抗S100P蛋白单克隆抗体及其用途

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.9575)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB24。本发明还涉及单克隆抗体UMAB24在制备用于检测S100P蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB24的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB24在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与S100P蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了S100P蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合S100P蛋白的单克隆抗体UMAB24、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

S100P是属于S100家族的一个小分子钙结合蛋白，因其最初在胎盘中发现而命名为S100P，具有S100钙结合蛋白家族中典型的两个EF手型结构，广泛参与了细胞增殖、细胞分化、细胞骨架构成、免疫反应以及细胞外基质分泌活动等过程。

S100P是一种小分子量的分泌蛋白，可在细胞核和细胞浆中表达，还可以分泌到细胞外。S100P最初以未活化状态合成，其后则由于钙离子结合等原因被激活成二聚体的活化状态，既能在胞内开展活动，也能在胞外充当细胞外信号分子。分泌出胞外的S100P能与RAGE的胞外配体结合部位结合，通过活化下游ERK/MAPK信号通路控制相关靶基因表达，调节细胞增殖；在细胞内的S100P蛋白可以与Ezrin蛋白结合，参与细胞骨架的重构而影响细胞粘附和运动，还可以与泛素化通路CacyBP/SIP蛋白结合参与β-catenin的降解，实现对肿瘤生存和转移的调控。不管是在胞内还是胞外，S100P都会通过影响肿瘤细胞的增殖、生存、行动力和侵袭力来影响肿瘤的恶性表现。

S100P在人的各种组织中的表达不一样，在胎盘组织中的表达最高，其次是食管组织，在胃、十二指肠、结直肠、前列腺以及白细胞内有中度的表达，但在空肠、回肠、卵巢、脾及胸腺中的表达较低。大量研究表明S100P在多种肿瘤组织中均有明显的高表达，例如膀胱移行细胞癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌等。S100P参与了细胞异常增生、细胞恶变、肿瘤细胞的运动性增强、浸润力增强等肿瘤发生和发展的病理过程，并与部分肿瘤的分期、预后及药物敏感性相关。随着近年来人们对其深入的认识及研究，认为S100P有潜在肿瘤标志物的价值，目前主要用于前列腺癌、膀胱癌等的辅助诊断。

目前临床上通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中S100P的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合S100P的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对S100P蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的S100P蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测S100P蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2014年8月22日，保藏编号为CGMCC No.9575。

本发明还提供了一种特异性结合S100P蛋白的单克隆抗体UMAB24，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据S100P ORF核苷酸序列(S100P ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，285bp；S100P氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建S100P重组表达质粒；

(2)S100P重组蛋白的表达与纯化：将S100P重组表达质粒转化HEK293T，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的S100P重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的S100P重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗S100P特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB24，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得S100P单克隆抗体。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

进一步采用OriGene高密度蛋白芯片对上述单克隆抗体的特异性进行验证：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

本发明将所述单克隆抗体UMAB24与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示：本发所述明单克隆抗体UMAB24特异性结合S100P蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体UMAB24在制备用于检测S100P蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB24，可检测组织细胞中S100P的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。

其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与S100P的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于非小细胞癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌或膀胱癌。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.9575)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB24。本发明还提供了单克隆抗体UMAB24在制备用于检测S100P蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB24的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB24在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与S100P蛋白特异性结合，而与芯片上其他近10000种其他蛋白无交叉反应，显著提高了S100P蛋白免疫检测的特异性和可靠性，广泛适用于用于各种肿瘤的标记。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB24的分类命名为：S100P鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2014年8月22日；

保藏编号：CGMCC No.9575。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为ORF区；

图2示实施例2S100P蛋白Western blot检测结果图，以anti-DDK检测S100P蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pCMV6-S100P质粒的HEK293T细胞裂解液抗原的检测结果；

图3示实施例2S100P蛋白SDS-PAGE结果图；

图4示实施例4膀胱癌组织免疫组化结果图(一抗为S100P单克隆抗体UMAB24)；

图5示实施例4人胎盘组织免疫组化结果图(一抗为S100P单克隆抗体UMAB24)；

图6示实施例5OriGene蛋白芯片鉴定结果图(一抗为S100P单抗UMAB24,1:100；二抗为Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，1:500)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、S100P重组表达质粒的构建

以Origene公司S100P的cDNA克隆质粒SC116407为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立S100P重组表达质粒RC201533。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、S100P重组蛋白的表达与纯化

1、转染HEK293T细胞：HEK293T细胞以1:3传至培养皿中继续培养；取7.5mLDMEM(无血清及抗生素)至50mL管中，加入300μLPEI MegaTran1.0混匀；加入75μg S100P重组质粒DNA至混匀液中，混匀并静置30分钟；分别取515μL至各培养皿中于37℃5％CO₂培养箱中培养。转染24小时后，每皿细胞添加25μL2M丁酸钠至终浓度5mM。

2、裂解细胞：转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入1mLPBS进行漂洗，吸去PBS。加入1mL裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4度离心，收集上清。

3、DDK亲和层析柱纯化：以0.45μM，33mm PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15mL管，加入混合好的Beads 1mL，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15mL管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图2；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads 3次，滴尽后用0.1M Glycine pH3.5洗脱，第一次200μL，滴尽不收集，第二、三次各500μL，第三次250μL，收集至一个1.5mL Tube中，并迅速加入NaH₂PO₄(pH＝11.0)中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，Tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的S100P蛋白用SDS-PAGE鉴定，见图3。

由图2结果可见，标签抗体anti-DDK能检测到转染pCMV6-S100P质粒的HEK293T细胞裂解液中S100P蛋白(R)，且条带单一特异，分子量大小与预期相符，表明S100P蛋白正确表达。

由图3结果可见，经过DDK亲和层析柱纯化，Glycine洗脱可得到高纯度的S100P蛋白。

实施例3、S100P单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的S100P蛋白片段用于对B6/C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的S100P抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用S100P纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB24。

4、细胞上清单抗的制备与纯化：将细胞株UMAB24用含15％血清的DMEM培养基培养于10cm培养皿中培养，扩培至约4×10⁷个时，800rpm离心5min，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基，使细胞密度约为3×10⁵个/ml。继续培养1～2周后，当细胞死亡率达到60％-70％时(此时细胞密度大概为1-2×10⁶个/ml)，收取细胞悬液6000rpm高速离心20min，取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体压型选择相应柱料，单抗UMAB24亚型为IgG1，采用protein>

实施例4、单克隆抗体UMAB24为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、分别取膀胱癌组织块和胎盘组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为4μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01M，pH6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入S100P单抗(UMAB24)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。

8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图4和5。

(2)、实验结果：

由图4结果可见，S100P蛋白在膀胱癌组织中有表达，但在正常膀胱组织中没有表达。由图5结果可见，S100P蛋白在胎盘组织中正常表达。表明单克隆抗体UMAB24能够识别膀胱癌组织、胎盘组织中的S100P蛋白。

实施例5、单克隆抗体UMAB24的特异性检测

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片进行UMAB24抗体鉴定实验的实验方法：

1、将一张蛋白芯片放在50mL离心管中，使用40mL去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟。弃掉去离子水，使用10mLPBST平衡芯片。室温处理10分钟。

2、向50mL离心管中加入40mL5％脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。

3、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释一抗UMAB24，稀释比列为1：100。

4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4℃环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。

6、第二天将芯片移至50mL离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。

7、使用封闭液(5％脱脂牛奶)稀释二抗Alexa 647-标记的驴抗鼠IgG，稀释比例为1：500。

8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育1小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。

9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。

10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。

11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。

12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。

13、根据BSA-Cy3以及BSA-Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。

14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。结果见图6。

图6结果显示，在蛋白芯片上仅有S100P蛋白与抗体UMAB24结合，表明本发明所述抗体UMAB24可与S100P蛋白特异性结合。