一种鉴定固始鸡的特异性分子标记

摘要

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种鉴定固始鸡的特异性分子标记。所述鉴定固始鸡的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.4所示，其引物序列如SEQ ID NO.2和3所示。用SEQ ID NO.2和3的引物扩增待鉴定样本DNA，根据扩增产物的长度可判定待鉴定样本是否为固始鸡。本发明应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及动物育种学、分子遗传学和分子生物学领域。具体涉及一种鉴定固始鸡的特异性分子标记。

背景技术

长期以来，主要是以常规形态学标记分析手段进行动物品种分类和真伪鉴定。形态学标记分析简便、经济，但由于形态学特征常常受环境因素的影响，具有表型可塑性和遗传可变性，容易导致不正确的分类与鉴定；并且形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，应用分子生物学技术将有利于品种鉴定。形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。

本专利利用高通量测序手段对不同鸡种进行测序，通过对不同鸡种间的DNA序列进行筛查比对，找到在不同鸡种间出现的特异性序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩增和重测序验证，以期通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以对不同鸡种进行更精确的分类。

发明内容

本发明的目的是发现一种鉴定固始鸡特异性的分子标记。

本发明通过目标区域捕获测序筛查不同鸡种的16号染色体，并利用MEGA软件进行序列比对，根据比对结果利用Oligo等软件设计引物，对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序，根据分析结果可以得到鉴定固始鸡特异性的分子标记。

本发明所述的鉴定固始鸡的特异性分子标记，是固始鸡与其他鸡种存在差异的一段序列(chr16:86,504-86,792，登录号为:XM_015294989.1共289bp，如SEQ ID NO.1所示)，固始鸡在这段序列上存在特异性的16bp的碱基缺失(缺失SEQ ID NO.1的198-213bp，GGGAGTGGGGGGGAGG)，其他鸡种无此特点。所以，本发明所述鉴定固始鸡的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO.4所示，共273bp。

所述分子标记的引物序列为:

F:AGATCCTCGCAGCCAAAGGGT(SEQ ID NO.2)

R:CAGTGTCCCCAACGCGCAGT(SEQ ID NO.3)

本发明还公开了一种鉴定固始鸡的方法，是利用上述引物，以待测样本的DNA为模板进行PCR扩增，根据扩增产物的长度判定待鉴定样本是否为固始鸡。进行测序验证，如果序列中存在16bp的碱基缺失，则为固始鸡。其余鸡种则无此特点。由于4％的琼脂糖凝胶电泳，可以看出固始鸡的电泳条带位于其它鸡种条带的下方，但由于分离效果不够准确，还需进行测序验证。以测序结果中存在16bp的碱基缺失为判定标准。

应用这种分子标记鉴定鸡种，操作相对简单，特异性高而且重复性高，也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。

附图说明

图1：固始鸡与其他鸡种序列比对示意图。

图2：固始鸡与其他鸡种琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例：

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、斗鸡×罗斯杂交1代、太湖鸡、溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡(SPF)、仙居鸡、白耳鸡,共27种不同鸡种，其中仙居鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、白耳鸡、藏鸡、固始鸡、大骨鸡、斗鸡、黑狼山鸡、乌骨鸡、萧山鸡、油鸡12个地方鸡品种均来自中国农业科学研究院家禽科学研究所国家地方禽种资源基因库，红色原鸡采自云南省野生动物救护中心。另外14个鸡品种来自本实验室(扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室)禽种资源基因库，在下列文献中有记载：郭晓敏,刘向萍,常国斌,等.鸡NLRC5基因启动子多态性分析[J]，中国兽医学报,2015,35(11):1845-1849；毕瑜林,王洪志,徐璐,等.不同鸡品种NFKB 1基因SNPs筛选与进化分析[J],扬州大学学报,2016,37(1):35-40。

1.2 目标捕获测序

对每个鸡品种采集10个样本，翅静脉采血0.4ml，肝素钠抗凝，加入裂解液后4℃保存备用。利用苯酚抽提法提取DNA,送入华大基因公司(BGI)进行目标捕获测序，选取Gallus_gallus-4.0作为参考基因组。对目标捕获测序得出的初始数据，首先去除reads中的接头污染，然后将reads中超过50％的低质量碱基去除(quality value≤5(E))，确保分析数据的高质量性。

1.3 序列比对

目标捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列，利用软件MEGA5.1对不同鸡种间进行序列比对，发现不同鸡种在序列上的差异情况。

1.4 引物设计

根据序列比对结果，选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列(chr16:86,504-86,792，共289bp)。利用不同鸡种DNA作为模板，利用Oligo等软件设计引物进行PCR扩增，引物序列为：

1.5 PCR扩增和检测

PCR扩增总体积为20μL：1μL DNA模板(100ng/μL)，2μL 10×PCR Buffer，1.5μL dNTP(10m mol/L)，上下游引物各1μL(10p mol/μL)，Taq酶为0.2μL(5U/μL)，ddH₂O>

2 结果

通过目标捕获测序，发现了固始鸡与其他鸡种存在差异的一段序列，设计引物PCR扩增并进行重测序验证。发现固始鸡与其他鸡种在这段序列上存在特异性差异，差异在于在这段序列上固始鸡存在特异性的16bp的碱基缺失(GGGAGTGGGGGGGAGG)，其他鸡种无此特点(见附图1)。通过琼脂糖凝胶电泳也可清晰的鉴别出来(见附图2A,B)。因此，这段序列可以作为一种鉴定固始鸡特异性的分子标记。