一种基因片段、载体pPlasmid‑Clearance及应用

摘要

本发明公开了一种基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了一种载体pPlasmid‑Clearance，所述载体pPlasmid‑Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该基因片段和载体pPlasmid‑Clearance可以逆转环境及动物内菌群中多粘菌素耐药基因mcr‑1耐药菌的耐药性，阻断多粘菌素耐药基因mcr‑1的传播，在细菌性疾病的预防和临床治疗上具有极大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用。

背景技术

耐药菌的广泛传播，严重威胁了人类和动物的健康。细菌的耐药性根据其产生原因可分为两种形式：一是天然耐药性又称固有耐药性，是由细菌染色体上的耐药相关基因决定、在细菌世代间垂直传递，又称天然耐药性；二是获得性耐药，这种耐药性主要由后天获得，是随着抗菌药物的长期大量使用，由含有耐药基因的质粒通过接合反应在细菌间水平传递耐药基因，介导接受质粒的受体菌产生耐药蛋白，对抗生素由原先的敏感转为耐受状态。通过质粒介导的获得性耐药可因不再接触抗生素而消失，也可由质粒将耐药基因转移至染色体世代相传，成为固有性耐药。

细菌中耐药基因的传播主要通过转化、转导、接合等方式，其中由耐药质粒介导的细菌接合转移是最易发生的传递方式，且不同来源的细菌可以通过质粒的介导而获得相同的耐药谱，造成抗生素在临床上的疗效降低甚至无效。耐药质粒介导的耐药与染色体突变导致的耐药不同，耐药质粒可以通过水平基因传递进行扩散；质粒介导的耐药性常为多重耐药，可以使宿主菌耐受多种抗生素的作用，耐药质粒上携带的耐药基因赋予了细菌对抗生素的耐药性，消除细菌的耐药质粒，细菌的药性也会随之丧失。耐药质粒一旦被消除，细菌的耐药性则不可恢复，除非外源耐药质粒再次转入。

多粘菌素耐药基因mcr-1是在近年来在大肠杆菌中发现，该基因位于宿主菌的质粒pHNSHP45上，质粒携带的mcr-1基因所介导抗粘菌素耐药细菌的广泛分布，由于该基因存在于质粒上，使得这种耐药性在大量细菌菌种之间蔓延。一旦这种具备耐药性的细菌迅速蔓延，全球将笼罩在无法治愈的感染病阴影中。

当前国内外对耐药质粒消除的研发仍处于起步阶段，所研究的产品均存在某些不足，如化学消除剂对人体有害或方法本身不适用于人体；中药消除剂有效成分不确定，作用机理不明确，消除效果不稳定。目前仍没有一个较好的可供体内使用的消除含有多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的载体。因此，有必要开发一种用于临床的消除含有多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因片段、载体pPlasmid-Clearance及应用，该载体能够应用于临床上含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的消除，机理明确、效果稳定，且不会对人体造成伤害。

本发明提供了一种基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种载体pPlasmid-Clearance，所述载体pPlasmid-Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种载体pPlasmid-Clearance的构建方法，具体按照以下步骤实施：

步骤一，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段；

步骤二，制备接合转移载体pEF01，并将接合转移载体pEF01转化入大肠杆菌感受态细胞中，得到pEF01转化细胞；

步骤三，制备pEF01转化细胞的感受态细胞，得到pEF01感受态细胞；

步骤四，采用多片段一步法克隆试剂盒，将载体pKD46转化入pEF01感受态细胞中，得到pKD46转化细胞；

步骤五，制备pKD46转化细胞的电转化感受态细胞，得到pKD46感受态细胞；

步骤六，利用多片段一步法克隆试剂盒，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段电转化到pKD46感受态细胞中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与接合转移载体pEF01发生重组反应，得到含有载体pPlasmid-Clearance的重组细胞；

步骤七，提取阳性克隆细胞重组细胞中的载体pPlasmid-Clearance，即得到载体pPlasmid-Clearance。

本发明还提供了上述载体pPlasmid-Clearance，在消除革兰氏阴性菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的临床应用。

本发明还提供了上述载体pPlasmid-Clearance，在消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的临床应用。

本发明还提供了一种利用上述载体pPlasmid-Clearance，消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的方法，具体包括以下步骤：

步骤1，将载体pPlasmid-Clearance转化入大肠杆菌Nissle 1917菌株，得到载体pPlasmid-Clearance转化菌；

步骤2，将载体pPlasmid-Clearance转化菌加入含氨苄的LB培养基中，37℃培养12-16h，离心并收集沉淀，用LB培养基清洗沉淀，并将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到供体大肠杆菌溶液；

步骤3，将pHNSHP45质粒转化入大肠杆菌中，得到受体大肠杆菌；

步骤4，将受体大肠杆菌加入含多粘菌素B的LB培养基中，37℃培养12-16h，离心并收集沉淀，用LB培养基清洗沉淀，并将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到受体大肠杆菌溶液；

步骤5，将供体大肠杆菌溶液和受体大肠杆菌溶液按1:1的体积比例混合，之后于37℃100rpm培养8h，然后剧烈震荡终止反应，得到菌体混合液，完成含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的消除；

步骤6，结果判断：将菌体混合液涂到含有多粘菌素B的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有多粘菌素B抗性；或者将菌体混合液涂到含有氨苄和多粘菌素B两种物质的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有氨苄和多粘菌素B双抗性；若单菌落不具有多粘菌素B抗性或不具有者氨苄和多粘菌素B双抗性，则该单菌落中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒被成功消除。

优选的，上述消除大肠杆菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒的方法中，步骤2和步骤4的离心条件均为4℃，3000rpm离心2min。

本发明提供的基因片段和载体pPlasmid-Clearance，具有以下优点：

1、可以通过同源重组置换sgRNA表达盒，使其打靶其它耐药基因或者同时打靶多种重要耐药基因，在临床耐药致病菌的治疗上，适合范围更广、更加有效且成本低，具有极大的应用潜力。

2、可以用于消除环境及动物体内的耐药菌中的多粘菌素耐药基因mcr-1、阻断多粘菌素耐药基因mcr-1的传播，并且使耐药菌对多粘菌素耐药基因mcr-1侵入免疫，适用于逆转耐药质粒介导的耐药性，恢复其对廉价抗生素的敏感性，因此，本发明所构建的载体pPlasmid-Clearance可以逆转环境以及动物内菌群中多粘菌素耐药基因mcr-1耐药菌的耐药性，阻断耐药基因的传播，在细菌性疾病的预防和临床治疗上具有极大的应用潜力。

3、相比于化学分子和中药质粒消除等质粒消除剂，本发明所构建的载体pPlasmid-Clearance作用机制明确，通过天然的细菌接合反应转移至受体菌中，直接切割含有耐药基因的质粒或受体菌染色体DNA，消除耐药质粒，逆转受体菌耐药性，或者是消除含有耐药基因的受体菌，可以用于动物体内耐药基因的消除或者环境中耐药基因的消除，在应用上具有高度的生物安全性。

附图说明

图1是本发明的基因片段的结构示意图；

图2是本发明的载体pPlasmid-Clearance的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

本发明提供了一种基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种载体pPlasmid-Clearance，所述载体pPlasmid-Clearance是通过同源重组的方法，在接合转移载体pEF01的抗性基因区域插入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段构建而成，所述接合转移载体pEF01的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗性基因区域指的是接合转移载体pEF01的3730-5249之间的核苷酸序列，具体按照以下步骤实施：

步骤一，人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段；

核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段分为如图1所示的五部分，从左至右依次包括：(1)上游同源臂；(2)组成型表达Amp^R抗性基因的表达盒，该表达盒自5'端至3'端依次包括AmpR启动子，AmpR基因序列和终止子；(3)组成型表达的Cas9表达盒，该Cas9表达盒自5'端至3'端依次包括组成型启动子BBa>

步骤二，根据如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，制备接合转移载体pEF01，并将接合转移载体pEF01转化入大肠杆菌感受态细胞中，得到pEF01转化细胞。

步骤三，制备pEF01转化细胞的感受态细胞，得到pEF01感受态细胞。

步骤四，采用Fasta多片段一步法克隆试剂盒(购买于北京赛百盛基因技术有限公司)，并按照Fasta多片段一步法克隆试剂盒的操作步骤，将载体pKD46转化入pEF01感受态细胞中，得到pKD46转化细胞。

步骤五，制备pKD46转化细胞的电转化感受态细胞，得到pKD46感受态细胞。

步骤六，利用Fasta多片段一步法克隆试剂盒，并按照Fasta多片段一步法克隆试剂盒的操作步骤，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段电转化到pKD46感受态细胞中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段与接合转移载体pEF01发生重组反应，得到含有载体pPlasmid-Clearance的重组细胞。所述载体pPlasmid-Clearance含有可以接合转移的消除多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒，所述载体pPlasmid-Clearance失去了氟苯尼考抗性，通过氟苯尼考抗性和PCR鉴定，选取不具备氟苯尼考抗性的阳性克隆重组细胞，用于提取载体pPlasmid-Clearance。

需要说明的是，载体pKD46用于表达重组酶，载体pKD46是一种同源重组质粒，该质粒为低拷贝温敏型质粒，该质粒可以表达exo、bet、gam三种蛋白，促进重组高效率的发生。在重组酶的作用下，使如SEQ ID NO.1所示的基因片段的下游同源臂与接合转移载体pEF01抗性基因区域(接合转移载体pEF01的3730-5249之间的核苷酸序列)同源重组，获得消除耐药质粒的载体pPlasmid-Clearance，所述载体pPlasmid-Clearance结构如图2所示，并且该消除耐药质粒的载体具有自转移的功能。

步骤七，按常规方法提取重组细胞(阳性克隆)中的载体pPlasmid-Clearance，即得到载体pPlasmid-Clearance。

载体pPlasmid-Clearance消除革兰氏阴性菌中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒(耐药质粒)的原理是：将载体pPlasmid-Clearance转化至大肠杆菌感受态细胞中，制备成供体菌，以含有耐药质粒或者含有耐药基因的细胞作为受菌体，当供体菌和受体菌接触后，利用微生物间的天然接合转移作用使载体pPlasmid-Clearance转移至受体菌中，同时如SEQ ID NO.1所示的基因片段随载体pPlasmid-Clearance一起转移至受体菌中。在基因片段中sgRNA表达盒的引导下，Cas9表达盒表达Cas9蛋白，然后Cas9蛋白切割耐药质粒上携带的耐药基因mcr-1，导致耐药质粒的DNA双链断裂，消除耐药质粒，或者Cas9蛋白切割含有耐药基因的细菌染色体，消除细菌染色体上的耐药基因mcr-1；

耐药质粒或者耐药基因mcr-1被消除的受体菌，不但耐药性逆转而且会免受耐药质粒或者耐药基因的传递，实现对耐药基因的免疫，不会发生耐药质粒或者耐药基因二次转入该受体菌的现象；

另一方面，该载体pPlasmid-Clearance会继续通过天然接合反应转移至其它受体细菌，消除受体细菌中的耐药质粒或者耐药基因mcr-1。

下面以多粘菌素耐药基因mcr-1为例，利用细菌间天然的接合反应，将载体pPlasmid-Clearance从供体大肠杆菌传递至受体大肠杆菌，以消除受体大肠杆菌中携带有多粘菌素耐药基因mcr-1的耐药质粒，具体步骤如下：

步骤1，将载体pPlasmid-Clearance转化入大肠杆菌Nissle 1917菌株(购自中国普通微生物保藏管理中心)中，得到载体pPlasmid-Clearance转化菌，大肠杆菌Nissle 1917属于革兰氏阴性益生菌。

步骤2，将载体pPlasmid-Clearance转化菌加入含氨苄的LB培养基中，其中LB培养基中氨苄的浓度为100μg/ml，37℃培养12-16h(培养过夜)，然后于4℃，3000rpm离心2min，收集沉淀，用LB培养基清洗沉淀两次，并且每次清洗后均并于4℃，3000rpm离心2min，最后，将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到供体大肠杆菌溶液，并记录打靶前供体菌数。

步骤3，将pHNSHP45质粒(mcr-1阳性质粒)转化入大肠杆菌Nissle 1917菌株中，得到受体大肠杆菌，需要说明的是大肠杆菌其他的菌株编号也可以用作pHNSHP45质粒的受体菌；

需要说明的是，pHNSHP45质粒是在猪体内分离的大肠杆菌SHP45中所含的质粒，通过对质粒测序证明质粒上的mcr-1基因介导多粘菌素抗性，且其多粘菌素耐药性可以传递给其它菌株。

步骤4，将受体大肠杆菌加入含多粘菌素B的LB培养基中，其中LB培养基中多粘菌素B的浓度为4μg/ml，37℃培养12-16h(培养过夜)，然后于4℃，3000rpm离心2min，收集沉淀，用无抗生素LB培养基清洗沉淀两次，并且每次清洗后均并于3000rpm 2min离心，用LB培养基清洗沉淀两次，并且每次清洗后均并于4℃，3000rpm离心2min，最后将清洗后的沉淀用LB培养基稀至OD600＝0.5，得到受体大肠杆菌溶液，并记录打靶前受体菌数。

步骤5，将供体大肠杆菌溶液和受体大肠杆菌溶液按1:1的体积比例混合，之后于37℃100rpm培养8h，然后剧烈震荡终止反应，剧烈震荡的振幅是20mm，频率是300rpm，得到菌体混合液，完成多粘菌素耐药基因mcr-1的耐药质粒的消除。

步骤6，结果判断

取步骤5的菌体混合液10μl，分别稀释10、10³、10⁵倍，得到10稀释液、10³稀释液和10⁵稀释液，然后分别将10稀释液、10³稀释液和10⁵稀释液涂到含有多粘菌素B的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有多粘菌素B抗性；或者将10稀释液、10³稀释液和10⁵稀释液分别涂到含有氨苄和多粘菌素B两种物质的琼脂板上，观察琼脂板上单菌落是否具有氨苄和多粘菌素B双抗性，并且记录打靶后受体菌数(具有多粘菌素B抗性或者氨苄和多粘菌素B双抗性)和接合菌数(不具有多粘菌素B抗性或者氨苄和多粘菌素B双抗性)，若单菌落不具有多粘菌素B抗性或不具有者氨苄和多粘菌素B双抗性，则该单菌落中含多粘菌素耐药基因mcr-1的质粒被成功消除。

接合率的计算公式：接合菌数/打靶前供体菌数×100％。

质粒消除率计算：打靶前受体菌数﹣打靶后受体菌数/打靶前受体菌数×100％。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。