一种鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记及其引物和应用

摘要

本发明涉及一种鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记，其核苷酸序列为：GAATTAAATATTTTGAAATAATAGTGAAAGATTAAATTGGAAAAAAAAAAGTTTCAAAAATCTAAAACAT，其引物序列：InDel1_rp6F：TCAAATGATGCTTTTCTTTT；InDel1_rp6R：TTAACAACCGTTGATGTGAA。本发明制备到与西瓜果皮覆纹特征紧密连锁的InDel分子标记，并设计了其引物，在西瓜果皮覆纹特征育种中进行了应用，可为鉴定西瓜果皮覆纹特征提供新手段，加速西瓜果皮覆纹特征性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

西瓜的果实性状，如果皮覆纹特征、果形、皮色、肉色等均会影响到消费者对西瓜品种的接受程度，因此都是育种家新品种选育的主要目标。现有的研究主要集中在果形、肉色等果实性状上，而有关西瓜果皮覆纹特征的研究较少。肖光辉（2012）综述了果皮花纹相关的基因，斑驳果皮基因m产生具有绿白色斑点的中-深绿色果皮(Weetman., 1937)，基因p控制本色果皮上很窄的线条，研究还发现了间歇性条纹基因ins（Gusmini et al., 2006）。但这些遗传分析只能将控制质量/数量性状的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个质量/数量性状基因在染色体上的位置及效应(徐云碧，1992)。随着西瓜全基因组测序的完成（Luo et al., 2013），Gama等（2014）发现了两个与西瓜果皮覆纹特征（clearly defined or diffuse）连锁的SSR标记，均位于6号染色体上，然而，有限的标记限制了该基因位点进一步的挖掘。

此外，西瓜果皮覆纹特征变异丰富，却没有统一的描述标准，不同的研究很难进行比较。马双武（2005）主编的《西瓜种质资源描述规范和数据标准》将果皮覆纹形状分为五类：网条、齿条、条带、放射条和斑点。

发明内容

针对以上问题，本发明通过QTL初定位在6号连锁群定位到了果皮覆纹特征的主效QTL（数量性状位点），并结合亲本重测序制备到与西瓜果皮覆纹特征紧密连锁的InDel分子标记，并设计了其引物，在西瓜果皮覆纹特征育种中进行了应用，可为鉴定西瓜果皮覆纹特征提供新手段，加速西瓜果皮覆纹特征性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

设计一种鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记，其核苷酸序列为：GAATTAAATATTTTGAAATAATAGTGAAAGATTAAATTGGAAAAAAAAAAGTTTCAAAAATCTAAAACAT。

PCR扩增上述InDel分子标记的扩增引物，包括以下的引物对：

InDel1_rp6F：TCAAATGATGCTTTTCTTTT；

InDel1_rp6R：TTAACAACCGTTGATGTGAA。

上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

（1）利用果皮覆纹特征分别为齿条和网条的母本和父本杂交的F₂群体构建高密度的遗传连锁图谱，并对父母本、F₁和F₂群体的93个单瓜进行果皮覆纹特征的表型鉴定；

（2）结合遗传连锁图谱和果皮覆纹特征表型鉴定结果，利用专门针对质量性状定位的Rqtl-IM-binary方法进行QTL初定位，在LG6鉴定到一个果皮覆纹特征的主效QTL（RP6），其LOD峰值为23.65，解释67.78%的表型变异，对应的置信区间（2-LOD）为105.9-155.7cM，对应的物理位置为6号染色体的23.8-26.8Mb；

（3）结合两个亲本的重测序，在QTL区间发现24个插入缺失片段大于40bp的InDels，共设计了22对InDel引物；

（4）利用对应的InDel引物在父母本、F₁进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定；

（5）将果皮覆纹特征表型归为一个形态学标记RP6，加上InDel分子标记的基因型鉴定结果与LG6上的其它SNP标记利用JoinMap4.0进行图谱构建，发现RP6位于主效QTL RP6>

利用上述技术措施，发明人最终获得了与西瓜果皮覆纹特征紧密连锁的插入缺失标记InDel1_rp6，其对应的西瓜参考基因组物理图谱的位置为6号染色体的26280408bp，序列为GAATTAAATATTTTGAAATAATAGTGAAAGATTAAATTGGAAAAAAAAAAGTTTCAAAAATCTAAAACAT，其特异的扩增引物序列为，

InDel1_rp6F：TCAAATGATGCTTTTCTTTT；

InDel1_rp6R：TTAACAACCGTTGATGTGAA。

利用上述InDel分子标记鉴定西瓜果皮覆纹特征的方法，包括以下步骤：

（1）引物设计：设计并筛选，得到所述扩增引物；

（2）DNA提取：利用CTAB法提取西瓜总DNA；

（3）PCR扩增：

反应体系：100ng/μl西瓜总DNA1μl、正向引物（10μmol/L）1μl、反向引物（10μmol/L）1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH₂O>

反应程序：94℃ 5分钟，35个循环的94℃ 20秒钟、55℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟；

（4）电泳图谱分析：对所得PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据其大小及位置关系确定所属基因型（192bp的条带代表母本基因型，262bp的条带代表母本基因型）。

本发明具有以下积极有益效果：

本发明InDel分子标记变异稳定、检测容易，不需要酶切等繁琐的步骤，并且成本低廉，提高了西瓜果皮覆纹特征育种的选择效率和准确率，从而能加快育种进程。此外，此标记与目标QTL紧密连锁，遗传距离仅为0.2cM，在群体中检测效率达到100%，加快了西瓜果皮覆纹特征基因的克隆和功能验证。

附图说明

图1 父母本西瓜品种果实，左为母本、齿条，右为父本、网条，标尺为1cm。

图2 开发InDel标记加入图谱前后分析；A：果皮覆纹特征QTL扫描；B加上分子标记InDel1_rp6的连锁分析。

图3 利用分子标记InDel1_rp6的引物在部分F₂群体基因组DNA中的扩增结果；父母本方框中条带为目的条带，名称皆为品种名称代号的后两/三位。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。

实施例1

鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记的开发方法，具体步骤如下：

（1）西瓜果皮覆纹特征全基因组QTL初定位

利用母本“ZXG01478”（齿条）和父本“14CB11”（网条，图1）杂交获得的F₂群体已经构建了高密度的遗传连锁图谱（Shang>1和F₂群体的93个单瓜进行果皮覆纹特征的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和F₂群体表型鉴定结果，利用Rqtl-IM-binary方法（Yandel>RP6），其LOD峰值为23.65，解释67.78%的表型变异，对应的置信区间（2-LOD）为105.9～155.7cM，对应的物理位置为6号染色体的23.8～26.8Mb>

（2）父母本的重测序

利用母本和父本进行了22×深度的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。

（3）QTL区域InDel标记的开发

在QTL定位的区间发现24个插入缺失片段大于40bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，共设计22对对应的InDel引物。

实施例2

西瓜F₂群体分子标记分析，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

取1 g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1 ml CTAB 抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2-3次；

从水浴锅取出后，8000 rpm离心1 min；

取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/ V），轻轻颠倒使其充分混匀；

10000 rpm离心5 min，取上清液（尽量不取到中层沉淀）；

加入0.7倍体积的异丙醇（需提前预冷30 min），混匀后置于-20°C冷冻不超过30 min让DNA析出；取出后10000 rpm离心5 min，留沉淀弃上清液；

用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；

加入200 μl的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20°C冰箱中保存备用。

（2） PCR反应体系和程序

反应体系如下：西瓜叶片总DNA (100ng/μl) 1μl、Forward primer (10μmol/L) 1 μl、Reverse primer (10μmol/L) 1 μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μl、ddH₂O>

PCR反应程序为：94℃ 5分钟，35个循环的94℃ 20秒钟、55℃ 1分钟、72℃ 30秒、72℃ 5分钟。

（3）对PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

试剂配制：

A．5×TBE ：

Tris-base53.9克

EDTA　 3.72克

硼酸 27.5克

用蒸馏水定容至1升。

B. 40%聚丙烯酰胺溶液：

聚丙烯酰胺 193.34克

甲叉双丙烯酰胺 6.66克

用蒸馏水定容至500毫升。

C. 8%聚丙烯酰胺凝胶（现配现用）：

40%聚丙烯酰胺溶液10毫升

5 × TBE 5毫升

10% 过硫酸铵（APS）200微升

四甲基乙二胺（TEMED）80微升

蒸馏水 22毫升

D. 银染液：

硝酸银 1克

冰醋酸 5毫升

无水乙醇 50毫升

用去离子水定容至500毫升。

E. 显影液：

氢氧化钠 15克

甲醛（37%）2.5毫升

用去离子水定容至500毫升。

凝胶板准备：

玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子（一个制胶器可制作两板凝胶）。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液（两份），混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子（不要让梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。

电泳：

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA Loading Buffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。

染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。

带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

实施例3

F₂群体遗传连锁图谱重新构建，其步骤如下：>RP6>2群体进行基因型鉴定，然后利用Joinmap4.0软件进行连锁分析，发现MCPI_05与RP6的遗传距离较远，为3.1cM（图2B）。至此，我们开发了与果皮覆纹特征QTL（RP6）最为紧密连锁的共显性分子标记InDel1_rp6，对应于6号染色体26280408bp的一个70bp的插入缺失，其序列为GAATTAAATATTTTGAAATAATAGTGAAAGATTAAATTGGAAAAAAAAAAGTTTCAAAAATCTAAAACAT，其引物序列为，InDel1_rp6F：TCAAATGATGCTTTTCTTTT；InDel1_rp6R：TTAACAACCGTTGATGTGAA。该引物在母本（齿条）中的扩增产物为192bp，在父本（网条）中的扩增产物为262bp，该标记与RP6的遗传距离仅为0.2>RP6）的连锁程度很紧密。

实施例4

一种实施例3所筛选InDel分子标记在育种中的应用，其应用步骤如下：

（1）如实施例2进行InDel1_rp6分子标记在F₂群体中的基因型鉴定（图3）。

（2） 检查InDel1_rp6分子标记的两种基因型（A代表母本带型，B代表父本带型，H代表杂合基因型）在93个F₂群体中的分布情况（表1）。

结果表明，分子标记InDel1_rp6的基因型在63份齿条株系中19份为A（192bp），44份为H。而在30份网条株系中，有29份为B（262bp），1份为H。

分子标记InDel1_rp6的基因型为A的19个株系都是齿条，而在基因型为B的29个株系全部为网条，其基因型鉴定的准确率达到100%。

以上的结果足以说明通过分子标记InDel1_rp6来预测西瓜果皮覆纹特征，可以提高西瓜果皮覆纹特征育种的选择效率，从而加速育种进程。

表1 InDel1_rp6在F₂群体中的鉴定和验证

表1续 InDel1_rp6在F₂群体中的鉴定和验证

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SEQUENCE LISTING

<110>河南牧业经济学院

<120>一种鉴定西瓜果皮覆纹特征的InDel分子标记及其引物和应用

<130>/

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaattaaata ttttgaaata atagtgaaag attaaattgg aaaaaaaaaa gtttcaaaaa60

tctaaaacat 70

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tcaaatgatg cttttctttt20

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttaacaaccg ttgatgtgaa20