降血压肽和降血压蛋白质及其应用

摘要

本发明公开了几种降血压肽和降血压蛋白质及其应用；这些降血压肽的氨基酸序列分别为TTW、VHW和KAKW，降血压蛋白质的氨基酸序列含有TTW、VHW和KAKW的一种以上；上述的降血压肽和降血压蛋白质能够抑制血管紧张素转化酶的活性，从而起到降血压的作用，能够被用于制成各种降血压药品或保健品。

说明书

技术领域

本发明属于食品或药品技术领域，涉及降血压肽和降血压蛋白质及其应用。

背景技术

血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme，简称ACE)是一种能够导致血压升高的酶，其具有以下两种调控途径。

其一、血管紧张素转化酶能够切除血管紧张素I(AngiotensinI)末端的两个氨基酸(His-Leu)，从而将该血管紧张素I转化为血管紧张素II(AngiotensinII)。其中，血管紧张素I的氨基酸序列为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu，简称为DRVYIHPFHL。血管紧张素II的氨基酸序列为Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，简称为DRVYIHPF。血管紧张素II是一种血管收缩剂，其能够促进血管的收缩，从而使血压升高。

其二、血管紧张素转化酶能够切除舒缓激肽(Bradykinin)末端的两个氨基酸(Phe-Arg)，从而使其失活。其中，舒缓激肽的氨基酸序列为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg，失活的舒缓激肽的氨基酸序列为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro。舒缓激肽具有使血管扩张的功能，但舒缓激肽出于失活状态时，便失去了使血管扩张的能力，从而使血压升高。

ACE是一种金属肽酶，含有一个结合Zn²⁺的位点，这就是与底物结合的“必须结合位点(obligatory>2+结合位点是ACE催化反应的活性基团所在部位。各种ACE抑制物的共同作用是与ACE的Zn²⁺结合位点结合，使之失活。

若使血管紧张素转化酶失活，则血管紧张素转化酶就不能将血管紧张素I转化为血管紧张素II，血管就不会收缩；同时，血管紧张素转化酶也就不能使舒缓激肽失活，血管就会扩张。二者的综合作用就会使血压降低。因此，寻找能够使血管紧张素转化酶失活的多肽或蛋白质就成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的其中一个目的在于提供能够抑制血管紧张素转化酶的降血压肽。

本发明的另外一个目的在于提供上述降血压肽的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种降血压肽，其氨基酸序列为TTW，称为第一降血压肽。

一种降血压肽，其氨基酸序列为VHW，称为第二降血压肽。

一种降血压肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，称为第三降血压肽。

上述的任意一种降血压肽均可以用于作为血管紧张素转化酶抑制剂。

上述的任意一种降血压肽均可以用于制备降血压药物。

上述的任意一种降血压肽均可以用于制备降血压保健品。

一种降血压蛋白质，其含有TTW、VHW和如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一种以上。

上述的降血压蛋白质可以用于作为血管紧张素转化酶抑制剂。

上述的降血压蛋白质可以用于制备降血压药物。

上述的降血压蛋白质可以用于制备降血压保健品。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明的降血压肽是从天然食品的水解物中筛选得到的，对血管紧张素转化酶均具有明显的抑制活性，既能够单独用于制备降血压药物或降血压保健品，也能够与现有技术的降血压药物复配使用，以便取得更好的协同降血压效果。

附图说明

图1为本发明的第一降血压肽与血管紧张素转化酶活性中心的氢键形成示意图。

图2为本发明的第二降血压肽与血管紧张素转化酶活性中心的氢键形成示意图。

图3为本发明的第三降血压肽与血管紧张素转化酶活性中心的氢键形成示意图。

图4为降血压肽的降压效果图。

具体实施方式

本发明提供了多个降血压肽及其应用。

<第一降血压肽>

本发明提供了一种降血压肽，该降血压肽由三个氨基酸组成，其氨基酸序列为Thr-Thr-Trp，简称为TTW。为便于说明起见，以下统称第一降血压肽。本发明中的氨基酸均从N端到C段排列。

通过分子对接实验表明，第一降血压肽中的第一个T与血管紧张素转化酶(ACE)活性中心的Ala354形成3个氢键；该第一降血压肽中的第二个T分别与His353、Glu384和His513各形成一个氢键；该第一降血压肽中的W与Glu403形成一个氢键，故第一降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)一共形成7个氢键。这7个氢键的形成情况如图1所示。圆圈中的氨基酸代表ACE中的氨基酸序列，中间的链是降血压肽的序列在ACE中形成的构型。

这些氨基酸残基均为血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心中重要的氨基酸残基，对ACE的活性有重要的影响。当第一降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心的这些氨基酸残基形成氢键后，血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心就无法再结合血管紧张素，由此血管紧张素转化酶(ACE)便失活，因此，该第一降血压肽能够作为血管紧张素转化酶抑制剂。

<第一降血压肽的应用>

1、第一降血压肽可以用于制备降血压药物。

本发明的第一降血压肽可以单独作为降血压药物而使用，此时，第一降血压肽需与辅料配合使用以制成药品颗粒、胶囊、片剂(如糖衣片或薄膜衣片)、丸剂、口服液或注射剂等。

当第一降血压肽被制成药品颗粒而使用时，辅料可以为麦芽糊精和/或香兰素。

当第一降血压肽被制成糖衣片而使用时，辅料可以为淀粉和/或硬脂酸镁。

当第一降血压肽被制成口服液而使用时，辅料可以为苯甲酸钠、阿斯巴甜、安赛蜜、香精和纯化水。

当第一降血压肽被制成注射剂而使用时，辅料可以为甘露醇、磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。可以将该注射剂配置成0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液然后静脉滴注或肌肉注射。

本发明的第一降血压肽也可以与现有技术的降血压药物复配使用，以便取得更好的协同降血压效果。

现有技术的降血压药物包括β受体阻滞剂、钙拮抗剂、ACE抑制剂和利尿剂等。

其中，β受体阻滞剂选自奈必洛尔、普拉洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、塞利洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、比索洛尔。

钙拮抗剂选自硝苯地平、氨氯地平(包括左旋氨氯地平)、拉卡地平、非洛地平、尼伐地平、拉西地平、尼索地平。

ACE抑制剂选自阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、雷米普利、雷米普利拉、培哚普利、喹那普利、螺普利、替莫普利、群多普利。

利尿剂选自氢氯噻嗪、三氯噻嗪。

2、第一降血压肽可以用于制备降血压保健品。

本发明的第一降血压肽加上辅料即可制成降血压保健品，辅料可以包括：淀粉、明胶、钛白粉、乳清蛋白、蔗糖、维生素E、谷胱甘肽、精氨酸、瓜氨酸、膳食纤维、胶原蛋白、脑磷脂、纤维素、葡萄糖、木糖、蜂蜜、卵磷脂、胡萝卡素、维生素B1、维生素B2、维生素C、铁、钙、蜂花粉、黑木耳粉(200-500目)、香菇粉(300-500目)、灵芝粉(300-500目)、魔芋粉(300-500目)、黄芪粉(200-500目)、枸杞粉(200-500目)和人参粉(500-1000目)等中的任意一种或几种。

<第二降血压肽>

本发明提供了一种降血压肽，该降血压肽由三个氨基酸组成，其氨基酸序列为Val-His-Trp，简称为VHW。为便于说明起见，以下统称第二降血压肽。

通过分子对接实验表明，第二降血压肽中的V与血管紧张素转化酶(ACE)活性中心的Glu411形成2个氢键；该第二条降血压肽中的H与Ala354、His353、Glu384各形成一个氢键；该第二条降血压肽中的W与Tyr520形成一个氢键，故第二降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)一共形成7个氢键。这7个氢键的形成情况如图2所示。

这些氨基酸残基也为血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心中重要的氨基酸残基，，对ACE的活性有重要的影响。当第二降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心的这些氨基酸残基形成氢键后，血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心就无法再结合血管紧张素，由此血管紧张素转化酶(ACE)便失活，因此，该第二降血压肽也能作为血管紧张素转化酶抑制剂。

<第二降血压肽的应用>

1、第二降血压肽可以用于制备降血压药物。

2、第二降血压肽可以用于制备降血压保健品。

其中，在使用第二降血压肽制备降血压药物或降血压保健品时，能够与该第二降血压肽搭配使用的辅料可以参考第一降血压肽。

<第三降血压肽>

本发明提供了一种降血压肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。为便于说明起见，以下统称第三降血压肽。该第三降血压肽由四个氨基酸组成，其氨基酸序列为Lys-Ala-Lys-Trp，简称为KAKW。

通过分子对接表明，第三降血压肽中的第一个K与ACE活性中心的Ala356形成了两个氢键和与Glu411形成了一个氢键；该第三条降血压肽中的W与Gln281形成了2个氢键，与Tyr520、Asp415各形成了一个氢键；该第三降血压肽中的第二个K与His353、、Lys511各形成一个氢键，故第三降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)一共形成9个氢键。这9个氢键的形成情况如图3所示。这些氨基酸残基均为血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心中重要的氨基酸残基，对ACE的活性有重要的影响。当第三降血压肽与血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心的这些氨基酸残基形成氢键后，血管紧张素转化酶(ACE)的活性中心就无法再结合血管紧张素，由此血管紧张素转化酶(ACE)便失活，因此，该第三降血压肽能够作为血管紧张素转化酶抑制剂。

<第三降血压肽的应用>

1、第三降血压肽可以用于制备降血压药物。

2、第三降血压肽可以用于制备降血压保健品。

其中，在使用第三降血压肽制备降血压药物或降血压保健品时，能够与该第三降血压肽搭配使用的辅料可以参考第一降血压肽。

<降血压蛋白质>

一种降血压蛋白质，其特征在于：其含有TTW、VHW和如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的一种以上。

上述的多肽和蛋白质均可以通过人工方法合成，故对其合成方法不再赘述。

<降血压蛋白质的应用>

1、降血压蛋白质可以用于制备降血压药物。

2、降血压蛋白质可以用于制备降血压保健品。

在使用降血压蛋白质制备降血压药物或降血压保健品时，能够与该降血压蛋白质搭配使用的辅料可以参考第一降血压肽。

以下结合实验对各种降血压肽等的降血压活性进行说明。

<实验1：各种降血压肽对血管紧张素转化酶的体外抑制实验>

本发明的各种降血压肽均属于与血管紧张素转化酶的活性区域的亲和力较强的竞争性抑制剂，其与该活性区域的亲和力高于血管紧张素I或者舒缓激肽，并且一旦结合也不容易从结合区域释放，从而能够降低血管紧张素转化酶的活性区域的活性，甚至使其失活，从而阻碍血管紧张素转化酶将血管紧张素I转化为血管紧张素II，并且阻碍血管紧张素转化酶失活舒缓激肽，进而起到降低血压的作用。以下通过实验验证各种降血压肽对血管紧张素转化酶的抑制能力。

本实验的测定原理如下：

马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，简称HHL)能够作为血管紧张素转化酶(ACE)的底物，并且被水解为马尿酸和His-Leu。抑制剂可以抑制血管紧张素转化酶催化水解马尿酰组氨酰亮氨酸的能力，使产物中的马尿酸的含量降低，因此，可以通过检测产物中马尿酸的含量来计算出抑制剂对血管紧张素转化酶的抑制率。

本实验的测定步骤如下：

(1)、取多个EP管作为反应容器，对照组的EP管加入20μL去离子水，实验组的EP管加入20μL不同浓度的待测样品；

(2)、向各个EP管中加入80μL5M的马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)，于37℃下水浴5min；

(3)、向各个EP管中加入10μL 310mU/mL的血管紧张素转化酶(ACE)，于37℃下水浴5min，启动反应；

(4)、待反应进行完全时，向各个EP管中加入400μL l M的HCL终止反应；

(5)、将各个EP管中的反应液分别用0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的液体保存于相对应的液相小瓶中；

(6)、对各个液相小瓶内的液体进行高效液相色谱检测，检测条件为：色谱柱：Thermo BDSHYPERSIL C18(250mm×3mm×5μm)；柱温：30℃；流速：0.8mL/min；检测波长：228nm；进样量：10μL；流动相A：超纯水(0.1％三氟乙酸TFA)；流动相B：乙腈；洗脱条件如表1所示。

表1高效液相色谱洗脱条件

(7)、各个待测样品对血管紧张素转化酶的抑制率的计算方法如下：

X＝(A_对照-A)/A_对照

式中：X——ACE抑制率(％)；

A_对照——对照组的峰面积；

A——实验组的峰面积。

(8)、待测样品的IC₅₀的计算：

以待测样品的浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标作图，得到抑制率-样品浓度关系曲线，通过该曲线得到抑制率达到50％时的待测样品的浓度，即为该待测样品的IC₅₀。

其中，待测样品为含有第一降血压肽、第二降血压肽、第三降血压肽或降血压蛋白质的样品。

经检测得知，待测样品的IC₅₀如表2所示。

表2待测样品的IC₅₀

降血压肽IC₅₀(μM)第一降血压肽(TTW)0.61第二降血压肽(VHW)0.91第三降血压肽(KAKW)2.02

检测结果表明三条降血压肽在体外抑制血管紧张素转化酶实验中，具有明显的抑制血管紧张素转化酶的效果，其抑制效果接近治疗高血压的经典药物赖诺普利的体外抑制效果(IC₅₀＝0.0214μM)。

<实验2：各种降血压肽对血管紧张素转化酶的体内抑制实验>

本实验主要验证各种降血压肽对高血压大鼠的血压的影响，其包括如下步骤：

(1)、获取自发性高血压大鼠(SHRs，10周大小，雄性，体重250–320g)，血压超过180mmHg，购自上海斯莱克动物实验公司；

(2)、高血压大鼠6只一组饲养，在22±2℃的温度下12小时循环光照，供给食物和饮水；

(3)、将不同的降血压肽溶解在生理盐水中，实验组按照每只高血压大鼠3μmol/Kg的量计算，生理盐水按照1ml/100g大鼠体重的量进行灌胃，对照组以相同剂量的生理盐水进行灌胃同时喂食降血压药赖诺普利；

(4)、灌胃后，分别测量这些高血压大鼠在0h、1h、2h、4h、6h和8h的血压。所有的结果都进行了三次重复测量。

结果如图4所示。从图4中可以看出，三条降血压肽相较于空白实验组(control)，血压都有明显下降，说明其在体内有降血压效果，同时与赖诺普利组相比，三条降血压肽组的降血压效果在前期可以认为是要比赖诺普利效果要好的。

综上所述，降血压肽不仅具有较好的体外降血压活性，在经过胃肠道的消化吸收之后同仍然具有良好的体内活性，其降血压功能并未丧失。

以下结合各个实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：降血压药品片剂

本实施例的降血压药品片剂含有5wt％的降血压肽和95wt％的辅料。降血压肽为第一降血压肽，辅料为淀粉和硬脂酸镁。

实际上，降血压肽也可以为第二降血压肽、第三降血压肽和降血压蛋白质中的任意一种或几种。辅料可以为淀粉、蔗糖、麦芽糊精中的任意一种或几种。降血压肽的含量可以为1-20wt％并且辅料的含量可以为80wt-99wt％。

实施例2：降血压保健品

本实施例的降血压药品片剂含有15wt％的降血压肽和85wt％的辅料。降血压肽为第三降血压肽，辅料为淀粉、蜂蜜、膳食纤维、精氨酸、谷胱甘肽。

其中，降血压肽也可以为第一降血压肽、第二降血压肽和降血压蛋白质中的任意一种或几种。降血压肽的含量可以为1-20wt％并且辅料的含量可以为80wt-99wt％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。