用于对暴露于颗粒物2.5(PM2.5)进行鉴别的微RNA及使用该微RNA进行鉴别的方法

摘要

本发明涉及微RNA在对暴露于颗粒物2.5(PM2.5)进行鉴别方面的用途，以及使用该微RNA对暴露于PM2.5进行鉴别的方法。更精确地，当将小鼠模型暴露于PM2.5水溶性提取物和PM2.5有机可溶性提取物时，确认了一种微RNA以正常水平1.3倍的水平过表达。因此，该选定的微RNA可用作监测PM2.5和评估PM2.5风险的生物标志物，并可用作检验PM2.5毒性机制的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及用于对暴露(exposure)于颗粒物2.5(PM2.5)进行鉴别的微RNA(microRNA)及使用该微RNA进行鉴别的方法。

背景技术

最近，微RNA(miR、miRNA)上升为参与基因表达调控的重要的调控RNA。此类小的非编码RNA分子(通常由18-24个核苷酸组成)可通过参与RNA降解、mRNA翻译和基因转录来调控蛋白表达模式。所述微RNA调控多种生物过程，例如发育、分化、细胞增殖、应激应答等。已知高等真核生物包含约1000种微RNA。

微RNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；Qi，P.等，Cell.Mol.Immunol.3，411-419，2006)转录，可由各miRNA基因的此类转录物、编码蛋白的基因的内含子或多顺反子编码的紧密相关的miRNA诱导。借助RNA pol II或pol III进行的miRNA基因的转录产生长度为数千个核苷酸的第一转录物，该第一转录物被称为初级miRNA转录物(pri-miRNA)。在细胞核中，由RNase和Drosha对pri-miRNA进行加工，生成由70-100个核苷酸构成的发卡类型的pre-miRNA。一旦转移至细胞质中，由dicer对发卡pre-miRNA进行再次加工，生成双链miRNA。成熟miRNA链混入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。随后，成熟miRNA在RISC中通过碱基对互补与靶mRNA结合。当miRNA碱基对与mRNA靶标完美匹配时(非常罕见)，促进mRNA降解。一般而言，miRNA与靶mRNA形成不完全的异源双链，这影响mRNA翻译。

miRNA机制对癌症发展、细胞衰老和器官生长等具有重要影响。因此，对miRNA的研究不仅对于研究癌症发展、衰老及其对人类寿命的影响而言是重要的，还应用在对使用干细胞的细胞治疗产品进行筛选、以及发育、分化的研究中，这表明miRNA可作为韩国生物研究的核心靶标。因此，微RNA标志物的筛选对于包括癌症在内的多种疾病的预测或早期诊断而言将是非常有帮助的。

大家还认为，微RNA标志物对于预测暴露于特定的环境有害物质而言将是有用的。直到最近，研究主要关注于由暴露于环境有害物质诱导的mRNA的改变，以及改变的mRNA与疾病的关联。根据最近提出并引人关注的微RNA与疾病的牵连，研究了暴露于有害物质(例如苯、砷或RDX)的情况下微RNA的表达模式。其结果是，表达模式呈靶标特异性改变的微RNA及其靶基因已被提议作为所述有害物质的标志物(Baccarelli，A.和Bollati，V.Curr.Opin.Prediatr.，21，243-251，2009)。所鉴别的微RNA不仅是用于对暴露进行预测的标志物，还是能够调控靶基因表达的基因表达调控子，表明微RNA也可有利地作为对由环境有害物质导致的毒性进行预测的标志物。虽然微RNA在对暴露于环境有害物质及由此所导致的毒性进行预测方面起到重要作用，对微RNA的研究还局限于利用微RNA开发疾病诊断的标志物。特别地，还未对当暴露于环境物质(例如由自然和环境来源产生、且一直存在而使暴露持续的颗粒物)时作为改变主体的微RNA表达模式进行透彻研究。表观遗传改变并不像遗传修饰(如基因表达模式改变)那样广泛。因此，与需要大量标志物的基因表达谱相比，表观遗传标志物(例如微RNA或DNA甲基化)可简单地利用仅一个标志物来促进对暴露于有害物质的早期鉴别，并且对于非侵入性方法而言是有利的。各微RNA调控多个靶基因。在高等真核生物中存在上千个微RNA。因此，预期存在大量可被微RNA调控的潜在循环通路(cycles)。

尺寸为10μm(1μm＝0.001mm)以下的灰尘被称为颗粒物。由燃料燃烧人为产生的颗粒物大致分为两组：直径10μm以下为PM10，直径2.5μm以下为PM2.5，PM2.5被称为细颗粒物。一般而言，可能对人类造成严重危害的PM2.5是由燃料燃烧产生的。锅炉、汽车和电厂也为主要来源。从建筑工地和道路弥散的灰尘也构成PM2.5的一大部分。

由于PM2.5的尺寸更小，在空气中移动速度更快。据推测，1/3的PM2.5来自于远距离迁移，1/3由本地直接产生，1/3归因于空气中的反应。由于PM2.5具有2.5μm以下的直径，极难通过肉眼分辨。PM2.5能够深入侵入肺泡。PM2.5主要通过呼吸被吸入人体内。PM2.5由燃料燃烧产生，因此，特别是在制造业工厂、交通繁忙的道路和电厂等处，暴露于PM2.5的风险很高。

PM2.5是以呼吸系统为途径诱发肺病的物质之一。由于颗粒非常小，PM2.5可不被鼻黏膜过滤而侵入肺泡，长时间暴露于PM2.5可能是多种疾病(包括哮喘、过敏(atopy)和肺癌等)的原因，从而可能增加早逝率。由于该风险，根据室内空气质量管理法，对于PM2.5而言，新公寓式住宅的室内空气质量的环境空气质量标准严格限制在年平均值为25μg/m³以下且日平均值为50μg/m³以下。最近涌现的报道指出，PM2.5显著威胁我们的健康，因而新环境标准(年平均值25μg/m³)从2015年生效。

由于PM2.5具有细颗粒物的特征(例如高流动性；并且，取决于地区，分布、浓度和组成具有高度的多样性和差异)，韩国关于PM2.5污染水平的记录信息不足。韩国环境部迫切地进行调查，试图通过收集PM2.5的远距离迁移性以及区域组成的差别方面的信息(特别关注于产生大量PM2.5的设施)来提供有效的计划。

虽然一些研究报道了PM10对人的毒性、PM10的组成及PM10造成的基因表达模式改变，对PM2.5的研究目前仅局限于其组成。

虽然对人而言PM2.5具有潜在风险，对PM2.5的风险评估数据仍然不足，对健康益处(假定WHO推荐的PM2.5浓度满足空气质量标准，该健康益处由改良PM2.5浓度所实现的过早死亡的降低而产生)进行计算的分析方法仍然存在不确定性和局限性。

因此，非常迫切地需要通过使用微阵列芯片或借助引物的实时PCR来对人类风险进行快速评估，以开发出对人类毒性以及参与多种疾病发展(特别包括癌症)的微RNA的表达模式进行筛选的分子标志物；并非常迫切地需要基于在小鼠模型中对PM2.5暴露进行评估的方法，利用所述标志物制定和管理针对暴露于PM2.5的合适对策。

自1997年微RNA首次被鉴别以来，已快速鉴别了哺乳动物和微生物中的大量微RNA，并已报告至Sanger miRBASE数据库(http://www.mirbase.org/index.shtml)。基于已建立的微RNA数据，采用一次即可对数千基因的表达同时进行分析的微阵列实施的基因组范围的表达研究(Schena，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，10614-10619，1996)正在进行，以揭示基因功能。

通过将cDNA(互补DNA)或20-25个碱基对长度的寡核苷酸组整合在玻璃上来制备微阵列。学校或公司(包括Agilent或GenomicSolutions)的实验室已通过将cDNA集合机械固定在芯片上或利用喷墨(ink jetting)制备了cDNA微阵列(Sellheyer K.等，J.Am.Acad.Dermatol.，51，681-692，2004)。由Affymetrix Co.制备的寡核苷酸微阵列使用了借助光刻(photolithography)直接在芯片上合成寡核苷酸的方法。由AgilentCo.制备的寡核苷酸微阵列利用了将预先合成的寡核苷酸固定在芯片上的方法(Sellheyer，K.等，J.Am.Acad.Dermatol.，51，681-692，2004)。

为分析基因表达，将获得自样品(例如组织)的微RNA与微阵列上的寡核苷酸杂交。用荧光或同位素对获得的微RNA进行标记。

借助于毒理基因组学(使用DNA微阵列的先进技术)，能够对由化学品(包括药物和新候选药物以及污染物)诱导的特定组织或细胞系中表达的微RNA的表达模式进行定量和高通量分析。因此，现在能够通过对细胞特异性的微RNA表达进行分析来对与药物的副作用和污染物的人类毒性特异性相关的基因进行鉴别，从而理解药物的作用和副作用以及污染物毒性的分子机制，并进一步实现对造成毒性和副作用的物质进行筛选和鉴别。

发明内容

本发明人使用寡核苷酸微阵列来对PM2.5微RNA表达谱进行分析，所述寡核苷酸微阵列上整合有用于检测1,247个小鼠微RNA的探针；肺组织样品取自暴露于两种不同类型PM2.5(水溶性和有机可溶性(organicsoluble))的小鼠，随后对微RNA的表达模式进行分析。其结果是，发明人鉴别了在暴露于两种不同类型的PM2.5的小鼠中表达均改变的微RNA。随后，本发明人确定了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的生物标志物以及使用该生物标志物对所述暴露进行鉴别的方法，从而完成了本发明。

本发明的一个目的在于提供微阵列芯片在对暴露于颗粒物2.5(PM2.5)进行鉴别方面的用途，所述微阵列芯片上整合有如下微RNA(miRNA)的cDNA：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

本发明的另一目的在于提供试剂盒在对暴露于PM2.5进行鉴别方面的用途，所述试剂盒包含与如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互补链分子互补并能够扩增所述cDNA的引物：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

本发明的又一目的在于提供用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)用不同荧光物质标记步骤1)的获得自实验组和对照的各RNA；

3)将步骤2)的标记有荧光物质的RNA与微RNA微阵列芯片杂交；

4)对步骤3)中反应的微RNA微阵列芯片进行分析；以及

5)利用步骤4)中分析的数据，对实验组和对照中Mm-miR-1943-3p的表达进行比较。

本发明的再一目的在于提供用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)从实验组的各RNA和对照的各RNA合成cDNA；

3)使用能够扩增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步骤2)的实验组和对照的cDNA进行RT-PCR(实时聚合酶链式反应)；以及

4)对步骤3)的实验组和对照的扩增产物的表达进行比较。

为实现上述目的，本发明提供了微阵列芯片在对暴露于颗粒物2.5(PM2.5)进行鉴别方面的用途，所述微阵列芯片上整合有如下微RNA(miRNA)的cDNA：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

本发明还提供了试剂盒在对暴露于PM2.5进行鉴别方面的用途，所述试剂盒包含与如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互补链分子互补并能够扩增所述cDNA的引物：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

本发明还提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)用不同荧光物质标记步骤1)的获得自实验组和对照的各RNA；

3)将步骤2)的标记有荧光物质的RNA与微RNA微阵列芯片杂交；

4)对步骤3)中反应的微RNA微阵列芯片进行分析；以及

5)利用步骤4)中分析的数据，对实验组和对照中Mm-miR-1943-3p的表达进行比较。

此外，本发明提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)从实验组的各RNA和对照的各RNA合成cDNA；

3)使用能够扩增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步骤2)的实验组和对照的cDNA进行RT-PCR(实时聚合酶链式反应)；以及

4)对步骤3)的实验组和对照的扩增产物的表达进行比较。

有益效果

用于对暴露于PM2.5进行鉴别的生物标志物(所述生物标志物的表达模式在暴露于两种不同类型的PM2.5(水溶性或有机可溶性)时均发生改变)以及使用该生物标志物对暴露于PM2.5进行鉴别的方法对于监测和评估PM2.5风险而言是有用的，这是由于它们使用了由微RNA微阵列芯片选出的仅有的反应性微RNA生物标志物，从而，它们可作为研究PM2.5毒性机制的有用工具。

附图说明

参照附图来最好地理解本发明优选实施方式的应用，其中：

图1为示出从环境提取水溶性提取物和有机可溶性提取物的提取过程的图表。

图2为示出利用微RNA微阵列芯片实施的、对暴露于PM2.5的小鼠肺组织样品的微RNA表达模式进行分析的结果的图。

具体实施方式

下面对本发明进行具体说明。

本发明提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的生物标志物，所述生物标志物的表达在暴露于两种不同类型的PM2.5(水溶性或有机可溶性)时均发生改变。

所述生物标志物优选由此类微RNA组成：在暴露于PM2.5时，所述微RNA的表达上调至少1.3倍或下调至少1.3倍。

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)(SEQ.ID.NO：1)。

所述微RNA的序列由CAGGUGCCAGCUCCUCCCUUC组成。

本文的PM2.5优选为PM2.5水溶性提取物或PM2.5有机可溶性提取物。

本文的颗粒物优选为直径在2.5μm以下(包括超细颗粒物(UFP))，更优选直径为0.1-2.5μm，但不总是限于此。

优选通过包含如下步骤的方法制备颗粒物提取物，但不总是限于此：

1)收集尺寸在2.5μm以下的颗粒物；

2)使用提取溶剂提取步骤1)中收集的颗粒物；以及

3)对步骤2)中获得的提取物进行过滤。

在上述方法中，步骤2)的提取溶剂优选为水、醇、二氯甲烷或以上溶剂的混合物。本文的水优选为纯净水(purified water)或蒸馏水，更优选为经三次蒸馏的水。本文的醇优选为C₁-C₂低级醇，本文的低级醇优选为乙醇或甲醇。该提取方法优选使用超声发生器和高容量空气采样器(high>

在本发明的一个优选实施方式中，利用PM2.5提取物对BALB/C小鼠模型进行处理。随后，从小鼠肺组织提取包含微RNA的总RNA，并用荧光物质(Cy3)进行标记。在将荧光标记的微RNA与微阵列芯片进行杂交后，扫描荧光图像以研究基因表达模式。当实验组的信号强度与对照的信号强度之比为至少1.3倍差异时，认为基因表达升高。

所选择的由于PM2.5水溶性提取物或PM2.5有机可溶性提取物而显示出过表达的微RNA如下所示：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)(SEQ.ID.NO：1)。

因此，证实了本发明的生物标志物为由于PM2.5而特异性过表达的微RNA。因此，本发明的生物标志物可为对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的有效工具。

本发明还提供了用于对暴露于PM2.5进行特异性鉴别的微RNA微阵列芯片，所述微RNA微阵列芯片上合成/整合了包含所述生物标志物微RNA的cDNA的部分或全部序列的寡核苷酸。

所述寡核苷酸包含所述生物标志物微RNA的cDNA的15-20个核苷酸。

可利用本领域技术人员熟知的传统方法制备本发明的用于鉴别PM2.5的微RNA微阵列芯片。用于制备微阵列芯片的方法优选为将筛选的生物标志物的cDNA固定在芯片上作为微RNA分子的探针的喷墨法，更优选为sureprint喷墨微墨滴微阵列(sureprint inkjet micro droppingmicroarray)，但不总是限于此。

DNA微阵列芯片的支撑板(board)优选涂覆有选自于由如下活性基团所组成的组中的活性基团之一：环氧化物(epoxy)、氨基硅烷、聚-L-赖氨酸和醛，但不总是限于此。芯片支撑板优选选自于由如下材料所组成的组：载玻片、塑料、金属、硅、尼龙膜和硝化纤维素膜，更优选为涂覆有环氧化物的载玻片，但不总是限于此。

本发明还提供了微RNA微阵列芯片在对暴露于PM2.5进行特异性鉴别方面的用途，所述微RNA微阵列芯片上合成/整合了包含所述生物标志物微RNA的cDNA的部分或全部序列的寡核苷酸。

所述寡核苷酸包含所述生物标志物微RNA的cDNA的15-20个核苷酸。

可利用本领域技术人员熟知的传统方法制备本发明的用于鉴别PM2.5的微RNA微阵列芯片。用于制备微阵列芯片的方法优选为将筛选的生物标志物的cDNA固定在芯片上作为微RNA分子的探针的喷墨法，更优选为sureprint喷墨微墨滴微阵列，但不总是限于此。

DNA微阵列芯片的支撑板优选涂覆有选自于由如下活性基团所组成的组中的活性基团之一：环氧化物、氨基硅烷、聚-L-赖氨酸和醛，但不总是限于此。芯片支撑板优选选自于由如下材料所组成的组：载玻片、塑料、金属、硅、尼龙膜和硝化纤维素膜，更优选为涂覆有环氧化物的载玻片，但不总是限于此。

本发明的微RNA微阵列芯片能够检测由于PM2.5而特异性地上调或下调的miRNA，从而能够作为对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的有用工具。

本发明还提供了利用所述微阵列芯片对暴露于PM2.5进行鉴别的方法。

本发明还提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)用不同荧光物质标记步骤1)的获得自实验组和对照的各RNA；

3)将步骤2)的标记有荧光物质的RNA与微RNA微阵列芯片杂交；

4)对步骤3)中反应的微RNA微阵列芯片进行分析；以及

5)利用步骤4)中分析的数据，对实验组和对照中Mm-miR-1943-3p的表达进行比较。

在用于对暴露于PM2.5进行鉴别的上述方法中，步骤1)的体细胞样品优选获得自暴露或未暴露于PM2.5的各小鼠组。

在用于对暴露于PM2.5进行鉴别的上述方法中，步骤2)的荧光物质优选选自于由如下物质所组成的组：Cy3、Cy5、FITC(聚L-赖氨酸-异硫氰酸荧光素)、RITC(罗丹明-B-异硫氰酸盐)以及罗丹明，但不总是限于此，可使用本领域技术人员知晓的任何荧光物质。

在用于对暴露于PM2.5进行鉴别的上述方法中，步骤5)的微RNA微阵列芯片优选为小鼠miRNA 8×60K(Rel 19.0)(Agilent，USA)，但不总是限于此。可使用能够检测表达模式在两种不同PM2.5(见表1)作用下均发生改变的微RNA的任何微阵列芯片，然而本发明人构建的微RNA微阵列芯片是最优选的。

在上述方法的步骤4)中，优选使用GeneSpring GX 12.6.1软件(Agilent，USA)，但不总是限于此，可使用本领域技术人员知晓的任何分析软件。

本发明中鉴别miRNA表达的方法使用了便于对由PM2.5特异性诱导的微RNA的下调或上调进行鉴别的微RNA微阵列芯片，从而，本发明的方法能够作为对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的有用工具。

本发明提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的试剂盒，所述试剂盒包含所述微阵列芯片。

本发明的用于对暴露于PM2.5进行鉴别的试剂盒还可包含小鼠肺细胞或组织。

本发明的用于对暴露于PM2.5进行鉴别的试剂盒还包含与如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互补链分子互补并能够扩增所述cDNA的引物：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

小鼠模型肺组织样品优选获得自暴露或未暴露于PM2.5的小鼠组。

所述试剂盒还可包含荧光物质。本文的荧光物质优选选自于由如下物质所组成的组：链霉亲和素样磷酸酶缀合物、化学荧光物质和化学发光物质，但不总是限于此。在本发明一个优选的实施方式中，使用Cy3。

所述试剂盒还可包含反应试剂，此时，所述反应试剂优选由杂交缓冲液、标记试剂(例如荧光素染料的化学诱导剂)和洗涤缓冲液组成，但不总是限于此，可包括本领域技术人员知晓的对于微RNA微阵列芯片杂交所必需的任何反应试剂。

因此，证实了本发明的试剂盒包含由于PM2.5而特异性地过表达的微RNA，从而能够作为对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的有效工具。

本发明还提供了所述试剂盒在对暴露于PM2.5进行鉴别方面的用途，所述试剂盒包含所述微阵列芯片。

本发明的用于对暴露于PM2.5进行鉴别的试剂盒还可包含小鼠肺细胞或组织。

本发明的用于对暴露于PM2.5进行鉴别的试剂盒还包含与如下微RNA的cDNA或所述cDNA的互补链分子互补并能够扩增所述cDNA的引物：

微RNA登记号(miRbase)MIMAT0017342(Mm-miR-1943-3p)。

小鼠模型肺组织样品优选获得自暴露或未暴露于PM2.5的小鼠组。

所述试剂盒还可包含荧光物质。本文的荧光物质优选选自于由如下物质所组成的组：链霉亲和素样磷酸酶缀合物、化学荧光物质和化学发光物质，但不总是限于此。在本发明一个优选的实施方式中，使用Cy3。

所述试剂盒还可包含反应试剂，此时，所述反应试剂优选由杂交缓冲液、标记试剂(例如荧光素染料的化学诱导剂)和洗涤缓冲液组成，但不总是限于此，可包括本领域技术人员知晓的对于微RNA微阵列芯片杂交所必需的任何反应试剂。

因此，证实了本发明的试剂盒包含由于PM2.5而特异性地过表达的微RNA，从而能够作为对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的有效工具。

此外，本发明还提供了用于对暴露于PM2.5进行鉴别的方法，所述方法包含如下步骤：

1)从获得自实验受试者的体细胞以及获得自对照正常受试者的体细胞分离RNA；

2)从实验组的各RNA和对照的各RNA合成cDNA；

3)使用能够扩增Mm-miR-1943-3p的cDNA的引物，利用步骤2)的实验组和对照的cDNA进行RT-PCR(实时聚合酶链式反应)；以及

4)对步骤3)的实验组和对照的扩增产物的表达进行比较。

在上述方法中，步骤1)的体细胞特别地为小鼠肺细胞或组织。

利用本发明的微RNA和cDNA，通过比较扩增产物的表达来对暴露于PM2.5进行鉴别的方法使用了对研究由于PM2.5而特异性上调或下调的微RNA的分布而言有用的微阵列芯片，从而能够被有效地用作对暴露于PM2.5进行鉴别、监测PM2.5、评估PM2.5风险、以及研究PM2.5毒性机制的工具。

以下实施例中示出的本发明的实用和目前优选的实施方式是说明性的。

然而，将理解的是，在考虑了本公开内容的基础之上，本领域技术人员可在本发明的精神和范围内作出变化和改进。

实施例

实施例1：PM2.5的收集和提取

<1-1>收集地点的选择

为了筛选用于对暴露于PM2.5进行鉴别的生物标志物，选择韩国科学技术研究所(KIST)体育馆(Hawolgok-dong，Sungbuk-gu，首尔)的屋顶作为收集PM2.5的收集地点，该体育馆临近位于城北区(Sungbuk-gu)的Wolgok站附近的Naebu高速路，该处交通流量高达十一月时工作日平均70,000辆汽车经过、十二月时工作日平均69,000辆汽车经过(2011)。对于体外测试，需要相当大量的PM2.5。由于低容量空气采样器运行24小时仅能够获得数mg的PM2.5，低容量空气采样器不适于PM2.5的收集。因此，对于PM2.5的体外测试，使用高容量空气采样器，以便于收集高容量的颗粒物。通过使用仅允许PM2.5通过的涂覆有特氟龙(teflon)的玻璃纤维滤器，使得超过2.5μm的颗粒物由于质量惯性(weight inertia)而被油阻止，PM2.5专一性入口(Tisch Instrument公司)收集到PM2.5。

<1-2>收集滤器

对于高容量空气采样器，选择不允许大于8×10英寸的任何颗粒通过的涂覆有特氟龙的玻璃纤维滤器。用蒸馏水(18.2MΩ)和二氯甲烷作为提取溶剂。为使水分(moisture)造成的误差最小化，在干燥器中将滤器完全干燥48小时。随后，使用高精度天平(Mettler Toledo公司)对滤器进行称重，该高精度天平能够称量至0.1mg的重量。将滤器以内侧彼此面对的方式对折，放入避光密封的带拉链的袋子。将处于带拉链的袋子中的滤器储存于-80℃。当需要将其转移至收集地点时，用冰盒携带。为了收集PM2.5，维持合适的流速(1.13m³/min±10％)。

<1-3>收集时间

使用高容量空气采样器对PM2.5收集5个月。第一次收集在2011年11月11日完成，最后一次收集(第50次收集)在2012年3月28日完成。排除在雨天滤器显示出20μg/m³以下的空气PM浓度的情况。将总共10个滤器分至同一组中，并准备好了总共5组滤器。

<1-4>对收集的颗粒物进行提取

为对收集的PM2.5的组成进行分析，将一片滤器分为两半。分别将用于提取水溶性成分的超纯水(蒸馏水)和用于提取有机可溶性成分的二氯甲烷加入至各半片滤器。由此，通过提取过程制备了PM2.5水溶性提取物和PM2.5有机可溶性提取物(图1)。

实施例2：PM2.5暴露模型的选择以及小鼠肺组织样品的获取

<2-1>PM2.5暴露模型

PM2.5是空气中的悬浮颗粒物，是环境有害物质中的一种。一旦颗粒物进入肺，将诱发典型的颗粒诱导型炎症。根据之前的报道，将BALB/C模型用于测量此类应答具有高灵敏度。BALB/C易于感染慢性肺炎，并对辐射具有高敏感性。这种动物比较驯服和温顺，并显示较低的乳腺癌发病率。因此，最终选定该动物作为合适的模型。

具体而言，将<实施例1>中收集的PM2.5分为两个不同的组，即水溶性组和有机可溶性组。也将小鼠模型分为两组，其中一组暴露于PM2.5，另一组未暴露于PM2.5。暴露组暴露于低剂量的PM2.5或高剂量的PM2.5。因此，准备了总共6组，包括未暴露组和暴露于不同剂量的PM2.5的暴露组(表1)。

[表1]

PM2.5暴露剂量和小鼠分组

实验组剂量(μg)数量(BALB/C)对照024低剂量2024高剂量16424

<2-2>确定用于小鼠模型暴露的PM2.5剂量

在研究BALB/C小鼠模型暴露于PM2.5的在先研究中，确定了暴露剂量基于绝对量为不超过100μg。通过参考之前报道的研究方法和结果(Hans Hedrich，The laboratory mouse，2004)、小鼠死亡率和分布在真实环境中的PM2.5的浓度等，本发明人用所选的三种不同的PM浓度(0μg(对照)、20μg(低剂量)和164μg(高剂量))进行暴露测试(表2)。

对于暴露方法，优选PM2.5被吸入。然而，当PM2.5确实被吸入时，几乎不可能将所有不同的小鼠等同地暴露于所期望的PM2.5浓度。因此，将收集的两组PM2.5制成液相，将其直接经由BALB/C小鼠模型的气道插入(气管滴注)。各组暴露剂量的计算示于下方。

各小鼠组的PM2.5剂量的计算

小鼠的每分钟呼吸容量(ml)＝33.5-47.5ml/min

小鼠的每周呼吸容量(ml)＝337,680-478,800ml/周

暴露于20μg的剂量：

20μg/337,680ml＝0.0000592277μg/ml

20μg/478,800ml＝0.0000417711μg/ml

PM2.5的每日大气环境标准：50μg/m³

人的每分钟呼吸容量(ml)＝6000ml

人的每周呼吸容量(ml)＝6000×60分钟×24小时×7天＝60,480,000ml＝60m³

暴露于25μg/m³-50μg/m³的浓度一周：

25μg/m³×60m³/60,480,000ml＝0.0000248016μg/ml

50μg/m³×60m³/60,480,000ml＝0.0000496032μg/ml

因此，当将小鼠暴露于20μg剂量的PM2.5时，所计算的值为(41-59)×10^-6μg/ml，通过将该剂量与采用针对人类的PM2.5大气环境标准获得的暴露剂量(24-49)×10^-6μg/ml进行比较，判定该剂量为可施用剂量。该低剂量的原因在于将细胞毒性最小化，以避免任何可能的遗传转变(即使未观察到组织病理学改变)。

在164μg的剂量下，预期具有细胞毒性和组织病理学改变。此外，还预期发生遗传修饰。因此，认为这是暴露的高剂量。

<2-3>肺组织样品

利用BALB/C小鼠模型所做实验的最首要的目的在于有效提取高品质的包含微RNA的总RNA。为实现该目的，获得无损伤的肺组织样品。在对肺组织样品进行提取后，将其储存在Allprotect溶液(Qiagen)中，该溶液可使其在-20℃避光储存6个月，在-80℃避光储存1年。使用前在-80℃储存该肺组织样品。

实施例3：微阵列测定

<3-1>靶微RNA的分离和荧光物质标记

使用trizol从PM2.5暴露组和PM2.5未暴露组的血样提取RNA。使用RNeasy Mini试剂盒(Cat NO.74106，Qiagen)对提取的RNA进行纯化。在RNA纯化过程中，使用不含RNase的DNase Set(Qiagen，USA)去除基因组DNA。用NanoDrop ND 1000分光光度计(NanoDropTechnologies Inc.，USA)测量各总RNA的浓度。使用Agilent 2100生物分析仪测量RNA的品质。

<3-2>标记的微RNA的制备

对于寡核苷酸微阵列测定，用荧光物质标记获得自实施例<3-1>的PM2.5暴露组和PM2.5未暴露组的总RNA。按照制造商方案，使用miRNA完全标记及杂交试剂盒(Agilent)实施所述标记。将获得的总RNA(100ng)与0.4μl 10×CIP缓冲液、1.1μl不含核酸酶的水以及0.5μl小牛肠磷酸酶混合，随后37℃反应30分钟。随后在其中加入2.8μl 100％DMSO，随后100℃反应5-10分钟。立即将反应混合物转移至冰上。对于标记，在上述混合物中加入1μl 10×T4连接酶缓冲液、3μl cyanine-3-pCp和0.5μl T4RNA连接酶，随后16℃反应2小时。使用micro bio-spin 6柱将标记的样品纯化。在55℃的真空浓缩器中将纯化的RNA完全干燥，随后将其溶解于18μl不含核酸酶的水中。在获得的溶液中加入4.5μl 10×GE封闭剂，在其中加入22.5μl 2×Hi-RPM杂交缓冲液。所制备的样品在100℃反应5分钟，随后再次立刻转移至冰上，然后反应5分钟。随后将该样品用于下一步的杂交。

<3-3>杂交

按照EBIOGEN Inc.的说明进行杂交和洗涤过程。杂交在55℃诱导20小时。将小鼠miRNA 8×60K(Rel 19.0)(Agilent，USA)用作DNA微阵列芯片。

<3-4>荧光图像的获取

使用Agilent C扫描仪(Agilent technologies，USA)扫描玻片上的杂交图像。使用Agilent GeneSpring GX 12.6.1(Agilent technologies)对提取数据进行归一化，随后研究各微RNA的表达模式。

其结果是，如图2所示，使用GeneSpring GX 12.6.1软件，在寡核苷酸芯片上研究了约1,247个微RNA的表达模式，对暴露组和未暴露组之间的微RNA表达模式进行了比较(图2)。其结果是，仅有一种微RNA被确认为与正常表达水平相比上调了至少1.3倍。同时，在四种情况下，所述微RNA的表达均未被下调(表2)。没有报道提及上述微RNA与将小鼠模型暴露于PM2.5时观察到的毒性相关。

[表2]

因暴露于PM2.5而引起表达改变的微RNA

本领域技术人员将会理解的是，可容易地将在以上描述中公开的构思和具体实施方式用作修改或设计其它实施方式的基础，以实现与本发明相同的目的。本领域技术人员还将理解的是，此类等同实施方式并未背离如所附权利要求书中阐明的本发明的精神和范围。