一株具有赭曲霉毒素A降解能力的米曲霉菌株及其降解应用

摘要

本发明具体涉及一株高效赭曲霉毒素A(OTA)降解菌及其降解条件优化的方法。本发明高效OTA降解菌，代号为M30011，经鉴定为米曲霉菌Aspergillus oryzae，保藏于中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12371，保藏时间：2016年4月15日；本发明菌株经降解条件优化后，得到最优降解条件为培养温度30℃、初始pH为8.0，接种量为10

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有高效降解赭曲霉毒素A能力的米曲霉菌株及其降解应用。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)产生的次级代谢产物。它对肾脏和肝脏造成损害，还能致畸、致癌、致突变以及破坏免疫系统。1993年，国际癌症研究机构(IARC)将其定义为2B类致癌物。

由于OTA属于积累型有毒化合物，并且能够直接污染谷类、水果等农作物，人和动物通过摄入污染的动植物性食物而吸收OTA计入体内。相关研究表明OTA的主要靶器官是肝和肾，用HPLC法检测发现OTA进入小鸡体内后广泛分布于各个器官，但以肝和肾居高。此外，OTA还具有致畸、致癌、致突变及破坏免疫系统的毒性。OTA产生菌广泛分布于自然界，粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、啤酒、咖啡、可可、巧克力、罐头食品、食用油、橄榄、豆制品等多种农产品及食品均有可能被OTA污染。人类通过食用污染OTA的农作物或动物组织而摄入OTA，从而受到OTA的危害。

鉴于OTA在食品中普遍存在且污染所造成的巨大危害，许多国家都已经限定了食品中OTA的最高含量，并出台了相关法规标准监控其在食品和饲料内的污染情况，我国也于2011年新颁布的《食品中真菌毒素限量》国家标准GB 2761-2011中，添加了关于谷物及豆类制品中OTA强制限量5μg/kg的规定。随后于2013年公布了《葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量(征求意见稿)》。由此可见我国已经开始重视OTA对食品安全所造成的危害。

我国目前尚处于OTA真菌毒素污染来源及其规律调查的初级研究阶段，所以相关的风险监控体系也还没有建立。这成为我国食品产业发展的隐患。近年来，欧盟及其他一些发达国家对我国还设置绿色贸易壁垒，不断提高食品中OTA检测标准，导致我国出口农产品因OTA等真菌毒素污染物超标而被退回的事件时有发生。越来越严峻的贸易技术壁全和食品安全问题，使得提高OTA污染的防控水平以及对清除食品中OTA方法的研究成为刻不容缓的任务。

OTA易在食品中存在且化学性质稳定不易被加工和其它理化因素所影响，亟需一种实际可行的解毒方式来应对越来越严峻的食品安全形势和贸易技术壁垒。真正有效并有应用意义的脱毒方法应该达到以下几点要求：通过脱毒处理把真菌毒素灭活或破坏，使之转化成无毒的化合物；将真菌孢子和菌丝体破坏，从而使新的毒素不能形成；脱毒的同时保持食品或饲料的营养价值和物理性质，并且要经济合理。普遍采用的理化处理OTA以及生物吸附处理OTA的方式都不能实际应用于食品工业中OTA污染的脱除。而生物降解OTA的方法与理化脱毒法即生物吸附法相比，具有较高的脱毒专一性、较强的亲和性、能够将剧毒化合物转化为无毒或低毒性化合物，并且具有经济高效。不可逆、不破坏产品的营养价值，可以避免二次污染等特点，因此生物降解OTA法具有其他脱毒方法不可比拟的优势，有着广阔的应用前景。

目前，生物降解OTA的研究已经取得了较好的进展，但从理论研究到实际应用还需要做大量的探索。目前关于一些生物降解OTA的菌株报道中能起到实质性脱毒效果的菌种资源依然较少，具有高效降解能力的微生物菌种依然是稀缺资源。许多研究报道中，大部分脱毒菌种存在脱毒不彻底、毒素代谢产物依然剧毒或脱毒效率不高等问题。此外，国外绝大部分降解效果较好的脱毒菌种均已申请专利保护，我国的高效降解菌种资源非常稀缺，高效降解OTA菌种筛选工作是当前生物脱毒技术重要的研究方向之一。现阶段菌种降解OTA的周期较长，效率不高。因此寻找一种高效、廉价的酶和微生物及其制剂，缩短降解OTA周期，是生物降解OTA技术能够获得广泛应用的关键点。

附图说明

本发明涉及的高效OTA降解菌的代号为M30011，经鉴定为米曲霉菌Aspergillus oryzae。保藏单位名称：中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏编号：CGMCC No.12371；保藏日期：2016年4月15日；分类命名：米曲霉Aspergillus oryzae。

图1是TLC法定性检测菌株降解OTA能力的结果

图2是菌株M30011降解OTA的液相色谱图。

图3是菌株M30011在鉴定培养基上的形态

图4是菌株M30011的电镜形态观察

图5是菌株M30011的系统发育树

图6是米曲霉降解OTA各因素间交互作用的响应面及等高线图。(a)温度与初始pH的交互作用，(b)初始pH与接种量的交互作用，(c)温度与接种量的交互作用

具体实施方式

本发明以下结合具体实例作进一步说明，但并不是限制本发明。下面结合附图对本发明进一步说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条，或按照试剂盒生产商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

实验试剂：赭曲霉毒素A(OTA)购自北京泰乐祺，甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)及乙酸(色谱纯)购自Merk公司，甲苯(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、甲酸(分析纯)、乙醚(分析纯)及二氯甲烷(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。纵向展剂：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝6∶3∶1.4；

培养基：缺陷培养基：KH₂PO₄0.25g；NH₄NO₃1.0g；MgSO₄·7H₂O；FeSO₄0.001g；20琼脂；pH＝7.0；121℃，20min灭菌；L-β苯丙氨酸或香豆素1g过滤至培养基中。

基础培养基：牛肉膏3g；大豆蛋白胨5g；NaCl 10g；葡萄糖6g；水1L；pH＝7。121℃，20min灭菌待用。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母膏、酵母提取物、胰蛋白胨、无菌生理盐水、CA培养基(查氏琼脂培养基)、CYA培养基、MEA培养基(麦芽提取物琼脂培养基)等购自北京双旋微生物培养基制品厂。

菌株的基因组18S rDNA，通用PCR引物序列为：

IST1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

IST4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

实施例1：高效降解OTA米曲霉菌株筛选鉴定

1.1菌株的筛选

用5mL的无菌生理盐水洗涤0.5g土壤样品，振荡混匀，静置30min；取上清液1mL，倍比稀释，涂布于缺陷型固体培养基平板，30℃培养；培养一段时间后，挑取单菌落，划线纯化；将纯化的菌株在以L-β苯丙氨酸或香豆素为唯一碳源的缺陷培养基中培养三代；接种于PDA培养基内保存；之后用于降解OTA实验。

由于商品化的OTA毒素十分昂贵，以OTA为唯一碳源进行筛选的成本太大，并且在大量使用后必须进行脱毒处理，以防止对环境造成污染，本研究主要采用以L-β苯丙氨酸或香豆素为唯一碳源的缺陷型固体培养基，对不同地区100余份土样中的微生物进行初步筛选；共获得80株细菌和50株霉菌。

1.2菌株降解OTA实验

将筛选到的霉菌制备成孢子菌悬液，浓度约为10⁶个/ml。将灭菌的培养基分装于50mL的离心管(灭菌)中，每管加3.7mL。再向每管中添加1.2mL的10μg/mL的OTA溶液与100μL孢子菌悬液；于30℃摇床中培养8d。

同时设置对照组，空白对照体系组分为3.8mL的培养基和1.2mL 10μg/mL的OTA；阳性对照体系组分为3.8mL次氯酸钠溶液和1.2mL 10μg/mL的OTA。将筛选到的菌株接种至含有1.2μg OTA的培养基中，于30℃、150r/min摇床中培养8天；然后用薄层层析法(TLC)定性检测该菌株是否具有降解OTA的能力。TLC方法为：OTA的提取浓缩：经过降解实验后，用5mL的二氯甲烷提取，振荡5min，静置10min；取所有的有机层于新的10mL的离心管内；用氮吹仪将二氯甲烷蒸干；之后用50μL的乙腈溶液重溶；上样：用进样针上样10μL；展开：首先是横向展开，在展开槽内倒入10mL横展剂，先将硅胶板展开至其边缘，取出通风挥发溶剂1～2min后；再将该硅胶板靠近标准点的一边置于同一展开槽内的溶剂中横展，展至硅胶板端过1min，取出通风挥发溶剂2～3min。其次是纵向展开，在另一展开槽内倒入10mL纵向展剂，将经横展后的硅胶板纵展至板边缘。取出通风挥发至板面无酸味(约5～10min)；观察：将硅胶板置于365nm波长紫外光灯下观察。

图1所示，为用TLC法定性检测菌株降解OTA能力的结果。同时设置空白对照和阳性对照。由于OTA在365nm紫外照射下会出现荧光现象，因而可以根据图中有无荧光现象来判断菌株是否具有降解OTA的能力。

高效液相色谱法定量菌株降解OTA能力。样品前处理方法如下：取1ml样液，加入3ml甲醇水(70∶30)，振荡1h，将振荡液全部过M290净化柱，收集过柱液，将过柱液过0.22um滤膜。液相测定条件为：色谱柱C18 150mm x 4.6mm，流动相乙腈∶冰乙酸(水∶乙酸)＝48∶52(51∶1)，流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测器采用荧光检测器：激发波长EX＝333、发射波长EM＝460，进样量20μL。然后根据色谱峰面积与OTA浓度关系建立的OTA标准曲线。通过以下OTA降解率计算公式计算OTA的降解率。

OTA降解率(％)＝(C-C0)/C×100％ (1)

(1)式中：C为初始OTA的浓度(μg/mL)；C0为8天后样品中OTA的浓度(μg/mL)。

将筛选到的霉菌制备成孢子菌悬液，浓度约为10⁶个/ml。将灭菌的培养基分装于50mL的离心管(灭菌)中，再向每管中添加100μL的10μg/mL的OTA溶液与100μL孢子菌悬>

在确定的液相条件下，OTA的出峰时间是8min左右。根据相应的峰面积以及OTA的标准曲线可以得出OTA的浓度，即菌株处理样品中残留OTA的浓度。根据公式(1)得出M30011菌株对OTA的降解率。如图3为4株菌株M00120、M30011、M40011、M10012以及2株细菌降解OTA的降解率为81％。

1.3菌株鉴定

将筛选到具有高效降解OTA的菌株M30011点种于PDA培养基平板以及3种标准鉴定培养基上，分别在5℃、25℃、30℃和37℃下培养14d，每天观察其菌落生长的速度、质地及颜色等特征。如图3所示为M30011在25℃下第七天生长状态。通过培养特征鉴定，该菌株在查氏琼脂(CA)、查氏酵母膏琼脂(CYA)、麦芽汁琼脂(MEA)三种不同鉴定培养基上的生长情况与《中国真菌志》真菌鉴定手册中曲霉属中的米曲霉培养特征的描述基本一致，因此初步判定该菌株为米曲霉。

将菌株插片培养，30℃培养4d，在显微镜下进行菌株形态特征的观察。电镜扫描前样品的制备：将菌种接种于2mm厚的平板培养基上，培养4d，分生孢子结构正好成熟时，切3～4mm见方并带有分生孢子结构的琼脂块一起放入无菌容器，用2％戊二醛固定1～2h；然后用30％、50％、70％、95％和100％的乙醇由低至高的浓度进行梯度脱水，每次5min，同一浓度脱水两次。样品固定完成，送至电镜室喷金扫描电镜，观察菌丝及孢子等形态特征。M30011形态如图4所示。分生孢子头特征明显，分生孢子头球形，后近辐射状、散乱。产孢结构双层。分生孢子头表面产生许多小梗，小梗上着生成串的的分生孢子。分生孢子球形至近球形，直径5-8μm。

在M30011菌株形态学鉴定基础上进一步进行18S rDNA序列分析。挑取目标菌株的孢子接种到DNA提取用液体培养基中培养2d，过滤获得菌丝球，液氮冷冻研磨，然后根据霉菌DNA提取通用试剂盒的提示进行基因提取，获得基因片段，并采用1.5％的琼脂糖电泳检测提取效果。以上述提取的目标菌株的基因组DNA为模板扩增18S rDNA，以通用PCR引物IST1、IST4进行扩增。根据测序结果，利用BLAST程序将18S rDNA的PCR扩增产物测序结果在NCBI上比对，然后从GenBank数据库中搜索有关种的基因序列数据，用MEGA 5中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。如图5所示为M30011菌株的系统发育树。序列分析表明，M30011菌株与Aspergillus oryzae达到100％的序列同源性；通过菌体 培养和形态特征对比和18S rDNA序列分析可以确定目的M30011菌株属于Aspergillus oryzae。

实施例2：米曲霉菌株降解OTA的应用条件

2.1米曲霉菌株降解OTA的单因素条件

经过单因素试验对米曲霉菌株降解OTA的应用条件进行了初步优化确定碳氮源种类及其浓度、培养基初始pH、温度、转速以及接种量等因素对菌株发酵降解OTA的影响，最终确定以蔗糖(2％)及酵母膏(0.6％)配制发酵培养基时，初始pH调制7.0，菌种接种量为10³个/mL，置于30℃、150r/min中培养48h，OTA的降解率为最高，达97.81％。随后在初步确定米曲霉菌株降解OTA的应用条件基础上，以其中关键控制因素：温度(A)、接种量(B)及pH(C)为变量，OTA降解率(％)为响应值，对菌株发酵产酶条件进行响应面优化分析。

2.2响应面法优化米曲霉降解OTA效率

根据单因素实验的结果，选择对M00120降解OTA影响较大的因素，采用响应面法对米曲霉降解OTA的效率进行优化。

根据单因素实验结果，选择关键控制因素：温度(A)、接种量(B)及pH(C)为变量，OTA降解率(％)为响应值，对M30011菌株发酵产酶条件进行响应面优化分析，具体实验结果如表1所示。

表1 Box-Behnken实验设计与结果

Table1 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.1回归方程及交互作用分析

利用Design-Expert软件对数据进行二次多项回归拟合，获得响应值OTA降解率(Y)对初始pH、温度及接种量的二次多项回归方程：

OTA interpretion＝+72.43+4.34*A+4.65*B-2.00*C+2.34*A*B-2.63*A*C+1.34*B*C-7.81*A²-7.97*B²-12.79*C²

由回归模型显著性检验结果及方差分析可知，模型的p＞F值为0.0152小于0.05，表明模型显著。当噪音值大于4时，说明响应面模型拟合度理想，而本试验中噪音比数值为6.457，说明此模型可操作性强，可用此模型对试验进行预测和分析。本实验失拟项的p值为0.8147＞0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。

响应面是响应值在各试验因素交互作用下得到的结果所构成的三维空间曲面。各因素间交互作用的响应面及等高线图如附图所示。

图6为接种量、初始pH以及培养温度之间的相互关系，由图6(a)可知，培养温度和接种量的相互作用中出现峰值，证明这两个因素对OTA的降解率的影响较大，其余两图则较为平缓。

2.2.2最佳产酶条件的预测及验证

经过响应面分析之后，得到最优结果为培养温度30℃、初始pH为8.0，接种量为108个。对此结果进行实验验证，经多次平行实验验证，液相检测OTA含量，最终得到，得到在此条件下，米曲霉菌株M30011降解OTA 96h后，降解率高达93％；与优化前米曲霉菌株在8天后降解率75％相比较而言，降解OTA的周期缩短了62.5％。