基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法

摘要

本发明公开了一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的识别探针、试剂及检测方法。本发明通过构建一种转录因子的新型识别方式‑共区域化识别，进而激活后续级联链置换扩增，实现了对NF‑κB p50的高灵敏检测，检测灵敏度为0.2pM。本发明的检测方法还实现了实际样品中NF‑κB p50的检测。检测过程中过量的分裂识别组件无法自行杂交成双链结构，无法触发后续的级联信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性影响。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法。

背景技术

转录因子(TFs)是一类序列特异性DNA结合蛋白，在基因调控过程中发挥关键作用。它们通过识别位于基因调控区域中的一小段双链DNA序列进行基因信息的调控(DNA到RNA的表达)。TFs的正常调控对于细胞发育，细胞分化和修复等生命过程至关重要，而TFs的异常调控将会导致一系列疾病，例如，发育障碍，异常激素反应，炎症和癌症等。核因子κB(NF-κB)是一类广泛存在于各种细胞的转录因子，通常以二聚体形式存在于细胞质中，受到外界刺激时通过结合基因组中的κB位点对炎症和免疫等重要生物过程进行调控。但NF-κB的异常调控将会导致癌症、炎症等疾病。转录因子的表达水平能够敏感地反映出细胞发展过程和疾病状态，目前已经成为医学诊断和药物开发的重要标志物。因此，灵敏检测转录因子的表达水平对于理解深入基因调控机制，疾病诊断和药物开发都具有十分重要的意义。

疾病处于早期阶段时，TFs通过呈现较低的表达水平，因此，通过适当的信号扩增技术对TFs进行高灵敏检测对于疾病的早期诊断至关重要。外切酶切割辅助的荧光扩增检测法，灵敏度高，但需要利用一种或两种外切酶切割过量识别探针，切割不完全将会导致识别探针进入后续信号输出过程，引起假阳性信号。因此，亟需发展一种无需外切酶参与的高灵敏荧光检测方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法。通过构建共区域化识别这一新型识别方式，进而激活后续级联链置换扩增，实现目标物的高灵敏检测，对于临床诊断和疾病治疗方面具有较大的应用潜力。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于检测转录因子的识别探针，包括：单链DNA S1、S2和S3；

所述单链DNA S1包括：TF的分裂识别序列I、链置换辅助序列和内切酶识别位点；

所述单链DNA S2包括：TF的分裂识别序列II和与链置换辅助序列互补的序列；

所述单链DNA S3为目标物TF的识别双链中的一条链(“识别双链”是指TF的识别双链DNA，包括DNA S3以及DNA S1中的识别序列I和DNA S2中的识别序列II，DNA S3与DNA S1中的识别序列I，DNA S2中的识别序列II互补)。

所述单链DNA S1中，切刻酶识别位点的序列为：5′-GCTGAGG-3′。

所述单链DNA S1中，链置换辅助序列为：TTTT。

所述单链DNA S1中，与链置换辅助序列互补的序列为：AAAA。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种用于检测转录因子NF-κB p50的识别探针；

所述识别探针包括单链DNA S1、S2和S3；其中，

所述单链DNA S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：

S1：5’-GGG AGT TGA GTTTTT-3’(SEQ ID NO.1)；(序列中，GGG AGT TGA GTG CTG A为SDA产物的互补序列，即滚环扩增引物的互补序列；阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点；下划线区域为链置换辅助部分；粗体区域为目标物TF的识别序列)。

所述单链DNA S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体如下：

S2：5’-AAAA-3’(SEQ>

所述单链DNA S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体如下：

S3：5’--3’(SEQ ID NO.3)。

本发明的第二方面，提供一种检测转录因子的试剂，包含：

上述识别探针，以及滚环扩增引物和滚环模板；

所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：

5’-TCAGCACTCAACTCCC-3’(SEQ ID NO.4)；

所述滚环模板包括：滚环扩增引物的互补序列，切刻酶识别位点和G四倍体的互补序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述滚环模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：

5’-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3’(SEQ ID NO.5)。(序列中，阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点，斜粗体部分为滚环扩增引物互补序列；正常字体部分CCCTAACCCTAACCCTAACCCT为G四倍体的互补序列)。

进一步的，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI内切酶、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。

本发明的第三方面，提供一种检测转录因子的方法，步骤如下：

(1)向待检测样品中加入单链DNA S1、S2和S3，进行共区域化识别反应；

(2)向步骤(1)的反应体系中依次加入dNTPs、KF聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行链置换反应；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入滚环模板和T4DNA连接酶，恒温反应，然后再加入dNTPs、Phi29DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行指数滚环扩增反应；

(4)向步骤(3)反应后的溶液中加入KCl，ThT，孵育，检测荧光强度，构建净荧光强度与转录因子浓度之间的线性方程，对样品中的转录因子含量进行定量检测。

步骤(1)中，所述共区域化识别反应是在Cutsmart缓冲体系中进行的；所述Cutsmart缓冲体系的组成为：20mM Tris-HAC，50mM KAC，10mM MgAC₂，100ug/mL>

步骤(1)中，所述共区域化识别反应的条件为：37℃恒温箱中，反应3-5h，优选为4h。

步骤(2)中，所述链置换反应的条件为：37℃下反应0.5-1.0h，然后于85℃失活0.5h，结束反应。

步骤(3)中，指数滚环扩增反应的条件为：37℃下反应2-4h，然后于75℃失活0.5h，结束反应。

步骤(4)中，荧光强度检测的光谱条件为：激发波长425nm(狭缝宽度为5nm)，发射波长498nm(狭缝宽度为5nm)，电压700V，收集的荧光光谱范围为450nm-650nm。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(4)，构建的净荧光强度与转录因子(NF-κBp50)浓度之间的线性方程为：△F＝2880+230log₁₀C(C：M,R²＝0.994)。

上述线性方程的线性范围为3.8×10^-13M-1.5×10^-8M。

本发明的基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的原理为：

将转录因子的识别探针分为三部分，构建一种新型识别方式-共区域化识别，进而激活后续级联链置换扩增，实现目标物的高灵敏检测，如图1所示。目标物TF的三部分分裂识别组分均为较短的单链DNA(S1，S2，S3)。S1中包括：TF的分裂识别序列、链置换辅助部分和内切酶(Nt.BbvCI)的识别位点(5′-GCTGAGG-3′)；S2中包括：TF的分裂识别序列，以及与S1中链置换辅助部分互补的序列，与S1中链置换辅助部分互补的序列用来与S1杂交进而引发链延伸；S3为目标物TF的识别双链中的一条链。在操作温度37℃时S1，S2，S3无法自行杂交为双链，因此无法触发链置换放大(SDA)，进而无法产生引发第二步指数滚环扩增(ERCA)的引物(黑色短的单链DNA)，所以，级联扩增无法进行。当目标物TF存在时，目标物的亲和诱导作用使三部分分裂识别组分相互靠近，杂交形成双链结构，然后在聚合酶(Klenowfragment)和内切酶(Nt.BbvCI)的作用下发生聚合、延伸、切割介导的链置换放大(SDA)，产生大量单链DNA，单链DNA作为引物，在T4连接酶(T4DNA ligase)作用下与滚环模板杂交，然后在Phi29聚合酶(Phi29DNA polymerase)以及内切酶(Nt.BbvCI)的作用下进行聚合-延伸-切割-连接-聚合介导的循环放大(ERCA)。

其中，滚环模板的设计尤为重要，它包括三部分：引物的互补序列，Nt.BbvCI的识别位点和G四倍体的互补序列。经过两步级联扩增，产生大量的G四倍体，插入硫磺素T(ThT)获得荧光信号，利用荧光强度的变化实现了目标物转录因子的高灵敏检测(在本发明的一个具体实施方式中，对于NF-κB p50检测的灵敏度为0.25pM)。检测过程中的过量的分裂识别组分无法自行杂交引发后续的信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。此外，本发明的检测策略还能用于实际样品中的转录因子的检测，为临床诊断和药物开发提供了一种具有潜力的研究工具。

本发明的有益效果：

本发明的用于检测转录因子的检测试剂和检测方法是基于共区域化识别激活的级联信号放大策略进行设计的，能够用于转录因子的高灵敏检测。本发明的检测试剂及检测方法消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号，同时实现了对核转录因子的高灵敏检测，灵敏度可达0.25pM。可用于实际样品中的转录因子的检测，为临床诊断和药物开发提供了一种具有潜力的研究工具。

附图说明

图1：基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的原理图。

图2：共区域化识别激活的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测的可行性研究。

图3：荧光强度与目标物NF-кB p50浓度的线性关系。

图4：共区域化识别激活的级联信号放大用于转录因子的高灵敏检测的特异性考察；图中，1-人凝血酶，2-人免疫球蛋白G，3-BSA，4-NF-κB p50，5-混合样品，误差棒为三次重复测定的标准偏差。

图5：冬凌草素的抑制效应考察。

图6：共区域化识别激活的级联信号放大用于实际样品的检测；图中，a：Hela细胞核提取液，b：Hela细胞核提取液与冬凌草素的混合物，c：Hela细胞裂解缓冲液。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实验试剂和仪器：

本发明实施例中所用到的实验试剂和仪器如下：

荧光分光光度计(F-7000，Hitachi，日本)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070A，上海精宏实验设备有限公司，上海)，高速微量离心机(Pico 17，美国)，电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)，干式恒温器(K30，杭州奥盛仪器有限公司，杭州)，超声波清洗机(Branson-200型，中美合资必能信超有限公司，上海)，涡旋震荡器(H-101型，上海康禾光电仪器有限公司，上海)，酸度计(pHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司，上海)。

重组NF-κB p50由Cayman Chemical(Ann Arbor,MI,USA)提供，肿瘤坏死因子(TNF-α)激活的海拉细胞核提取物购于Active Motif(Carlsbad,CA,USA)，人凝血酶、人免疫球蛋白G、牛血清白蛋白(BSA)均购于Sigma-Aldrich Co.(St Louis,MO,USA)，KF聚合酶(Klenow fragment)、内切酶(Nt.BbvCI)、T4连接酶(T4DNA ligase)以及Phi29聚合酶(Phi29DNA polymerase)均购于New England Biolabs(Ipswich,MA)，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)购于上海生物工程有限公司，冬凌草素购于广润生物科技有限公司(南京，中国)。荧光染料硫磺素T(ThT)购于Abcam(剑桥，英国)。其它试剂均来自上海国药集团化学试剂有限公司。

缓冲溶液Cutsmart：20mM Tris-HAC，50mM KAC，10mM MgAC₂，100ug/mL>

T4连接反应缓冲溶液，T4连接buffer：50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM>

裂解缓冲溶液(Lysis Buffer)：20mM Hepes(pH 7.5)，350mM NaCl，20％glycerol,1mM MgCl2,0.5mM EDTA and 0.1mM EGTA,5mM DTT.

实验中所用溶液均采用高纯水(>18.25MΩ)配制。

实验中所用核酸链均委托上海生物工程有限公司合成和纯化。本发明实施例中所用到的核酸链具体见表1。

表1：

表中S1中的GGG AGT TGA GTG CTG A为滚环扩增引物的互补序列，阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点，下划线区域为链置换辅助部分，粗体区域为目标物TF的识别序列，斜粗体部分为滚环扩增引物互补序列，环状模板中CCCTAACCCTAACCCTAACCCT为G四倍体的互补序列。

实施例1：基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子(NF-κB p50)

具体方法如下：

(1)共区域化识别

在10μL的反应体系中包含1μL Cutsmart，40nM S1、S2、S3，不同浓度的NF-κB p50或实际样品，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应4h。

(2)链置换扩增(SDA)

在20μL的反应体系中包含10μL共区域化识别产物，2μL Cutsmart，1.5mM dNTPs，1U Klenow fragment，2U Nt.BbvCI，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应0.5h，然后，85℃失活0.5h。

(3)指数滚环扩增(ERCA)

ERCA包括连接反应和扩增反应。连接反应在30μL的反应体系中进行，包含20μL的SDA产物，3μL T4连接buffer，1μM滚环模板,120U T4连接酶,轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应1h，然后，扩增反应在40μL的反应体系中进行，包含30μL的连接反应产物，2μLCutsmart，1.5mM dNTPs，3U Phi29DNA polymerase，3U Nt.BbvCI,轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应3h，然后，75℃失活0.5h。

(4)荧光光谱的测量

向反应体系中加入KCl，ThT，反应体系总体积为50μL，轻微振荡后置于37℃恒温箱，反应0.5h后测定荧光强度。荧光强度测定是通过F-7000荧光分光光度计(日本Hitachi)上进行。参数设置如下：激发波长425nm(狭缝宽度为5nm)，发射波长498nm(狭缝宽度为5nm)，电压700V，收集的荧光光谱范围为450nm-650nm。

构建净荧光强度与转录因子浓度之间的线性方程，为：△F＝2880+230log₁₀C(C：M,R²＝0.994)。对待测样品，可通过测定样品的净荧光强度，代入线性方程，计算待测样品的转录因子浓度。

实施例2：本发明的检测方法的可行性研究

为了验证本发明的检测方法的可行性，本发明通过测定对比不同条件下的荧光强度来考察本发明的检测方法的可行性，如图2所示。可以看出，染料ThT(a)和阴性(b，与a接近重合)均显示微弱的荧光，说明不存在目标物NF-κB p50时，三个分裂识别组件无法自行杂交成双链结构，引发后续级联信号放大；当目标物NF-κB p50存在时，荧光强度急剧增大(c)，说明目标物的亲和诱导使分裂识别组件相互靠近，进而杂交为双链结构，引发后续级联信号放大过程。此检测方法避免了外切酶的参与，反应中的过量的分裂识别组分无法自行杂交引发后续的信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性信号。

实施例3：本发明的检测方法的灵敏度考察

通过测定目标物不同浓度对应的荧光强度，可以确定本方法的线性范围和灵敏度。如图3所示。可以看出，目标物浓度在3.8×10^-13M-1.5×10^-8M范围内时，ΔF与目标物浓度的对数呈线性关系(R²＝0.994)，经估算本检测方法的LOD为2.5×10^-13M，优于大多数文献报道的灵敏度。

实施例4：本发明的检测方法的特异性考察

特异性是评价检测方法的重要指标，为了验证该检测策略对转录因子的的特异性，我们考察了干扰蛋白质的非特异性结合情况，如图4所示。当检测体系中仅有人凝血酶或人免疫球蛋白G或BSA时，荧光强度远远小于体系中存在目标物NF-κB p50时的荧光强度。然而，当体系中存在混合样品时，可以获得与仅有NF-κB p50时相当的荧光响应，这表明本发明提出的新型检测策略具有良好的特异性。

实施例5：本发明的检测方法的精密度和重现性考察

精密度和重现性是衡量分析方法实际应用的重要参数，我们考察了日内精密度和日间精密度。通过选择三个浓度计算其相对标准偏差(RSD)(n＝3)。结果表明，一次实验中，在15nM、0.1nM和1pM三个不同浓度下的RSD分别为4.6％、4.1％和3.9％。在同样三个浓度下，连续三次实验之间的RSD分别为4.9％、4.5％和4.2％，说明该检测策略具有良好的精密度和重现性。

实施例6：抑制效应考察

冬凌草素(oridonin)是已知的TF的小分子抑制剂，可以抑制NF-κB的双链DNA结合活性。为了评估本检测策略在筛选NF-κB抑制剂方面的应用潜力，我们选择冬凌草素进行分析，如图5所示。可以看出，在冬凌草素存在时，反应体系的体系的荧光强度显著降低(与不存在时相比)，表明本策略可以用于转录因子抑制剂的筛选。

实施例7：实际样品测定

NF-κB p50最初存在于细胞质中，并结合在抑制蛋白IκB上，不具有活性。受到刺激(例如细胞因子，细菌和病毒)后，NF-κB p50将会被激活，从IκB上释放，进入细胞核。因此，为了进一步证实本发明提出的检测方法的实际应用价值，我们测定了肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的HeLa细胞核提取物中的NF-κB p50的活性。如图6所示。可以看出，裂解缓冲溶液仅能引起非常低的荧光信号(曲线a)，而含有HeLa细胞核提取物的体系(曲线c)则显示了明显的荧光增强。为了证实荧光增强是由NF-κB p50引起的而不是由其它组分引起的，抑制剂冬凌草素被加入到检测体系中，结果未显示出明显的荧光增强(曲线b)。以上结果充分说明本文提出的TF的高灵敏检测策略能够用于实际生物样品的检测。