是树鼩CECs的苏木精-伊红染色（400X），C是树鼩CECs神经元特异性烯醇酶免疫荧光染色，D是对照组成纤维细胞NSE免疫荧光染色。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

（1）树鼩角膜内皮原代细胞的分离：

将成年树鼩死体的后弹力层完整撕下，加入3mL消化液，置于37℃的摇床上消化2h后以1500rpm离心10min，用培养液冲洗3次后重悬细胞，再以1500r/min离心10min，弃上清，加入5mL培养液吹打混匀后移至25cm²培养瓶中，将沉淀吹打混匀，在37℃、5%CO₂的条件下培养25～30d至P5代，隔日换培养液，得到培养样品；每间隔两天在显微镜下观察细胞形态并拍照记录，见图1；

所述消化液是含胶原酶75μg/mL、中性蛋白酶20μg/mL、DTT 0.5mg/mL和FBS 1%的DMEM低糖培养基；

培养液是经下列操作制得：将Ham’s F12培养液与M199培养液按1:1质量比混合，再加入5%FBS、20μg/mL抗坏血酸钠、5μg/L胰岛素、1%ITS（Insulin transferrin selenium）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，5ng/mL EGF(epidermal growth factor)，添加10μmol/L的TGF-β抑制剂（SB431542，Selleck），即得到培养液；

（2）树鼩角膜内皮细胞的纯化：

联合使用差速消化法辅助细胞纯化：将步骤（1）所得培养样品，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2min，显微镜下观察到大部分成纤维细胞变圆、悬浮后用含10%FBS的DMEM/F12细胞培养液终止消化，反复吹打后弃掉消化下来的细胞，再用PBS冲洗3次后添加培养液继续培养，24h后全量换液，以后隔天换液；培养液同上；在显微镜下观察细胞形态并拍照记录，见图2；

（3）CECs的传代培养：

待步骤（2）培养的细胞生长至80%融合度后，用0.25%胰酶消化按1:2传代培养，传至P5代的角膜内皮细胞，用于树鼩角膜内皮细胞鉴定，倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况。

树鼩角膜内皮细胞的鉴定：

用苏木精-伊红染色进行形态学鉴定：将步骤（3）传至P5代的角膜内皮细胞接种至6孔板上，待角膜内皮细胞生长至80%融合度后，弃去培养液，使用4%甲醛溶液固定10min，再以PBS冲洗3次，苏木精染色20s，PBS冲洗3～5次，伊红负染10min；在相差显微镜下观察细胞形态；

使用神经元特异性烯醇酶（NSE）免疫荧光染色进行鉴定：将培养至P5代的CECs融合至80%面积的细胞培养瓶，使用4%的甲醛溶液固定20min，PBS清洗3次，每次冲洗2min，再以0.5%的Triton-X100穿孔15min，PBS漂洗三次，然后用山羊血清封闭液封闭30min，PBS漂洗三次，再加入1%BSA稀释的兔抗人神经元特异性烯醇酶（NSE）一抗（1:1000），4℃过夜，PBS漂洗三次，加入1%BSA稀释的荧光标记的羊抗兔IgG（1:200），37℃孵育1h，PBS漂洗三次，抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

对成纤维细胞用相同方法进行免疫荧光染色，作为阴性对照。见图3。

从图1可知，使用揭膜-消化两步法得到的角膜内皮细胞漂浮在培养液中，呈圆形，轮廓清楚，胞浆清亮。3～4h后见少许细胞已贴壁，有伪足伸出，呈不规则形。24h后大部分细胞已经贴壁，细胞形态不规则。第2～3d细胞生长活跃向四周扩展，部分细胞融合形成细胞群落。第7d大部分细胞融合，呈多边形，边界清楚，胞浆丰富。

从图2可知，使用TGF-β抑制剂（SB431542，DMSO溶解）在抑制剂浓度为10μM，作用时间为10d的时候，对树鼩杂质成纤维细胞的生长产生明显可见的抑制作用，在传至P3代细胞时可以实现角膜内皮细胞的纯化。

从图3的A和B可知，苏木精-伊红染色显示细胞以多边形为主，相互嵌合呈片状单层，无角膜上皮细胞、基质细胞生长。图3的C显示树鼩CECs的免疫荧光染色结果呈阳性，图3的D为对照组成纤维细胞呈阴性结果。具有角膜内皮细胞的一般特征。

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