一种识别并结合人转铁蛋白受体的核酸适体序列及其应用

摘要

本发明公开了一种识别并结合人转铁蛋白受体的核酸适体序列及其应用。本发明的核酸适体及其衍生物可在识别转铁蛋白受体高表达肿瘤或者制备检测转铁蛋白受体高表达肿瘤的试剂盒、分子探针、靶向介质中应用，以及在设计和制备检测转铁蛋白受体的核酸探针的应用。本发明的核酸适体具有比已有技术更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种识别并结合人转铁蛋白受体的核酸适体序列及其应用。

背景技术

转铁蛋白受体(transferrin receptor(TfR)，又叫CD71)是一种广泛存在于动物细胞中的跨膜糖蛋白，它是一种Ⅱ型同源二聚体糖蛋白(180kDa)，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，其主要功能是通过与转铁蛋白作用来介导铁元素的跨膜运输和内吞吸收。铁元素参与细胞内DNA的合成、细胞增殖、免疫调节及细胞内呼吸链中电子的传递等多个生理过程。转铁蛋白受体的表达量的高低与细胞对铁元素的需求密切相关。转铁蛋白受体在正常细胞上表达很低，代谢旺盛而需要大量铁元素的细胞和组织如分裂旺盛的上皮基底细胞、血脑屏障等都高表达转铁蛋白受体。研究发现，大多数肿瘤细胞如结肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、血液系统肿瘤和鼻咽癌等都高度表达转铁蛋白受体；恶性肿瘤预后较差也与转铁蛋白受体表达升高有关；因此，转铁蛋白受体的检测有助于肿瘤的鉴别和早期诊断。由于转铁蛋白受体在肿瘤细胞表面高度表达且其介导的跨膜转运途径转运效率高、靶向性好，因此它在肿瘤的靶向诊断和治疗中得到广泛研究和应用。同时，细胞表面的转铁蛋白受体的胞外区可经丝氨酸蛋白酶水解作用释放到血清中，这种可溶性转铁蛋白受体(sTfR)在血清中通常与不同的转铁蛋白以复合物的形式存在；铁缺乏时会引起sTfR合成的增加，测定sTfR可在临床上作为特异性检测指标用于缺铁性贫血的诊断。因此检测转铁蛋白受体对于疾病的诊断具有重要意义。目前转铁蛋白受体的主要检测方法是酶联免疫法吸附法，但其步骤繁琐、耗时长、价格昂贵、抗体活性批次差异大、易发生交互反应等；因此构建一种简便、经济、直观和特异的人转铁蛋白受体检测方法在临床诊断和治疗方面具有应用前景。

核酸适体(aptamer)是一段由10～150个碱基组成的单链寡聚核苷酸，它能高结合力、高选择性识别某一种或某一类配体分子，被称作“能化学合成的抗体”(chemical antibody)。核酸适体可为DNA、RNA、肽核酸或其它经过化学修饰的核酸；由于核酸能借助范德华力、氢键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用形成不同的三维结构，如发卡、假结、G-四链体等结构，因此核酸适体能够实现与靶标物质高亲和力、高特异性的结合作用。筛选与靶标物质高效、专一结合的核酸适体的技术叫做指数富集配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX)技术。SELEX技术所筛选的核酸适体的靶标物质范围广泛，包括无机金属离子、有机小分子、生物大分子、以及病毒、细菌、细胞和组织切片等，迄今已报道了数百个核酸适体。

利用SELEX技术能筛选出针对活细胞和组织等复杂靶标的核酸适体与单克隆抗体具有相似的识别功能，但与单克隆抗体相比，具有如下优点：

(1)在体外筛选，无需免疫动物或细胞；

(2)低毒性或免疫源性，水溶性好，可大剂量皮下静脉注射或病灶注射；

(3)可进行大量化学合成制备，批间差异小；

(4)易于结构改造、修饰、标记或固定化，增加血清中稳定性；

(5)稳定性好，易保存和运输；

(6)分子量小，一般在4-50KD。

基于上述优点，核酸适体作为新型的仿生识别元素，已在疾病诊断与治疗、药物筛选、分子识别和分析检测等众多领域得到了广泛的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种核酸适体。

本发明提供的核酸适体为如下A)或B)：

A)序列1所示的单链DNA分子；

B)去除A)所示的核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1-20个核苷酸，且去除所述A)所示的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的10-20个核苷酸，保留的核苷酸残基组成的核酸适体。

上述核酸适体中，B所示的核酸适体为如下1)-5)中任一种：

1)序列2所示的单链DNA分子；

2)序列6所示的单链DNA分子；

3)序列5所示的单链DNA分子；

4)序列4所示的单链DNA分子；

5)序列3所示的单链DNA分子。

本发明的另一个目的是提供上述核酸适体的衍生物。

本发明提供的上述核酸适体的衍生物为如下(1)-(6)中任一种：

(1)将上述核酸适体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(2)将上述核酸适体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(3)将上述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(4)由上述核酸适体编码的RNA分子，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(5)由上述核酸适体编码的肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

(6)将上述核酸适体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

上述衍生物中，所述修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化；所述功能基团为荧光基团、生物素基团、放射性物质、治疗性物质、地高辛、纳米发光材料或酶标记。

上述衍生物中，所述核酸适体的衍生物为在序列2所示的核酸适体的5’端标记荧光素基团或花菁染料基团或生物素基团后得到的核酸适体的衍生物。

本发明还有一个目的是提供一种核酸适体探针。

本发明提供的核酸适体探针为将上述核酸适体或上述衍生物负载在聚乙二醇修饰的氧化石墨烯上，得到核酸适体探针。

上述核酸适体探针中，所述核酸适体或所述衍生物与聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的配比为1nmol：150mg。

上述核酸适体探针中，所述探针按照如下方法制备：将荧光基团标记的核酸适体衍生物、聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和缓冲液混匀，孵育，得到核酸适体探针。

上述核酸适体探针中，所述荧光基团标记的核酸适体衍生物、所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和缓冲液的配比为1nmol：150mg：1L。

上述核酸适体探针中，所述荧光基团标记的核酸适体衍生物为在序列2所示的核酸适体的5’端标记荧光素基团(6-FAM)后得到的核酸适体的衍生物。

上述核酸适体探针中，所述缓冲液的溶剂为水，溶质及其在缓冲液中的浓度为10mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM KCl和2mM MgCl₂。

上述核酸适体探针中，所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯中，聚乙二醇在氧化石墨烯表面的接枝量为51％。

上述核酸适体探针中，所述聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的具体制备方法如下：将氧化石墨烯在二甲基甲酰胺中超声分散，得到分散液；将聚乙二醇与分散液中超声10min，再加入一定量的DCC/DMAP(DCC和DMAP物质的量比为5:1)作为催化剂，超声30min后，在60℃反应12h，将分散液在透析袋中透析1周，除去游离的PEG和催化剂，经冷冻干燥后，得到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。

本发明的最后一个目的是提供上述核酸适体或上述核酸适体的衍生物或上述核酸适体探针的新用途。

本发明提供了上述核酸适体或上述核酸适体的衍生物或上述核酸适体探针在如下(B1)-(B10)中至少一种中的应用：

(B1)识别或辅助识别转铁蛋白受体；

(B2)结合或辅助结合转铁蛋白受体；

(B3)检测或辅助检测待测样品中是否含有转铁蛋白受体；

(B4)制备检测或辅助检测待测样品中是否含有转铁蛋白受体的产品；

(B5)检测或辅助检测待测样品中转铁蛋白受体含量；

(B6)制备检测或辅助检测待测样品中转铁蛋白受体含量的产品；

(B7)检测或辅助检测表达转铁蛋白受体的肿瘤或肿瘤细胞；

(B8)制备检测或辅助检测表达转铁蛋白受体的肿瘤或肿瘤细胞的产品；

(B9)识别或辅助识别肿瘤或肿瘤细胞；所述肿瘤为乳腺癌和/或前列腺癌；

(B10)结合或辅助结合肿瘤或肿瘤细胞。

上述应用中，所述待测样品为细胞；所述细胞具体为耐紫杉醇人结肠癌细胞、人耐紫杉醇肺癌细胞、人结肠癌细胞、人宫颈癌细胞、乳腺癌细胞或肝癌细胞。

上述应用中，所述表达转铁蛋白受体的肿瘤或肿瘤细胞为转铁蛋白受体表达高的肿瘤或肿瘤细胞。

上述应用中，所述产品为试剂盒或探针或靶向物质。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的核酸适体具有高亲和力；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。采用本发明的核酸适体检测转铁蛋白受体时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，周期短，重现性好。

通过以下的详细说明和所附权利要求书将更明确本发明的其它特征和实施方式。

附图说明

图1为实施例1中随筛选轮数增加核酸适体的富集过程。峰形曲线表示耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T的细胞荧光分布情况；空白细胞作为对照，耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T与荧光素(FAM)标记的核酸文库，起始文库、第1轮、第3轮、第6轮、第9轮和第11轮的结合情况。

图2为实施例2中核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4对耐紫杉结肠癌细胞HCT-8T的结合曲线。

图3为实施例4中转铁蛋白受体抗体(anti-CD71)和核酸适体2共染多株肿瘤细胞的流式细胞实验结果。

图4为实施例5中siRNA干扰HeLa细胞表达转铁蛋白受体后，转铁蛋白受体抗体(anti-CD71)和核酸适体2对HeLa细胞染色的流式细胞实验结果。

图5为实施例6中核酸适体2及对照序列对前列腺癌癌组织切片荧光染色。

图6为实施例6中核酸适体2对良性增生正常乳腺组织和乳腺癌组织切片荧光染色。

图7为实施例7中核酸适体探针对不同浓度转铁蛋白受体的荧光响应的线性关系。

图8为实施例7中核酸适体探针对转铁蛋白受体响应的特异性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的核酸序列均由上海生工生物工程股份公司合成。

下述实施例中的铁蛋白受体抗体(anti-CD71(3B8 2A1))是ANTA CRUZ公司的产品，产品目录号为sc-32272。

下述实施例中的抗体同型对照(normal mouse IgG₁)是ANTA>

下述实施例中的藻红蛋白修饰的二抗(rabbit anti-mouse IgG-PE)是ANTA CRUZ公司的产品，产品目录号为sc-358926。

下述实施例中的人转铁蛋白是Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为T-4132。

下述实施例中的重组人转铁蛋白受体是Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为SRP6299。

下述实施例中的结合缓冲液(pH＝7.4)：含137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM>2PO₄、10mM>2HPO₄，25mM葡萄糖，1μg/ml>

下述实施例中的洗涤缓冲液(pH＝8.0)：含137mM NaCl、5mM MgCl₂、2.7mM>2PO₄、10mM>2HPO₄和25mM葡萄糖。

下述实施例中的探针缓冲液(pH7.4)：含10mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM KCl和2mM MgCl₂，其它为水。

下述实施例中的二环己基碳二亚胺(DCC)是于百灵威公司的产品，产品目录号：36650；4-二甲氨基吡啶(DMAP)是于百灵威公司的产品，产品目录号：117147。

实施例1、核酸适体的筛选和制备

一、耐紫杉醇结肠癌细胞和敏感型结肠癌细胞的培养

1、耐紫杉醇结肠癌细胞的培养

耐紫杉醇结肠癌细胞(HCT-8T)(购自江苏凯基生物技术股份公司(南京))用添加0.1μg/mL紫杉醇的RPMI 1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养，使用前接种到未添加紫杉醇的RPMI 1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)中培养一代。

2、敏感型结肠癌细胞的培养

敏感型结肠癌细胞(HCT-8)(购自江苏凯基生物技术股份公司(南京))用RPMI1640(含10％胎牛血清、1％青/链霉素)培养。

上述所有细胞均在培养箱中进行常规培养(37℃，5％CO₂)，每两天传代一次。

二、随机核酸文库的设计

设计如下两端包括20个固定核苷酸、中间包括30个核苷酸的随机文库：5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N₃₀-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'；其中，N₃₀代表30个A、T、C或G的随机核苷酸序列。

三、核酸适体的筛选

1、文库预处理

将18nmol随机核酸文库(步骤二中合成)溶于结合缓冲液，95℃变性5min，冰上冷却10min，室温复性放置30min，得到预处理后的ssDNA库。

2、反筛

在第2-11轮与耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T孵育前，取一皿敏感型结肠癌细胞HCT-8，将预处理后的ssDNA库(随着筛选压力增加而降低DNA量)加入细胞中，4℃振荡孵育1h(随筛选轮数增加而逐渐增加孵育时间)。

3、正筛

将反筛过程得到上清液与一皿耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T在4℃振荡孵育一段时间(随筛选轮数增加而逐渐减少孵育时间)。再用结合缓冲液清洗细胞几次之后，用细胞刮刀将细胞刮下来，加200μL水于95℃加热5min，洗脱结合在耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T上的ssDNA。然后将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增。PCR扩增的引物为：

5'-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3'；

5'-Biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3'。

PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃，5min。

用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。

为了提高核酸适体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛细胞HCT-8T和增加反筛细胞HCT-8的细胞数量，以增加筛选的压力。十一轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3'和5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3')进行PCR扩增，将第11轮PCR产物进行测序。最终选择的核酸适体1如下：

5'-AAGGAGCAGCGTGGAGGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTA GGGTGTGTCGTCGTGGT-3'(序列1)。

核酸适体随筛选轮数的富集过程如图1所示，与紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T结合的核苷酸序列在第1轮时就得到了明显富集，经过逐步加压后，结合序列在第3轮和第6轮进一步得到富集，筛选到第11轮时结合量略有降低，这可能与筛选压力过大有关。

4、核酸适体的优化

步骤3得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，通过荧光染料修饰，然后考察它们与耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T的结合能力，挑选结合能力最强的序列用于进一步的应用，优化后的序列长度只有35-59个核苷酸。

最终得到的截短核酸适体序列如下：

核酸适体2：

5’-AGGAGCAGCGTGGAGGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTAG GGTGTG-3’(序列2)；核酸适体2是将核酸适体1从5’端剪切掉1个核苷酸，从3’端剪切掉10个核苷酸，且保持核酸适体1的其他序列不变得到的核苷酸序列。

核酸适体3：

5’-AGGAGCAGCGTGGAGGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCC-3’(序列3)；核酸适体3是将核酸适体1从5’端剪切掉1个核苷酸，从3’端剪切掉20个核苷酸，且保持核酸适体1的其他序列不变得到的核苷酸序列。

核酸适体4：

5’-GTGGAGGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTAGGGTGTG-3’

(序列4)；核酸适体4是将核酸适体1从5’端剪切掉10个核苷酸，从3’端剪切掉10个核苷酸，且保持核酸适体1的其他序列不变得到的核苷酸序列。

核酸适体5：

5’-GTGGAGGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCC-3’(序列5)；核酸适体5是将核酸适体1从5’端剪切掉10个核苷酸，从3’端剪切掉20个核苷酸，且保持核酸适体1的其他序列不变得到的核苷酸序列。

核酸适体6：

5’-GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCC-3’(序列6)；核酸适体6是将核酸适体1从5’端剪切掉15个核苷酸，从3’端剪切掉20个核苷酸，且保持核酸适体1的其他序列不变得到的核苷酸序列。

从优化结果可知(有无结果)，核酸适体6与细胞结合亲和力最强、荧光强度最高；其次是核酸适体5，而后从结合效果由高到低排列依次是核酸适体2、核酸适体4和核酸适体3。

实施例2、核酸适体与耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T的结合能力

分别将实施例1获得的核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4、核酸适体5和核酸适体6在5’端标记荧光素(FAM)分子，分别得到FAM标记核酸适体2、FAM标记核酸适体3、FAM标记核酸适体4、FAM标记核酸适体5和FAM标记核酸适体6(上海生工公司合成)。用结合缓冲液溶解各单链DNA(FAM标记DNA序列)，依据紫外吸收标定浓度后，95℃加热5min，冰上放置10min，室温放置30min。变性-再复性后的DNA用结合缓冲液稀释成1nmol/L，2nmol/L，5nmol/L，10nmol/L，20nmol/L，50nmol/L，100nmol/L和200nmol/L浓度梯度的DNA溶液(分子探针溶液)。取一皿对数生长期的耐紫杉醇结肠癌细胞，用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份，分别与上述分子探针溶液在冰上孵育30min后，用洗涤缓冲液洗涤两遍，用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。以细胞表面平均荧光强度和核酸适体浓度作图，利用公式Y＝BmaxX(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数。

核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4、核酸适体5和核酸适体6对耐紫杉醇结肠癌细胞HCT-8T的结合曲线见图2所示。图2中，横坐标为单链DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为扣去细胞自发荧光值后的平均荧光强度。上述核酸适体2-6的平衡解离常数如表1所示。结果表明，核酸适体2、核酸适体3、核酸适体4、核酸适体5和核酸适体6的平衡解离常数均在纳摩尔级，亲和力均较高。

表1、核酸适体2-6的平衡解离常数

名称结合解离常数(nmol/L)核酸适体26.48±1.12核酸适体319.5±3.17核酸适体45.42±1.04核酸适体56.76±1.67核酸适体65.40±0.721

实施例3、核酸适体2特异性识别并结合转铁蛋白受体的质谱鉴定

一、同位素标记的Jurkat E6-1细胞及核酸适体2衍生物的制备

1、同位素标记的Jurkat E6-1细胞的制备

重型同位素标记的Jurkat E6-1细胞(医学科学院基础医学研究所(北京))使用含重型同位素标记的赖氨酸([¹³C₆,¹⁵N₂]-L-赖氨酸)和重型同位素标记的精氨酸([¹³C₆]-L-精氨酸)的RPMI>12C₆,¹⁴N₂]-L-赖氨酸)和轻型同位素标记的精氨酸([¹²C₆]-L-精氨酸)的PMI>

2、核酸适体2衍生物的制备

(1)生物素标记的核酸适体2

生物素标记的核酸适体2为在核酸适体2的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解生物素标记的核酸适体2，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

(2)生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)

生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解L45-Bio，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

二、核酸适体2特异性识别并结合转铁蛋白受体的质谱鉴定

1、核酸适体2靶标蛋白的提取

(1)分别取2×10⁸个指数生长期的重型同位素标记的Jurkat>

(2)PBS洗涤2遍，加入1mL的细胞裂解液，孵育1小时。

(3)2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(GE公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时，提取靶标蛋白。

(4)用PBS洗涤上述步骤(3)孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤5次，分别得到生物素标记的核酸适体2提取的重型同位素标记的蛋白、对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白、生物素标记的核酸适体2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白。

2、正向和反向实验

(1)正向实验：将生物素标记的核酸适体2提取的重型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适体2提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系。

(2)反向实验：将生物素标记的核酸适体2提取的轻型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适体2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系。

3、蛋白的酶解和LC-MS鉴定

(1)DTT还原：分别向生物素标记的核酸适体2提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系、生物素标记的核酸适体2提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系中加入200μL 20mM二硫苏糖醇(DTT)，56℃反应45min。

(2)IAA烷基化：将步骤(1)的产物离心，弃上清(去除DTT)，向沉淀中分别加入200μL 55mM碘乙酰胺(IAA)，在37℃避光反应30min。

(3)将步骤(2)的产物离心，弃上清(去除IAA)，向沉淀中加入5μg质谱用胰蛋白酶(Promega公司，产品目录号：V5111)，37℃酶切过夜，得到酶切后的多肽。

(4)酶切后的多肽经过真空浓缩后，加入100ul水，利用Ziptip C₁₈微柱脱盐。质谱分析前，放置-20℃冰箱。

(5)利用LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)对步骤(4)的产物进行分析鉴定，得到原始的质谱数据。

(6)数据搜索分析

利用MaxQuant搜索引擎(版本号：1.3.0.5)将步骤(5)获得的原始的质谱数据在IPI蛋白数据库(版本号：3.68)中进行检索。数据库搜索的一些参数如下：固定化修饰为半胱氨酸上的烷基化修饰，可变修饰为甲硫氨酸上的氧化修饰和蛋白质N端的乙酰化修饰。允许2个漏切位点，母离子容错量为20ppm，MS/MS碎片离子质量误差为0.5Da。对于鉴定候选的蛋白，有2个或多于2个的独特的多肽鉴定出，且后验标准误差(PEP)小于10^-5。候选蛋白需在正向实验和反向实验中同时被鉴定出。

结果表明：SILAC(稳定同位素标记技术)实验鉴定出24个蛋白，核酸适体2和随机对照核酸序列L45提取蛋白丰度比值大于2的只有转铁蛋白受体蛋白，其余23个蛋白的丰度比值都小于2。说明核酸适体2可以特异性的识别并结合转铁蛋白受体蛋白。

实施例4、核酸适体2和转铁蛋白受体抗体(anti-CD71)共染细胞株

一、细胞株的预处理及核酸适体2衍生物的制备

1、细胞株的预处理

细胞来源：人急性T细胞白血病细胞(Jurkat E6-1，产品目录号：3111C0001CCC000075)、人宫颈癌细胞(HeLa，产品目录号：3111C0001CCC000011)、人肝腹水腺癌细胞(SK-HEP-1，产品目录号：3111C0002000000060)和荷尔蒙依赖性人乳腺癌细胞(MCF-7，产品目录号：3111C0001CCC000013)，上述细胞均购自医学科学院基础医学研究所(北京)。耐紫杉醇人结直肠癌细胞(HCT-8T，产品目录号：KG332)和人耐紫杉醇肺癌细胞(A549T，产品目录号：KG124)购自江苏凯基生物技术股份公司(南京)。

取如下生长对数期的各细胞一皿：人耐紫杉醇肺癌细胞(A549T)、人耐紫杉醇结肠癌细胞(HCT-8T)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝腹水腺癌细胞(SK-HEP-1)，用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍，分为若干份，每份细胞数为5×10⁴个；悬浮生长的人白血病细胞(Jurkat>4个。

2、核酸适体2衍生物的制备

(1)花菁染料(Cy5)标记的核酸适体2

花菁染料(Cy5)标记的核酸适体2为在核酸适体2的5’端偶联花菁染料(Cy5)基团得到的，用结合缓冲液溶解花菁染料(Cy5)标记的核酸适体2，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。

(2)花菁染料(Cy5)标记的对照序列

花菁染料(Cy5)标记的对照序列为在对照序列的5’端偶联花菁染料(Cy5)基团得到的，用结合缓冲液溶解花菁染料(Cy5)标记的对照序列，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。对照序列的核苷酸序列：AGAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTGGCAAGTATTGTGTGCGCTGTTC。

二、核酸适体2的特异性检测

为比较核酸适体2和单克隆抗体对细胞表面转铁蛋白受体的特异性响应能力，将上述步骤一预处理的6株细胞分别进行如下处理，每个处理设置三个重复：

处理1：6株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入花菁染料(Cy5)标记的核酸适体2(终浓度为200nmol/L)和转铁蛋白受体抗体(anti-CD71，稀释倍数1:20)。

处理2：6株细胞每株分别取5×10⁴个细胞分散于结合缓冲液中，然后加入花菁染料(Cy5)标记的对照序列(终浓度为200nmol/L)和同型对照(IgG₁，稀释至浓度与转铁蛋白受体抗体浓度一致)。

分别将处理1和处理2得到的混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，再加入藻红蛋白修饰的二抗，在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍后用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第二通道和第四通道的荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。

流式细胞仪检测结果如图3所示。在流式细胞散点图中，横坐标表示流式细胞仪第四通道的荧光强度，即核酸分子所修饰的染料分子Cy5的荧光强度；纵坐标表示流式细胞仪第二通道的荧光强度，即抗体(anti-CD71)或同型对照所结合的藻红蛋白的荧光强度。根据每一株细胞处理2中对照序列在第四通道的荧光强度和抗体同型对照在第二通道的荧光强度，设定十字象限门，使处理2中95％的细胞均处于如下Q4区内。

依据结果，在散点图中设置的十字象限门将坐标区域划分为四个区域：

左上角即第二通道荧光强度大而第四通道荧光强度小，即抗体阳性、核酸适体阴性，记为Q1区；

右上角即第二通道荧光强度大同时第四通道荧光强度大，即抗体阳性、核酸适体阳性，记为Q2区；

右下角即第二通道荧光强度小而第四通道荧光强度大，即抗体阴性、核酸适体阳性，记为Q3区；

左下角即第二通道荧光强度小同时第四通道荧光强度小，即抗体阴性、核酸适体阴性，记为Q4区。

以细胞与核酸适体或抗体结合后荧光强度超过处理2的荧光强度为阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体或抗体与细胞结合能力强弱(-：<15％；﹢:15-30％；﹢﹢:30-65％；﹢﹢﹢:65-85％；﹢﹢﹢﹢:>85％)。从图3可以看到，人耐紫杉醇结肠癌细胞(HCT-8T)、乳腺癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(SK-HEP-1)和人白血病细胞(Jurkat 6E-1)进行处理1的细胞样品在抗体阳性和核酸适体阳性的Q2区的细胞数均大于80％；人宫颈癌细胞(HeLa)进行处理1的细胞样品在抗体阳性和核酸适体阳性的Q2区的细胞数大于50％。而人耐紫杉醇肺癌细胞(A549T)进行处理1的细胞样品有80％以上的细胞处在抗体阴性和核酸适体阴性的Q4区，说明A549T细胞膜表面转铁蛋白受体的表达量较低。

上述结果说明核酸适体2与单克隆抗体对细胞膜表面的转铁蛋白受体具有同样的响应性，二者对于转铁蛋白受体表达高的细胞响应都较高，对转铁蛋白受体表达低的细胞均无响应。且与抗体相比，本发明的核酸适体合成成本更低，周期短；在进行细胞表面转铁蛋白受体的检测时，操作更为简单、迅速，重现性好。

实施例5、核酸适体和转铁蛋白受体抗体检测siRNA干扰HeLa细胞转铁蛋白受体的表达水平

一、核酸适体2衍生物及siRNA干扰后的HeLa细胞的制备

1、核酸适体2衍生物的制备

(1)荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2

荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2为在核酸适体2的5’端偶联荧光素(6-FAM)基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。

(2)荧光素(6-FAM)标记的对照序列

荧光素(6-FAM)标记的对照序列为在对照序列的5’端偶联荧光素(6-FAM)基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(6-FAM)标记的对照序列，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。对照序列的核苷酸序列：AGAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTGGCAAGTATTGTGTGCGCTGTTC。

2、siRNA干扰后的HeLa细胞的制备

(1)转染试剂的制备

转铁蛋白受体的siRNA(TfR3，正义链：5'-GCUGGUCAGUUCGUGAUUATT-3'；反义链：5'-UAAUCACGAACUGACCAGCTT-3')和siRNA阴性对照序列(NC)均合成于上海生工生物工程股份公司。根据脂质体转染试剂盒生产厂家提供的方法将脂质体转染试剂分别作为siRNA序列和siRNA阴性对照序列的载体，TfR3序列和NC序列均用DEPC水溶解配制成20μM的母液，分别得到可用于转染的含有siRNA序列(TfR3)的转染试剂和对照RNA序列(NC)的转染试剂。脂质体转染试剂盒(RNAiMAX转染试剂)是Thermo Fisher Scientific公司的产品。

(2)siRNA干扰后的HeLa细胞的获得

HeLa细胞均匀地铺种于6孔板中，每孔2mL培养基(DMEM培养基，Gibco)中含约1×10⁵个细胞，生长过夜后，如下处理：

处理一、2ml新鲜培养基中加入250ul含有对照RNA序列(NC)的转染试剂；

处理二、2ml新鲜培养基中加入250ul含有siRNA序列(TfR3)的转染试剂。

每种处理方式重复三个孔，六孔板中的细胞在孵箱内继续培养48h，分别得到siRNA干扰后的HeLa细胞和对照RNA干扰后的HeLa细胞。然后将六孔板中细胞用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍，细胞分散于结合缓冲液中，每孔的细胞分为四份。

二、siRNA干扰后的HeLa细胞的转铁蛋白受体的表达水平检测

上述步骤一处理后六孔板每孔的四份细胞悬液分别进行如下处理：

处理一、细胞悬液中加入荧光素(6-FAM)标记的对照序列(终浓度为200nmol/L)；

处理二、细胞悬液中加入荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2(终浓度为200nmol/L)；

处理三、细胞悬液中加入同型对照(IgG₁，稀释至浓度与转铁蛋白受体抗体浓度一致)；

处理四、细胞悬液中转铁蛋白受体抗体(anti-CD71，稀释倍数1:20)。

处理一和处理二的混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍；细胞用洗涤缓冲液重悬，BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第一通道荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。处理三和处理四的混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，再加入藻红蛋白修饰的二抗，在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍；洗涤后的细胞用洗涤缓冲液重悬，BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第二通道的荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。

流式细胞实验结果见图4。从图4可以看出，核酸适体2对siRNA干扰HeLa细胞的结合量减少；转铁蛋白受体抗体(anti-CD71)对siRNA干扰HeLa细胞的结合量也减少；上述结果说明核酸适体2与转铁蛋白受体抗体对细胞膜表面的转铁蛋白受体的表达量具有同样的响应性，可以替代转铁蛋白受体抗体使用。且与抗体相比，本发明的核酸适体合成成本更低，周期短；在进行细胞表面转铁蛋白受体的检测时，操作更为简单、迅速，重现性好。

实施例6、核酸适体2与乳腺癌和前列腺癌组织切片荧光染色

用荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2对乳腺癌患者和前列腺癌患者组织切片染色，进行转铁蛋白受体的检测与诊断。

一、核酸适体2衍生物的制备及乳腺癌患者和前列腺癌患者组织切片的预处理

1、核酸适体2衍生物的制备

(1)荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2

荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2为在核酸适体2的5’端偶联荧光素(6-FAM)基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。

(2)荧光素(6-FAM)标记的对照序列

荧光素(6-FAM)标记的对照序列为在对照序列的5’端偶联荧光素(6-FAM)基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(6-FAM)标记的对照序列，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。对照序列的核苷酸序列：AGAGCAGCGTGGAGGATAGTTGGGGTTTGGCAAGTATTGTGTGCGCTGTTC。

2、乳腺癌患者组织切片的预处理

分别以前列腺癌患者肿瘤组织(来源于中山大学第三附属医院，所有患者均经临床诊断确定，患者知情)；乳腺增生(良性病变)患者组织和乳腺癌患者肿瘤组织(恶性病变，HER2阳性)(来源于中国人民解放军总医院医院，所有患者均经临床诊断确定，患者知情)为实验材料，进行如下步骤的处理：

(1)组织切片脱蜡水化

1)烤片：组织切片于60℃烤箱中烘烤20min；

2)立刻置于第一缸二甲苯中15min，而后置入第二缸二甲苯中15min；

3)依次放置入无水乙醇中10min，95％乙醇5min，70％乙醇5min；

4)自来水冲洗5min(缓慢流动的水盆中)，蒸馏水润洗一遍，得到脱蜡水化的组织切片。

(2)切片染色抗原修复

利用微波热修复法修复抗原，具体步骤如下：取适量TE buffer(EDTA 0.292g和Tris-base 6.05g溶于1000mL蒸馏水，pH＝8.0)，将脱蜡水化的组织切片放入盛有修复液(TE buffer)的容器中，置微波炉内加热至沸腾，停止加热，使容器内液体温度下降，保持在95℃～98℃之间并持续15min。取出容器，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗后，再用洗涤缓冲液浸泡，5min×3次(保证第一次浸泡的是新配的洗涤缓冲液)，得到修复后的组织切片。

二、核酸适体孵育染色步骤

1、将步骤一的2中的修复后的组织切片先与含20％FBS和1mg/ml鲱鱼精DNA的结合缓冲溶液室温孵育60min；

2、然后与200μL含250nM荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2的结合缓冲溶液室温孵育60min，对照序列染色方法相同，空白不染色；

3、用洗涤缓冲液洗涤三次；

4、干燥，抗淬灭封片剂封片，利用激光共聚焦扫描显微镜观察。

前列腺癌患者肿瘤组织的显微镜观察结果如图5示，从图5可知，核酸适体2可以与前列腺癌组织切片结合，而对照序列几乎不能与前列腺癌组织切片结合。说明核酸适体2对前列腺癌具有良好的识别检测能力。

良性增生的乳腺组织和乳腺癌患者肿瘤组织(恶性病变)的显微镜观察结果如图6示，从图6可看到，良性增生的乳腺组织基本不能与核酸适体2结合，而乳腺癌患者肿瘤组织(恶性病变)则与核酸适体2有较强结合。说明核酸适体2对良性增生的乳腺组织和乳腺癌患者肿瘤组织(恶性病变)具有良好的识别检测能力，能够区分乳腺增生(良性病变)和肿瘤组织(恶性病变)。

上述结果表明，本发明的核酸适体可以很好地识别肿瘤的组织切片。

实施例7、核酸适体2与石墨烯构建检测转铁蛋白受体的核酸适体探针

一、核酸适体探针的设计原理及制备

1、核酸适体探针的设计原理

探针原理：荧光基团修饰的核酸适体2与聚乙二醇修饰的氧化石墨烯(PEG-GO)混合后，由于非共价键合作用的存在使核酸分子能够负载在聚乙二醇修饰的氧化石墨烯表面并导致被负载的核酸分子上修饰的荧光基团发生荧光淬灭作用。当体系中再加入转铁蛋白受体时，转铁蛋白受体与被负载的核酸适体2发生特异性结合使核酸适体2从石墨烯上游离出来，从而使所修饰的荧光基团恢复荧光。通过检测所恢复的荧光强度，可以定量转铁蛋白受体的含量，从而达到检测转铁蛋白受体的目的。

2、核酸适体探针的制备

(1)聚乙二醇修饰的氧化石墨烯的制备

将氧化石墨烯在二甲基甲酰胺(DMF)(购自于国药集团化学试剂北京有限公司，产品目录号：ZAGA04645)中超声分散，得到1mg/mL的分散液，将200mg聚乙二醇(PEG2000)(购自于百灵威公司，产品目录号：B22181)与50mL分散液在圆底烧瓶中超声10min，再加入一定量的DCC/DMAP(DCC和DMAP物质的量比为5:1)作为催化剂，超声30min后在60℃反应12h，将分散液在透析袋中透析1周，除去游离的PEG和催化剂，经冷冻干燥后，得到聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。经结构表征和热失重分析表明，PEG2000在氧化石墨烯表面的接枝量为51％。

(2)核酸适体预处理

荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2为在核酸适体2的5’端偶联荧光素(6-FAM)基团得到的，用结合缓冲液溶解荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2，依据紫外吸收标定浓度(20μM)后，95℃加热变性5min，冰上放置10min，室温放置30min。

(3)核酸适体探针的制备

将荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2、聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和探针缓冲液(pH7.4)混匀(荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2、聚乙二醇修饰的氧化石墨烯和探针缓冲液(pH7.4)的配比为1nmol：150mg：1L)，得到核酸探针体系，室温下孵育1h，待体系稳定后4℃保存。聚乙二醇修饰的氧化石墨烯在核酸探针体系中的终浓度为150ug/mL，荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2在核酸探针体系中的终浓度为100nM)。

二、核酸探针对不同浓度转铁蛋白受体的响应

向步骤一构建好的核酸探针体系中分别加入不同浓度的转铁蛋白受体，使体系中转铁蛋白受体终浓度为：0.2ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、2ug/mL、5ug/mL、10ug/mL，在室温下孵育30min，然后用荧光仪FL4600fluorescence spectrometer(Hitachi,Japan)记录荧光光谱，激发波长480nm，发射波长500-600nm，取最大发射波长530nm处的荧光值为响应荧光值。

核酸适体探针对不同浓度转铁蛋白受体的响应结果见图7，核酸探针对转铁蛋白受体有很好的响应，荧光信号随着转铁蛋白受体浓度增大而增大。在0.2ug/mL-5ug/mL范围内，核酸适体探针对转铁蛋白受体的浓度有很好的线性关系。

三、核酸适体探针的特异性

向步骤一构建好的核酸探针体系中分别加入人重组转铁蛋白受体(TfR)(购自于Sigma-Aldrich公司，产品目录号为SRP6299)、人血清白蛋白(HSA)(购自于购自于上海源叶生物公司，产品目录号为S24985)、牛血清白蛋白(BSA)(购自于上海源叶生物公司，产品目录号为S12012)、溶菌酶(Lys)(购自于上海源叶生物公司，产品目录号为MHB6267)、α-糜蛋白酶(chy)(购自于国药集团化学试剂北京有限公司，产品目录号为ZD605453)和凝血酶(Thr)(购自于国药集团化学试剂北京有限公司，产品目录号为zd701139)，使其在体系中的浓度分别为人重组转铁蛋白受体(TfR)2ug/ml，人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(Lys)和α-糜蛋白酶(chy)均为100ug/ml，凝血酶(Thr)18.7ug/ml；在室温下孵育30min，然后用荧光仪FL4600 fluorescence spectrometer(Hitachi,Japan)记录荧光光谱，激发波长480nm，发射波长500-600nm，取最大发射波长530nm处的荧光值为响应荧光值。

核酸适体探针对不同种类的蛋白质响应结果如图8，从图8中可看到，核酸适体探针对转铁蛋白受体有很好的响应，而对其它的蛋白质响应较弱；说明本发明的核酸适体探针具有很好的特异性。