一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的方法

摘要

本发明提供一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的方法，采用形态标记分析与SSR标记分析相结合：对野生大豆不同生活力群体及其后代群体单株进行形态性状调查，计算出形态多样性指数，并进行显著性差异分析；利用20对SSR核心引物组对各群体单株的DNA进行扩增检测，计算出不同生活力群体及其后代群体与对照群体之间的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并进行显著性差异分析。所述形态标记分析与SSR标记分析在同一群体同一单株上进行。本发明为全面、准确、高效地分析评价野生大豆在贮存及繁殖更新过程中遗传完整性变化提供标准并提出适合的更新发芽率阈值。

说明书

技术领域

本发明属于作物种质资源学领域，涉及一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的方法。

背景技术

野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)是栽培大豆的直接祖先。野生大豆具有蛋白含量高、抗逆性强、繁殖系数大等优良特性，是栽培大豆性状改良及品种选育的重要基因来源，也是研究大豆起源、进化、分类的宝贵资源。目前，低温种质库是野生大豆种质资源保存的主要途径。我国是世界保存野生大豆种质资源数量最多的国家，约7000余份，这些材料是我国大豆遗传研究和作物育种的宝贵财富。然而，野生大豆种子在低温种质库中保存并非一劳永逸，随着保存时间的延长，其生活力会不断的下降。当种质库中的种子发芽率降到一定程度，或由于生活力监测及对外供种的消耗使得贮藏样品的数量减少时，需要对库存野生大豆进行繁殖更新。野生大豆种子在保存期间和繁殖更新后不可避免受到种子老化及繁殖世代等因素地影响而发生遗传完整性变化。

遗传完整性(genetic integrity)广义上指种质原始遗传组成状态，即在繁殖保存过程中要使其群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及各位点等位基因频率分布和其原始群体一致。种质遗传完整性变化有两方面含义：一是指种质贮藏过程中的遗传变化，如染色体畸变，DNA突变等遗传变化，以及所产生的遗传效应；二是指种质繁殖后，其子代种质群体的遗传组成与亲代种质群体相比较发生了变化。因此，维持种质遗传完整性就是在种质贮藏过程中要保持其最低程度的遗传改变(genetic alteration)，在繁种过程中要保持子代与亲代具有最大的遗传相似性。

目前，种质资源遗传完整性检测方法有形态标记、细胞标记、蛋白标记和DNA分子标记等。形态标记分析简单直观，仍然是不可或缺的研究方法。SSR分子标记为共显性标记，具有较高的多态性，是研究种质资源遗传完整性变化较为理想的方法。然而现有分析种质资源完整性SSR标记所需引物组数量较大，通常为60对，工作量很大，效率不够高，且只用SSR标记分析不够全面，鉴于实际情况制定出一套科学合理的、更加高效的野生大豆种质遗传完整性分析方法以及更新发芽率阈值已是野生大豆种质资源保存研究的当务之急。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的方法。此方法对野生大豆种质资源在保存及繁殖更新过程中其遗传完整性变化规律进行了探究，并根据此规律制定更加科学合理的种质资源繁殖更新发芽率阈值。

为此，本发明所采用的技术方案是：一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的方法，采用形态标记分析与SSR标记分析相结合，对野生大豆不同生活力群体及其后代群体单株进行农艺性状调查，计算出形态多样性指数，并进行显著性差异分析；利用SSR核心引物组对各群体单株的DNA进行扩增检测，计算出不同生活力群体及其后代群体与对照群体之间的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并进行显著性差异分析；所述形态标记分析与SSR标记分析在同一群体同一单株上进行。所述SSR核心引物组由20个引物对组成：序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示。

本发明具体内容如下：

1、不同生活力群体的获得

采用人工倒序老化法：选取播种、田间管理、收获及成熟度一致的野生大豆种子，破除硬实后放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件为45％RH，26℃，30天，使处理种子的含水量处于7.5％±0.1％；然后用铝箔袋真空密封分装，放置于人工老化箱内40℃恒温老化；放置顺序采用倒序法，即人工老化时间最长的处理先放入进行老化，人工老化时间最短的最后放入进行老化，试验结束时一起取出；人工老化结束后在25℃下，将所有处理密封平衡2天。

2、形态标记分析

从不同生活力群体及其子代群体中选出30个单株，每个单株分别调查形态性状，形态性状多样性的计算采用Shannon-Weaver指数，将各群体的Shannon-Weaver指数与对照群体进行显著性t检验。若差异不显著则认为种质遗传完整性得到有效保持，若差异达到显著或极显著水平，则认为种质遗传完整性发生了改变。

3、SSR标记分析

具体步骤是：

(1)采用SDS法从野生大豆不同生活力群体及其子代群体的每个群体中单株提取叶片基因组DNA，样本量为96株，所述96个单株中包括形态性状调查的30株；

(2)以每个单株的基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1-SEQ ID No.40所示20对SSR核心引物进行PCR扩增；

(3)采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，电泳结束后银染法检测；

(4)统计扩增谱带类型，每个引物视为1个位点，每条带视为1个等位变异。参照DL1000DNA Marker估计片段大小。利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等软件对野生大豆不同生活力群体及其子代群体进行遗传结构分析，计算出各个群体的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并利用SAS 9.1对各处理群体与对照群体之间的各位点等位基因频率进行χ²检验，对每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数进行显著性t检验，如果差异不显著则认为种质遗传完整性得到有效保持，如果差异达到显著或极显著水平，则认为种质遗传完整性发生了改变。

上述SSR引物对存在的前提下，任何含有该引物对的产品均在本发明的保护范围内，例如含有上述引物对的试剂或试剂盒。原因在于，其在应用时利用的是本发明所述引物对的特殊性，且得到的结果取决于本发明所述引物对的特殊性。因此，本发明还涉及一种用于分析野生大豆种质遗传完整性的试剂或试剂盒，其包括所述20对SSR引物对。

本发明具有如下有益效果：

1、采用形态标记分析与SSR标记分析相结合的方法，且形态标记分析单株与SSR标记分析单株是一一对应的关系，即每个群体内进行农艺性状调查的单株同时也是进行SSR核心引物扩增的单株，此方法保证了实验数据的准确性和可靠性，可以更科学合理地得出野生大豆繁殖更新发芽率阈值。

2、每个群体进行SSR分析的样本量为96株，解决了由于样本量过小，造成群体内稀有等位基因的频率过低，系统误差过大的问题，同时满足了在进行SSR标记分析时，与实验耗材PCR板孔数一致，方便进行PCR扩增试验的要求。选取野生大豆繁殖更新时的幼嫩叶片为材料提取基因组DNA，首先明确了所提取DNA的单株是有生命力的个体，而不是生活力未知的种子，只有生命力的个体才能繁殖后代，对于遗传完整性分析才有意义；其次幼嫩叶片中的多酚、多糖和蛋白质等含量较少，易于获取高质量的DNA。该措施提高了试验大的准确性和可靠性。

3、采用人工倒序老化的方法来获取不同生活力群体，即人工老化时间最长的处理先进行老化，人工老化时间最短的最后进行老化，试验结束时一起取出，其优点是可以避免系统误差，从而保证所得实验结果的准确性和可靠性。

4、本发明针对野生大豆基因组特点筛选出20对SSR核心引物，与常规的野生大豆SSR分子标记分析60对引物相比，减少了所用引物对数量，从而可以节省大量的工作，提高试验效率。同时还保证了试验的准确性。

附图说明

图1为引物Satt307扩增群体g_p-ck的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图2为引物Satt307扩增群体g_p-i的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图3为引物Satt307扩增群体g_p-ii的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图4为引物Satt307扩增群体g_p-iii的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图5为引物Satt307扩增群体g_f1-ck的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图6为引物Satt307扩增群体g_f1-i的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图7为引物Satt307扩增群体g_f1-ii的聚丙烯酰胺电泳图谱。

图8为引物Satt307扩增群体g_f1-iii的聚丙烯酰胺电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一野生大豆不同生活力群体的获得

1、试验材料：以崂山野生大豆种子为试验材料。

2、试验方法：

(1)以播种、田间管理、收获及成熟度一致的崂山野生大豆种子为试验材料，至少5000粒种子。

(2)破除崂山野生大豆硬实，方法是用布袋包裹野生大豆种子，放入液氮中浸泡4分钟，然后将种子取出来在室温25℃下使其自然升温。

(3)将崂山野生大豆放入人工气候箱中进行种子含水量平衡，平衡条件是相对湿度为45％，温度为26℃，时间为30天，使处理种子的含水量处于7.5％±0.1％，若种子含水量达不到此标准，相同条件下继续平衡。

(4)种子含水量平衡达到要求后，用铝箔袋真空密封包装，平均分成若干份，每份约500粒种子。

(5)每隔2周进行一个处理的人工老化试验，将铝箔袋放置于人工老化箱内恒温老化，温度为40℃。采用倒序法进行，即人工老化时间最长的处理先进行老化，人工老化时间最短的最后进行老化，试验结束时一起取出，避免系统误差，以未经过老化的处理作为对照。人工老化时间视作物品种及所需的发芽率梯度而定。

(6)人工老化结束后在25℃下，将所有处理密封平衡2天，获得的野生大豆不同生活力的处理群体。

实施例二采用形态标记对野生大豆进行遗传完整性分析

1、分析样本

实施例一获得的野生大豆不同生活力的处理群体，参考GB/T3543.4农作物种子检验规程中的标准条件，进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等指标(表1)。将不同生活力亲代群体的野生大豆进行田间繁殖更新，每个群体定植100株，并进行单株编号，得到其子代群体。繁殖更新期间对亲代每个群体的30个单株进行11个形态标记性状的调查。

不同生活力的亲代群体收获后，进行单株脱粒后得到子代群体种子，对子代群体的每个群体的30个单株也进行编号，编号与其亲代是一一对应关系。对子代群体进行发芽试验，并统计发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等指标(表1)。将各子代群体进行田间繁殖更新，每个群体定植100株，单株编号，与其亲代群体保持一致。繁殖更新期间对各个子代群体的30个单株进行11个形态标记性状的调查，调查的单株与其亲代是一一对应关系。

表1崂山野生大豆发芽数据统计

2、Shannon-Weaver指数t检验分析

本发明所统计形态性状标记共11个，包括：花色、粒色、粒形、脐色、茸毛色、荚色、结荚习性、株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数。从不同生活力群体及其子代群体中选出30个单株，每个单株分别调查这11个形态性状。形态性状多样性的计算采用Shannon-Weaver信息指数，即H’＝-∑PilnPi，Pi为某性状第i个代码值出现的概率。质量性状如花色、粒色和粒形等予以赋值(表2)。将数量性状如株高、单株粒数、单株荚数和每荚粒数进行10级分类，1级<X-2δ，10级≥X+2δ，中间每级间差0.5δ，X为平均值，δ为标准差。11个形态性状数据按不同的变异类型分别转换成AA、BB和CC等字母格式，利用生物统计软件Popgene等计算不同形态性状变异的Shannon-Weaver指数。然后利用SAS V9.1将各群体的Shannon-Weaver指数与对照群体进行显著性t检验(表3)。

表2崂山野生大豆形态性状鉴定项目及标准

表3崂山野生大豆Shannon-Weaver指数t检验

注：^*表示5％水平上显著差异；^**表示1％水平上显著差异

结果显示，亲代群体中发芽率为79.0％的群体g_p-i，其Shannon-Weaver指数与对照群体g_p-ck相比差异不显著，发芽率58.0％的群体g_p-ii，其Shannon-Weaver指数与对照群体相比差异显著，发芽率为27.0％的群体g_p-iii，其Shannon-Weaver指数与对照群体相比差异极显著。这表明，较高生活力的群体(发芽率≥79.0％)与对照群体相比，其遗传完整性得到了较好的保持，而较低生活力的群体(发芽率≤58.0％)与对照群体相比，其遗传完整性发生了显著变化。子代群体中各个群体(包括g_f1-ck、g_f1-i、g_f1-ii和g_f1-iii)的发芽率均在90.0％左右，其Shannon-Weaver指数与对照相比差异均不显著，表明高生活力的子代群体，与对照群体相比其遗传完整性得到了较好的保持。这说明形态多样性与生活力密切相关，原因是形态多样性主要是数量性状造成的，而质量形状的差异很小，高生活力子代群体的数量性状与对照群体的差异较小，而低生活力子代群体的数量性状与对照群体的差异较大。

实施例三采用SSR分子标记对野生大豆进行遗传完整性分析

1、分析样本

同实施例二的分析样本，不同生活力亲代群体及其子代群体在田间繁殖更新期间，取96个单株(包括实施例二中的30个单株)，采集幼嫩叶片，-80℃下保存备用。子代采集叶片的单株与其亲代也是一一对应关系。

2、基因组DNA提取

采用SDS法单株提取上述亲代及子代各个群体的基因组DNA。提取步骤为：

(1)将野生大豆幼嫩叶片用镊子放入2.0mL离心管中，每管加入一粒直径5mm的钢珠后，进行下一步操作或-80℃备用；

(2)将离心管迅速放入液氮中冷却，装入组织研磨仪中将叶片打碎，时间为30s，频率为50Hz，注意动作要迅速，之后取出离心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65℃水浴中预热，抑制DNA酶，加速蛋白质变性，促进DNA溶解，然后向离心管中加入10μL的巯基乙醇，抑制酚氧化为醌，充分混匀，也可剧烈震荡；

(3)将离心管放入65℃水浴中保温1小时，水浴过程中每10分钟摇动一次；

(4)待样品冷却至室温后，加入1/5体积的5MKAc，冰水混合物中放置30分钟；

(5)12000g离心10分钟后，吸取1000μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，在每管中加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，体积比为25：24：1，充分振动15分钟后，12000g离心15分钟；

(6)吸取800μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，加入10μLRNA酶(10mg/μL)溶液，37℃水浴1小时或-4℃过夜；

(7)每管中加入800μL的氯仿/异戊醇溶液，体积比为24：1，充分振动15分钟后，12000g离心15分钟；

(8)吸取600μL上清液加入到另一2.0mL离心管中，每管加入0.6～1.0体积的异丙醇，轻

轻混匀后置于-20℃下30分钟，12000g离心10分钟，收集沉淀；

(9)加入1mL75％乙醇冲洗2次后，再用1mL无水乙醇冲洗1次，置于真空离心机中，将DNA吹干至无酒精味，加入100μL1×TE溶解；

(10)样品在4℃备用，多余样品置于-20℃下长期保存。

3、20对SSR核心引物的筛选

以崂山野生大豆对照群体的96个单株基因组DNA为模板，分别用236对SSR引物进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、银染显色及统计结果分析。根据每对引物在96个单株中的扩增结果，剔除不具备多态性或多态性较低的引物，保留具有较高多态性的引物，最终筛选获得20对高多态性核心引物(表4)，保证野生大豆每个遗传连锁群上有1对引物。

表4崂山野生大豆遗传完整性分析SSR核心引物

4、SSR引物扩增及聚丙烯酰氨凝胶检测

采用表4的20对SSR核心引物，对不同生活力的亲代群体及其子代群体基因组DNA进行PCR扩增，采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，功率75W，时间为50min，电泳结束后银染法检测。

(1)PCR扩增反应体系为：Premix Taq^TM(TaKaRaTaq^TM>2O3.0μL，总体系为20.0μL。

(2)PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；95℃变性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。温度降至4℃时取出，4℃冰箱内保存备用。

(3)银染法检测步骤为：

①固定：电泳后将平板放入固定液(10％的乙醇和0.5％的冰醋酸)中，轻轻摇动12分钟至指示剂无色；

②银染：将平板放入银染液(0.2％AgNO₃)中，轻轻摇动12分钟；

③水洗：从银染液中取出平板，用去离子水洗涤10秒；

④显影：将水洗后的平板放入显影液(1.5％NaOH和0.4％甲醛)中，轻轻摇动，显色至所要的程度；

⑤终止显影：将平板放入10％的冰醋酸中，轻摇1～2分钟；

⑥冲洗：将平板放入去离子水中，冲洗1分钟；

⑦干燥：将冲洗好的平板置于室温下自然干燥。

结果如附图1-8所示：附图1-8为用引物Satt307扩增群体g_p-ck、g_p-i、g_p-ii、g_p-iii、g_f1-ck、g_f1-i、g_f1-ii、g_f1-iii的聚丙烯酰胺电泳图谱。

5、结果统计及分析：根据检测结果，利用POPGENE version 1.31和PowermarkerV3.25等软件对崂山野生大豆亲代及子代各个群体进行遗传结构分析，计算出各个群体的各位点等位基因频率、每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数，并利用SAS 9.1对各处理群体与对照群体之间的各位点等位基因频率进行χ²检验，对每位点等位基因数、遗传多样性指数和香农指数进行显著性t检验。

(1)等位基因频率差异分析

表5崂山野生大豆群体间等位基因频率差异分析

从表5可以看出，亲代群体中群体g_p-i、g_p-ii和g_p-iii与对照群体的g_p-ck等位基因频率显著差异和极显著差异的位点个数以及占总位点个数百分比，随着生活力的下降而增加，其中发芽率为27.0％的群体g_p-iii的显著和极显著差异位点个数最多，分别为5个和3个，占总位点的个数的百分比分别为25.00％和7.50％，发芽率为58.0％的群体g_p-ii次之，分别为3和2个，占总位点的个数的百分比分别为15.00％和10.00％，发芽率为79.0％的群体g_p-i最少，分别为1个和0个，占总位点的个数的百分比分别为5.00％和0，这表明生活力下降显著地影响了野生大豆种质材料群体内的等位基因频率分布。由群体g_p-ck繁殖的群体g_f1-ck与对照群体g_p-ck相比，无显著差异位点，由群体g_p-i繁殖的群体g_f1-i与对照群体g_p-ck相比，显著或极显著差异的位点个数与群体g_p-i持平，同为为1个和0个，占总位点的个数的百分比分别为5.00％和0，这表明发芽率为91.0％和79.0％的崂山野生大豆经过繁殖更新后，各位点的等位基因频率与对照群体相比几乎没有差异。由群体g_p-ii和g_p-iii繁殖的群体g_f1-ii和g_f1-iii，这2个群体与对照群体g_p-ck显著或极显著差异的位点个数较多，分别为4个和2个，6个和4个，占总位点的个数的百分比分别为20.00％和10.00％，30.00％和20.00％，且子代群体比相应亲代群体的显著或极显著差异位点数要高，表明发芽率为58.0％和27.0％的野生大豆种质材料的子代群体各位点的等位基因频率与对照群体相比差异显著，且生活力水平愈低差异愈大。以上结果表明，生活力下降对野生大豆种质材料的等位基因频率分布影响甚大。

(2)群体遗传结构分析

表6崂山野生大豆群体遗传结构

注：^*表示5％水平上显著差异；^**表示1％水平上显著差异

从表6中可以看出，亲代群体中g_p-i、g_p-ii、g_p-iii及其子代群体g_f1-i、g_f1-ii和g_f1-iii，其各项遗传多样性参数均低于对照群体g_p-ck，而且随老化时间的延长，生活力水平愈低，其各项遗传多样性参数也愈低。t检验结果显示，由对照群体g_p-ck繁殖的群体g_f1-ck，其各项遗传多样性参数与对照群体g_p-ck相比几乎没有差异，表明发芽率为91.0％的群体经过繁殖更新后，其群体的遗传结构得到了较好的保持。群体g_p-i的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照群体相比无显著差异，而其子代群体g_f1-i的各项遗传多样性参数与对照群体相比虽有所下降但没有达到显著差异水平。群体g_p-ii和g_p-iii的A、H和I等3项遗传多样性参数与对照群体g_p-ck相比差异显著或极显著。群体g_p-ii和g_p-iii的子代群体g_f1-ii和g_f1-iii的A、H和I等3个遗传多样性参数与对照群体相比差异极显著，表明发芽率分别为58.0％和27.0％的群体因生活力水平下降，其自身及子代群体内的遗传多样性低于对照群体遗传多样性。以上结果表明，生活力下降对野生大豆种质材料的群体遗传结构影响显著。

通过崂山野生大豆遗传完整性分析的实验结果可得出以下结论：高生活力的野生大豆(发芽率≥79.0％)及其子代在形态性状水平及DNA分子水平上，其遗传完整性都得到了较好的保持；而低生活力的野生大豆(发芽率≤58.0％)在形态水平上遗传完整性显著变化，但其子代在形态水平上有所恢复，低生活力的野生大豆(发芽率≤58.0％)亲代及其子代在DNA分子水平上的遗传完整性明显改变。因此，野生大豆的优选繁殖更新发芽率阈值为不低于79.0％，最低不得低于58.0％。

实施例四用于野生大豆遗传完整性分析的试剂或试剂盒

所述试剂和试剂盒含有实施例三所述的引物组合。

所述试剂盒还可包括本领域其他常规组分。

本发明综合采用形态标记与SSR分子标记相结合的方法，且形态标记分析单株与SSR标记分析单株是一一对应的关系，即每个群体内进行形态性状调查的单株同时也是进行SSR核心引物扩增的单株，此方法保证了实验数据的准确性和可靠性。本发明提供的方法可以准确地获得野生大豆保存过程中以及繁殖更新后遗传完整性发生变化的实际情况，从而得出更精准的野生大豆繁殖更新的发芽率阈值。