一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法

摘要

一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：尿液样品经离心、稀释后直接引入亲水作用色谱飞行时间质谱仪进行测定，经过峰对齐、校正和标准化、多变量统计分析和谱库检索可以找到喉癌志愿者和健康志愿者尿液中的差异代谢物。本发明为全新的尿液中差异代谢物的鉴定方法，是反相色谱飞行时间质谱差异代谢物研究方法的有效补充。

说明书

技术领域：

本发明属于尿液的理化检验技术领域，具体说是一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法。

背景技术：

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占全身恶性肿瘤的5%，近年来发病率呈升高趋势，且男性发病率高于女性，喉癌发病年龄多在40 岁以上，其中以60~70 岁发病率为最高，我国华北和东北地区的发病率远高于长江以南各省份。目前，预测喉部病变的金标准是喉镜加病理组织学评价，然而该方法具有创伤性且花费比较高。代谢组学技术可以发现新的生物标志物，基于反相色谱-飞行时间质谱对于非极性的化合物（比如脂类）、弱极性或中等极性的化合物（如氨基酸）类的物质具有很好的分离能力，但是反相色谱对于极性化合物（如糖、有机酸类物质）/离子型的化合物的保留能力很差，对于此类物质的分离的标准方法是亲水作用色谱，其往往采用一个高的有机相，通过调节有机相的比例或者通过加入挥发性的有机酸来实现对极性化合物分离的目的，Want等采用半乳糖胺处理后的小鼠尿液对亲水作用色谱飞行时间质谱与反相色谱-飞行时间质谱的方法进行了比较，发现基于亲水作用色谱飞行时间质谱的方法对极性代谢物和异型生物质代谢物的分离能力显著提高，如酸氧化戊二酸，尿肝等，这提高了代谢覆盖率和增加了发现生物标志物的可能性。目前，基于亲水作用色谱飞行时间质谱的方法用于喉癌尿液代谢组学的研究还未见报道。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的筛选喉癌志愿者和健康志愿者尿液中差异代谢物的亲水作用色谱飞行时间质谱方法，该方法能快速、准确鉴定尿液中的极性差异代谢物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，是以喉癌志愿者和健康志愿者尿液为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：

a、尿液在室温下解冻，然后在4 ºC以10000 g的速度离心10 min以去除颗粒物；

b、用移液枪移取100 µL的尿液样本，并加入200 µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测；

c、亲水作用色谱飞行时间质谱对所有尿液样本进行逐一分析，得原始数据；

d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物。

e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物。

f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对等方法进行验证，即为差异代谢物。

在c步骤中，所有的样品均采用phenomenex公司生产的Luna 3 µm HILIC 200 A（150 × 4.6 mm）的柱子进行分离分析，柱子温度为40 ºC，流动相A为5%的乙腈和95%的乙酸胺水溶液（最终乙酸胺的浓度为10 mmol/L），流动相B为95%的乙腈和5%的乙酸胺水溶液（最终乙酸胺的浓度为10 mmol/L），流动相流速为450 μL/min，梯度洗脱条件：0-15 min，99%B-60%B；15-15.5 min，60%B-60%B；15.5-16 min，60%B-99%B；并维持5 min，总分析时间为21 min，进样量为5 μL。

在c步骤中，飞行时间质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；ESI+模式下：喷雾电压为3500 V，干燥气为4 L/min (180℃)，雾化气为0.04 MPa，碰撞能量为7 eV，传输时间为100 µs。

本发明方法的稳定性和重复性：

从每个喉癌志愿者尿液样本和健康志愿者尿液样品取等量的尿液，混合均匀，即为质控（QC）样品，采用质控（QC）样品来评价仪器的稳定性和重复性以确保实验结果的可靠性，选取m/z分别为114.0667，235.1776，431.1388，515.0041和679.0082来评价仪器的稳定性和重复性，这五个内生性化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）见表1，均小于20%，说明系统的稳定性和重复性均符合要求。

表1 方法的稳定性和重复性

本发明的方法是一种新的喉癌尿液差异代谢物的发现方法，对亲水作用色谱飞行时间质谱的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。本发明方法具有如下优良效果：

① 与HPLC和LC-MS比较，液相色谱飞行时间质谱灵敏度更高。

②本方法前处理简便，不需要经过复杂的固相萃取过程，可以提高分析通量，具有快速及重复性好的优点。

附图说明

图 1. 典型的基峰色谱图，上图为健康志愿者，下图为喉癌志愿者；

图 2. 喉癌志愿者尿液样本和健康志愿者尿液样本的得分图，1为喉癌志愿者，2为健康志愿者。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

一种基于亲水作用色谱飞行时间质谱的喉癌尿液差异代谢物的测定筛选方法，其测试过程是尿液经离心、稀释后直接引入液相色谱飞行时间质谱进行分析。

实例1：

1．仪器与试剂：实验所使用的液相色谱仪为Dionex的UltiMate 3000，包括液相泵（HPG-3400 SD）、自动进样器（WPS-3000 SL）和柱温箱（TCC-3000 SD）。所有的样品均采用phenomenex公司生产的Luna 3 µm HILIC 200 A（150 × 4.6 mm）的柱子进行分离分析，柱子温度为40 ºC。

色谱级乙酸胺，纯度为98%，购买自TEDIA公司，乙腈，纯度为99.9%，购买自韩国德山药品工业株（DUKSAN PURE CHEMIVALS）；京尼平，纯度为98%，购买自SIGMA-ALORICH公司；购买自百灵威科技有限公司；实验用水均为去离子水。

2．样品处理：尿液在室温下解冻，尿液在4 ºC以10000 g的速度离心10 min以去除颗粒物，然后用移液枪移取100 µL的尿液样本，并加入200 µL的纯水，混合均匀，然后装入色谱瓶中待测。

3．测定方法：吸取离心、稀释后的样品5 µL，注入亲水作用色谱飞行时间质谱进行分离分析。

4. 原始数据转换为mzXML的格式以后，对数据进行峰识别、提取和保留时间校正，具体的参数设置为：质荷比（m/z）允许的误差为10 ppm，色谱峰的宽度为10-60 s，保留时候的步长设置为1 m/z。

5. 然后使用SIMCA-P 13.0 Demo软件对XCMS online提取的数据进行归一化，并进行主成份分析、偏最小二乘判别分析或正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），根据OPLS-DA的结果找到变化比较大的代谢物，然后利用SPSS 20.0进行T检验。

6. 根据VIP>1和P<0.05共发现了一百多个潜在的差异代谢物，然后利用飞行时间质谱仪在MRM或者AutoMSn模式下进行二级碎片扫描，在允许误差范围为10 ppm的条件下利用二级碎片进行谱库检索。

实例2：按实施例1所述的方法，选取37例喉癌志愿者和35例健康志愿者尿液样本，鉴定出其中的一个差异代谢物为京尼平。