包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法

摘要

本发明公开了一种包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法，利用抽吸或者解剖法，从卵巢卵泡中获得卵丘‑卵母细胞复合体；以卵丘‑卵母细胞复合体为基本材料，采用石蜡包埋的方式，将卵丘‑卵母细胞复合体吸入到EP管中，用软蜡与硬蜡浸泡，吸出注入包埋箱，进行包埋。本发明利用石蜡包埋的方式，构建了一种包含多个复合体的新型COCs复合结构组织；创造性地将传统石蜡组织切片技术用于细胞检测，改善了传统的免疫组织化学染色技术流程，简化了繁杂的脱水程序，显著缩短了检测时间，提升了固定效果，有效地避免了卵巢切片技术中不易切到卵泡与卵母细胞容易丢失的问题；清晰明确地了解卵丘细胞与卵母细胞中的蛋白协同表达情况。

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞化学与免疫组织化学技术领域，尤其涉及一种包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法。

背景技术

哺乳动物有腔卵泡是动物发情期后出现的一种特定发育阶段卵泡。此时期卵泡内，卵母细胞外被多层卵丘细胞，仅以部分卵丘颗粒细胞与附着于卵泡内膜上的壁颗粒细胞相连，以卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的特殊形态突出于卵泡腔内的卵泡液中。随着卵泡的持续发育与优势化，成熟卵泡破裂，将COCs排入输卵管。此复合结构进入输卵管以后，会停留在输卵管壶腹部等待受精。基于COCs的这一结构与功能特点特性，在有腔卵泡阶段将COCs从卵泡内取出，在适宜的体外环境内，能够将COCs成功培养至可受精的成熟阶段。在此结构中，卵丘细胞以间隙连接等方式与卵母细胞进行营养传递与信息交流。两者间的连接结构以及在此基础上进行的信息交流与功能互作是卵母细胞成熟的根本保障。故此，在保留COCs结构完整的基础上，探讨某未知蛋白或者某蛋白配体与受体在卵母细胞与卵丘细胞上的协同表达情况，对于深入了解其在此结构中可能的自分泌或者旁分泌模式，揭示卵泡发育与卵母细胞成熟机制，有重要的方法论意义。目前在细胞与组织中定性检测特定蛋白表达情况的常规技术，主要包括免疫细胞化学与免疫组织化学两类技术。但是上述技术在检测哺乳动物卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中的蛋白表达时存在显著缺陷，现分述如下：1.免疫细胞化学技术：这是一种在细胞水平上检测特定蛋白表达的技术。COCs是一类由多层卵丘细胞与一层均质透明带包被卵母细胞的复合结构，在常规实验条件下，一抗与带标记基团二抗很难进入该复合结构的的深层卵丘或卵母细胞内部，致使卵丘细胞与卵母细胞中待检抗原标记困难；2.免疫组织化学技术：该项技术以石蜡包埋或者冰冻方式处理固定组织块，切片后，利用免疫技术标记组织各细胞中特定蛋白。卵巢上的卵泡粗略可分为腔前卵泡和有腔卵泡两大类。在有腔卵泡中COC仅通过部分卵丘颗粒细胞与卵泡壁相连，而且随着卵泡的不断发育，相连部分的连接变得愈加松散。所以利用该技术检测COCs中蛋白表达时存在诸多缺点，如：卵泡不易切到；切到卵泡但是COCs或者卵母细胞极易丢失；工作量巨大；由于卵巢组织内还存在其他细胞(壁颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵泡外组织细胞等)，造成目的细胞(卵丘细胞与卵母细胞)上蛋白定性不明确等。

目前在细胞与组织中定性检测特定蛋白表达情况的技术存在一抗与带标记基团二抗很难进入该复合结构的的深层卵丘或卵母细胞内部，致使卵丘细胞与卵母细胞中待检抗原标记困难，卵泡不易切到；切到卵泡，COCs或者卵母细胞极易丢失，工作量巨大，目的细胞上蛋白定性不明确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法，旨在解决目前在细胞与组织中定性检测特定蛋白表达情况的技术存在一抗与带标记基团二抗很难进入该复合结构的的深层卵丘或卵母细胞内部，致使卵丘细胞与卵母细胞中待检抗原标记困难，卵泡不易切到；切到卵泡，COCs或者卵母细胞极易丢失，工作量巨大，目的细胞上蛋白定性不明确的问题。

本发明是这样实现的，一种包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法，所述包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法利用抽吸或者解剖法，从卵巢卵泡中获得卵丘-卵母细胞复合体；以卵丘-卵母细胞复合体为基本材料，采用石蜡包埋的方式，将卵丘-卵母细胞复合体吸入到EP管中，经固定、水洗、脱水、透明与浸蜡等步骤，进行包埋；构建了一种包含多个复合体的新型卵丘-卵母细胞复合体复合结构组织。

进一步，所述包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法具体包括以下步骤：

步骤一，利用抽吸或者解剖法，从卵巢卵泡中获得卵丘-卵母细胞复合体；

步骤二，将卵丘-卵母细胞复合体置于多聚甲醛溶液中固定；

步骤三，将卵丘-卵母细胞复合体在50％酒精与无水乙醇中孵育；

步骤四，将卵丘-卵母细胞复合体在溶液(二甲苯+无水乙醇1：1)过渡后，转入二甲苯液中透明；

步骤五，将卵丘-卵母细胞复合体吸入到1.5mlEP管中，在熔蜡箱内，用软蜡与硬蜡浸入，以能覆盖全部复合体为宜；吸出注入1CM见方的包埋箱，进行包埋；

步骤六，将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，贴到载玻片上，放恒温箱中烘干；

步骤七，用二甲苯脱蜡；100％乙醇孵育；

步骤八，滴加5％二抗来源封闭血清，湿盒内室温封闭30分钟；一抗湿盒内4℃冰箱过夜孵育；二抗于暗盒室温孵育1h后，漂洗；

步骤九，封片后用荧光显微镜或者共聚焦荧光显微镜观察。

所述步骤二将卵丘-卵母细胞复合体置于4％多聚甲醛溶液中固定2小时。

所述步骤三将卵丘-卵母细胞复合体在50％酒精与无水乙醇中各孵育20分钟。

所述步骤四将卵丘-卵母细胞复合体在溶液(二甲苯+无水乙醇1：1)过渡后，转入100％二甲苯液中透明10分钟。

所述步骤五将卵丘-卵母细胞复合体吸入到1.5mlEP管中，在60℃熔蜡箱内，用软蜡与硬蜡浸入各30分钟；吸出注入1CM见方的包埋箱，进行包埋。

所述步骤六将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为5μm薄片。烫平，贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

所述步骤七用二甲苯脱蜡10分钟；100％乙醇孵育10分钟。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法制备新型COCs复合结构组织的冰冻切片制作工艺。

本发明收集了多个采自有腔卵泡的卵丘-卵母细胞复合体，经固定、水洗、脱水、透明与浸蜡等步骤处理后，灌注石蜡，进行包埋。利用石蜡能够将多个细胞复合体聚集的特点，人为构建了一种包含多个复合体的“新型COCs复合结构组织”，创造性地将传统石蜡组织切片技术用于细胞检测,简化了传统的免疫组织化学染色的技术流程；省掉了常规免疫细胞化学技术中通透步骤，对“群体COCs”进行切片后，可以将细胞膜、质与细胞核直接暴露于染液环境中；简化了繁杂的脱水程序，将传统组织切片技术中从50％-60％-70％-80％-90％酒精-无水乙醇的脱水流程，简化为50％酒精与无水乙醇两步脱水；显著缩短了检测时间，相比于传统组织检测技术，将固定时间由4天缩短至2小时等；提升了固定效果，动物组织块成分与结构复杂，与之相比，构建的复合结构组织内仅有卵丘与卵母两类细胞，结构简单，成分明确，故固定耗时少、重复性高、效果好；在构建的“人造COCs复合结构组织”，只有卵丘和卵母两种细胞，连接结构保持完整，可以清晰明确地了解该结构中的蛋白协同表达情况；有效地避免了卵巢切片技术中不易切到卵泡与卵母细胞容易丢失的问题；也可以将本发明构建的“COCs复合结构组织”用于冰冻切片制作。

附图说明

图1是本发明实施例提供的包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明以卵丘-卵母细胞复合体为基本材料，以石蜡包埋的方式，人为构建一种包含多个复合体的“新型COCs复合结构组织”，对石蜡切片化学传统技术进行改良，建立了一项能够快速简便高效的用于该复合体中蛋白质定性表达检测的新技术。

如图1所示，本发明实施例的包含多个复合体的新型COCs复合结构组织的制备方法包括以下步骤：

S101：取材：利用抽吸或者解剖法，从卵巢卵泡中获得卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；

S102：固定：将COCs置于4％多聚甲醛溶液中固定2小时；

S103：脱水：将COCs在50％酒精与无水乙醇中各孵育20分钟；

S104：透明：将COCs在溶液(二甲苯+无水乙醇1：1)过渡，转入100％二甲苯液中孵育10分钟；

S105：浸蜡包埋：将COCs吸入到1.5mlEP管中，在60℃熔蜡箱内，用软蜡与硬蜡浸入各30分钟；吸出注入1CM见方的包埋箱，进行包埋；

S106：切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为5μm薄片。贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干；

S107：脱蜡：用二甲苯脱蜡10分钟；100％乙醇孵育10分钟；

S108：封闭与抗体孵育：滴加5％二抗来源封闭血清，湿盒内室温封闭30分钟；一抗湿盒内4℃冰箱过夜孵育；二抗于暗盒室温孵育1h后，漂洗；

S109：封片观察：封片后用荧光显微镜或者共聚焦荧光显微镜观察。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。